引用本文： 馮世明, 胡繼仲, 劉威, 李立. 組織工程化膽管研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(11): 1504-1509. doi: 10.7507/1007-9424.202101053 復制
組織工程化膽管可以替代臨床上醫源性膽管損傷、膽管的離斷傷、電灼傷、肝移植等[1-2]原因導致的肝外膽管狹窄以及一些先天性膽管疾病的肝外膽管（extrahepatic bile duct，EHBD），此法可以避免傳統膽腸吻合治療所帶來的 Oddi’s 括約肌功能損害，術后發生膽汁漏、膽管阻塞、膽管感染甚至膽汁性肝硬化等并發癥的風險極大降低，也為患者減輕了經濟負擔[3-8]。膽道并發癥作為死亡供體肝移植術后移植物失敗的主要原因，也給膽道損傷的治療提出了更迫切的要求[9-10]。組織工程化管狀系統的發展給肝外膽道損傷疾病及肝移植術后膽道良性狹窄的治療帶來了新的治療方式[11]。針對組織工程化膽管的研究主要集中在支架材料、種子細胞及兩者的復合培養上[12]。近來，眾多研究者指出，通過自體或干細胞再細胞化的脫細胞異體細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是最有前途的支架材料[13]。由于來自動物的異種組織可能具有殘留的免疫原性，并可能受到生物制劑的污染，故而人異基因組織是獲得適合于再細胞化和植入的 ECM 的理想材料。針對膽管 ECM 的國內外研究包括臍靜脈脫細胞基質[1]、輸尿管脫細胞基質[14]、人胎盤絨毛膜脫細胞血管基質[15-16]、脫細胞胰腺基質[17]等。組織工程化膽管的研究較組織工程化血管落后，主要原因是膽道特殊的生理環境要求支架材料具有較強的抗腐蝕性、具有一定的拉力，同時也要求種子細胞能耐受高堿性環境。性能優越的組織工程膽管支架需要有利于細胞的增殖、黏附和遷移，同時它還需要促進血管生成。管狀組織工程的發展是一個具有挑戰性的研究領域，旨在提供組織替代品，此外也為藥物和醫療設備的測試提供體外模型，甚至用于研究疾病的生理和病理過程[18]。現將組織工程化膽管的發展現狀作一綜述，旨在給臨床及科研人員提供新的治療方案及科研思路。
1 膽管的體內修復
目前膽管的缺損及離斷損傷修復模型的構建主要集中在兔、狗、豬等實驗動物，相關的研究主要集中在支架材料的制備、種子細胞的獲取、種子細胞在支架材料上的生物相容性及支架在動物模型中的應用效果上。
1.1 支架材料
國內外關于支架材料的研究包括不可吸收材料、可降解材料、復合材料等。其中，復合材料是當下研究的熱點。
1.1.1 不可吸收材料
在人工膽管研究初期，包括滌綸、各種合金、聚四氟乙烯等聚合物在內的不可吸收材料的應用較為廣泛[12]。在不可吸收材料的研究領域，2011 年 Schanaider 團隊[19]對 10 只膽道梗阻的狗使用膨脹聚四氟乙烯補片治療，結果在 6 只狗中發現補片作為游離腔異物部分黏附于膽總管，提示了聚四氟乙烯的使用應該慎重。2017 年，Tal 等[20]通過一項多中心隨機試驗，比較了 48 例被確診為原位肝移植術后吻合口膽管狹窄（anastomotic biliary stricture，ABS）患者使用塑料和金屬支架的不同效果，發現有 10 例（20.8%）患者在中位隨訪 500 d 后（范圍 48～1 317 d）出現狹窄復發。這不僅給患者增加了經濟負擔，也提示了不可吸收材料在組織工程化膽管領域的發展中具有局限性。
1.1.2 可降解高分子合成材料
常用的可降解高分子合成材料有聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚己內酯（PCL）等各種聚合物[12]。同時，研究者也在不斷地開發各種新型材料。2016 年馬利鋒等[21]對 15 只巴馬小型豬采用團隊新制備的聚癸二酸丙二醇聚酯支架聯合大網膜進行膽道損傷修復，術后的修復效果優于單純的對膽道進行間斷縫合（對照組），術后 6 個月可見 α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）明顯較對照組減少，說明他們制備的新型生物可降解支架材料具有良好的生物特性，應用于膽道損傷中可以獲得理想的修復效果，但是由于膽道的瘢痕形成及由于瘢痕導致的膽道狹窄及梗阻最常發生于術后的 12～18 個月，所以該種材料的修復效果還有待進一步的深入研究。
1.1.3 脫細胞的 ECM
在脫細胞方案標準化后，大多數的研究表明，脫細胞 ECM 支架可以為不同類型的種子細胞生長提供一個最佳的平臺，通過對該平臺再細胞化處理后、開發完全個性化的臨床方法成為研究熱點[13]。針對膽管替代 ECM 材料的國內外研究包括臍靜脈脫細胞基質、輸尿管脫細胞基質、人胎盤絨毛膜無細胞血管基質等[14, 22-23]。
2016 年，Struecker 等[3]使用自體膽管細胞再細胞化的同種異體血管脫細胞基質構建的新膽管，植入 5 頭家豬體內，14 d 后處死實驗動物。所有豬都在整個研究期間存活，血液檢查及磁共振結果未見嚴重并發癥；組織學檢查發現中性粒細胞侵入新膽管，并在植入組織周圍和內部觀察到新血管生成。2019 年，Liu 等[24]使用異體膽管上皮細胞再細胞化的異種脫細胞動脈基質修復滇南小耳豬肝外膽道缺損模型，取得了良好的效果，實驗組動物可長期存活達 8 周；在術后 1、2、4 和 8 周通過磁共振膽道成像、肝功能檢測、血常規檢測、HE 染色、免疫熒光、蛋白質印跡（Western Blot）等方法初步評價了再細胞化人源脫細胞動脈基質修復豬膽總管節段性缺損的可行性。
1.1.4 復合材料
復合材料是當下研究的熱點，各種支架材料均可以經過浸涂、電鍍、疊層組裝、水解、等離子處理、電子束輻射、接枝共聚合、界面聚合等表層修飾方法獲得一定的表面改性，進而增加細胞在材料上的黏附及增殖效果[25-27]。2018 年，Khorramirouz 等[28]考慮到支架材料在體內可能發生形變而影響效果，通過大鼠皮下植入手術證明了與傳統方法相比，由 PCL 纖維組成的支架是一種有效的支撐結構，可以有效地保持支架的位置，防止降解，減少炎癥。這提示復合材料可能更加適用于于組織工程化膽管的構建。
2020 年 Park 等[29]使用涂覆有銀納米顆粒（silver nanoparticles，AgNPs）的自膨脹金屬支架（SEMS）對 24 只兔進行膽管重建，通過膽道造影、大體觀察、Masson 染色等方法證明了覆有 AgNPs 涂層的金屬支架網可以顯著抑制支架誘導的組織增生和兔膽管內膽汁淤積物的形成。而 Yan 等[30]為了增強 3D 打印支架內的生物反應特性，開發了一種添加肽兩親物（peptides amphiphiles，PAs）的 3D 可印刷巰基化明膠生物，以定制其生物活性和納米結構，從而增強細胞與支架材料的生物相容性。他們證明了通過在含有膽管細胞的 3D 打印生物油墨中使用基于層黏連蛋白 A 鏈肽 I-5-V（ile-lys-val-ala-val，IKVAV）的 PAs 系統，可以刺激膽管細胞形成功能性管狀結構。總之，材料學的發展會極大地促進組織工程化膽管的發展。
1.2 種子細胞
膽道完全接受肝動脈單一供血，加上膽管上皮細胞具有高耗氧、高代謝、低缺氧耐受的特性，膽管上皮細胞損傷后更加難以恢復，不僅給各種膽道損傷的治療帶來困擾，也給組織工程化膽管中種子細胞的選取帶來不便[10, 31-32]。近年來，隨著干細胞技術的發展，種子細胞的選擇又增加了一種途徑[25, 33]。有大量的研究者已經通過干細胞的定向誘導分化得到了膽管上皮細胞，例如，Cardinale 等[34]和 Carpino 等[35]團隊成功將膽管來源的干細胞在體外誘導分化為膽管上皮細胞。隨后，Zhou 等[36]利用類似方法將豬骨髓間充質干細胞（BMSCs）成功誘導分化為膽管上皮樣細胞。筆者所在團隊在李立教授的帶領下，在滇南小耳豬及大鼠[37]肝卵圓細胞（HOC）的定向誘導分化中也取得了良好的效果，團隊采用表皮生長因子（EGF）、干細胞生長因子（SCF）、白血病抑制因子（LIF）等細胞因子聯合定向誘導 HOC 定向分化為表達膽管上皮細胞特異標志物的細胞，表明經定向誘導分化后的 HOC 亦可作為組織工程化膽管的種子細胞。2019 年 Wu等[38]報道了一種在體外使用混合培養基將人類多能干細胞（PSCs）分化為具有膽囊和膽管的肝組織的方法，該方法分為 3 個階段、共 45 d。這一發現不僅為體外研究人類肝膽疾病的分子基礎提供了一個強有力的方法，而且為組織工程化膽管的建立提供了新的方向。不同來源的膽管上皮細胞的優劣見表 1。
表1
不同來源膽管上皮細胞的優劣
1.3 細胞和材料的復合及體內修復
膽管的生理位置及功能要求組織工程化膽管不僅具有引流功能，還能夠耐受膽汁的浸泡，這就要求支架材料在植入前最好就在表面形成覆膜，這給種子細胞與材料的相容性提出了更高的要求[12, 25]。
2015 年，楊揚等[39]將來源于豬的 BMSCs 定向誘導分化為膽管內皮細胞，并證實了其與聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）納米纖維具有良好的生物相容性。2017 年 Zong 等[40]利用新型雙層聚合物支架結合人骨髓間充質干細胞（hMSCs）用于膽道疾病的治療，他們首先通過體外實驗證實 PCL/PLGA 支架與 hMSCs 具有生物相容性，證明了新型支架能夠支持 hMSCs 的黏附、增殖和基質沉積，并制備了 hMSCs-PCL/PLGA 構建體（MPPCs）；然后通過大體觀察和組織學方法評估了 MPPCs 在 18 只豬中的體內膽管修復效果，結果所有實驗動物均無膽管狹窄和膽汁淤積的跡象，且發現該支架不僅能支撐膽道，允許膽汁自由流動，而且對損傷膽管的修復具有直接或間接的積極作用；移植后 4 周通過冰凍切片、并使用共聚焦顯微鏡進行體內細胞追蹤，可見移植后豬模型中的人類細胞仍然存活，在 12 周后人類細胞消失；6 個月時，與空白 PCL/PLGA 支架相比，MPPCs 對膽管損傷具有更好的再灌注效果。該結果說明 hMSCs 在膽道的修復過程中可能起到了一定的過渡作用，在宿主細胞未移行至覆蓋支架前對支架具有一定的保護作用。2019 年，Liu 等[24]在異種脫細胞動脈基質修復滇南小耳豬肝外膽道缺損的研究中到了類似的效果：在免疫熒光檢測中可見移植 8 周后術前植入的綠色熒光蛋白 GFP+ 的膽管細胞仍然存活，這也提示了移植前植入的膽管上皮細胞形成了被覆上皮，可以成功地抵抗膽汁入侵，保護無細胞動脈基質，直至新生膽管形成。
2019 年，Chen 等[41]在工程化大鼠肝移植后肝內膽管再生的研究中，在灌注條件下對移植物再細胞化，通過組織學分析發現膽道上皮細胞形成了管狀結構，存活的肝細胞團駐留在實質間隙，其排列方式與天然組織高度相似。這一發現不僅證明了在脫細胞大鼠肝臟中重建膽管的可行性，也給 EHBD 支架表層覆膜的構建提供了新的思路。
2 體外膽管平臺
體外膽管平臺的建立可以彌補傳統二維細胞培養和動物實驗的不足，可以動態操控和實時觀察重要的生理病理過程，提高疾病的研究水平和藥物的研發效率。近年來，組織工程化膽管的體外平臺建設取得一些階段性的成果，特別是 3D 打印技術的普遍應用也助力了膽管體外測試平臺的進展。在生物材料領域中，關于 3D 打印的研究[42]表明，利用生物相容性打印角化細胞、成纖維細胞和干細胞是可能的。雖然重塑組織或器官的結構完整性和功能尚未實現，但是 3D 打印制備的組織工程化的管狀組織可以作為體外測試平臺，用于藥物測試和管狀組織的功能測定（包括力學、生物學等功能的測定），以及用于建立腫瘤模型。2019 年 Tysoe 等[43]開發了一種適用于膽管重建的生物工程化膽管組織的生成方案，他們在人源膽總管上分離膽管細胞，2 周內即可衍生出表達關鍵膽汁標志物并保留原代肝外或肝內膽管細胞功能的膽管細胞器官樣細胞（COs）。COs 對應于成熟的功能性膽管細胞，為膽管生理學和病理生理學的研究提供了一個獨特的平臺，由此產生的生物工程組織在再生醫學和膽管疾病方面有著廣泛的應用。2020 年，Li 等[44]采用三維打印技術制備了 PCL/明膠/PCL 復合支架，作為 COs 增殖、遷移和分化的基質；其具有良好的力學性能，壓縮模量可達 17.41 kPa，楊氏模量可達 5.03 kPa，能夠滿足植入體內的相關要求，亦可用于未來仿生人工膽管的構建。Thomas 等[45]通過計算機輔助設計（CAD）生成 EHBD 模型，并評估了福拉思彈性樹脂、柔性樹脂和耐久樹脂 3 種材料在37 ℃ 下浸泡于水、PBS 或膽汁酸溶液中 1 周后的機械性能變化，最終建立了精確的 EHBD 模型，其有助于更真實的膽道支架原型臨床前體外測試。已有大量研究證明，在生物反應器系統中培養的 3D 多孔支架上干細胞的擴增有利于在組織工程策略中維持原始細胞功能，但這也使獲取祖細胞群成為一項挑戰[46]。Du 等[47]報道了一種具有功能的膽管芯片，作為一個體外平臺，這種膽管芯片在結構和器官功能上具有膽管的基本特征，可利用各種來源的膽管細胞對膽管的病理生理學進行研究。
2018 年，在組織工程化血管領域，Loy 等[18]報道了一種新穎的具有成本效益的管狀多層組織培養系統（TMCS），其利用纖維素化膠原凝膠作為支架，采用簡單的成型技術和旋轉系統上的內皮化步驟，在 48 h 內輕松制備出細胞結構精細的三層動脈壁模型。該方法在未來亦可在組織工程化膽管的體外測試平臺建立中加以應用。
總之，組織工程化膽管的體外測試平臺的發展給臨床及動物模型的研究帶來了極大的便利，推動著管狀組織工程的進步（圖 1）。
圖1
示體外膽管測試平臺的應用
3 小結
組織工程化膽管在過去的幾十年中得到了較為廣泛的研究，但在臨床上的研究還較為落后。一方面是因為隨著膽腸吻合技術的標準化，臨床上的大部分醫源性膽道損傷可以通過此術式或簡單的吻合在一定程度上得以重建；另一方面是因為，目前的組織工程化的膽管解決不了移植物在體內的快速血管化過程，這就限制了其在臨床上的應用價值。雖然 Struecker 團隊[3]及李立團隊[24]在動物模型中，分別于術后 2 周及 8 周都檢測到了移植物上有膽管上皮細胞的覆蓋，且經磁共振胰膽管成像（magnetic resonance cholangiopancreatography，MRCP）證實了膽道的通暢；但是考慮到移植物的血管重建進程及膽管上皮細胞不耐受缺血缺氧的特性，在移植部位檢測到的膽管上皮細胞的來源尚有待商榷，相應的組織工程化膽管發揮的究竟是過渡還是替代作用尚未有明確的結論。在膽道吻合手術后 6～18 個月吻合部位的瘢痕形成問題也缺乏有力的研究，組織工程化膽管是否能長期替代天然膽管仍需科研工作者進行更長時間、更深層次的研究。體外膽管測試平臺的發展僅僅對組織工程化膽管生物學、力學等特性的研究提供了便利，給動物實驗提供一定的指導，但并不能代替動物實驗。組織工程化膽管的血管形成問題仍在極大程度上限制著其臨床應用，但是隨著材料學、表面改性技術、細胞學和 3D 打印技術的發展，包括血管內皮生長因子的使用，以及支架上聯合培養周細胞、內皮細胞等方法的使用[48]，組織工程化膽管材料的性能會更加全面、優越，在未來組織工程化膽管的發展會更加迅速。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：馮世明負責文章撰寫；李立負責文章內容的審閱及提出意見；胡繼仲及劉威負責文獻的補充查閱。
組織工程化膽管可以替代臨床上醫源性膽管損傷、膽管的離斷傷、電灼傷、肝移植等[1-2]原因導致的肝外膽管狹窄以及一些先天性膽管疾病的肝外膽管（extrahepatic bile duct，EHBD），此法可以避免傳統膽腸吻合治療所帶來的 Oddi’s 括約肌功能損害，術后發生膽汁漏、膽管阻塞、膽管感染甚至膽汁性肝硬化等并發癥的風險極大降低，也為患者減輕了經濟負擔[3-8]。膽道并發癥作為死亡供體肝移植術后移植物失敗的主要原因，也給膽道損傷的治療提出了更迫切的要求[9-10]。組織工程化管狀系統的發展給肝外膽道損傷疾病及肝移植術后膽道良性狹窄的治療帶來了新的治療方式[11]。針對組織工程化膽管的研究主要集中在支架材料、種子細胞及兩者的復合培養上[12]。近來，眾多研究者指出，通過自體或干細胞再細胞化的脫細胞異體細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是最有前途的支架材料[13]。由于來自動物的異種組織可能具有殘留的免疫原性，并可能受到生物制劑的污染，故而人異基因組織是獲得適合于再細胞化和植入的 ECM 的理想材料。針對膽管 ECM 的國內外研究包括臍靜脈脫細胞基質[1]、輸尿管脫細胞基質[14]、人胎盤絨毛膜脫細胞血管基質[15-16]、脫細胞胰腺基質[17]等。組織工程化膽管的研究較組織工程化血管落后，主要原因是膽道特殊的生理環境要求支架材料具有較強的抗腐蝕性、具有一定的拉力，同時也要求種子細胞能耐受高堿性環境。性能優越的組織工程膽管支架需要有利于細胞的增殖、黏附和遷移，同時它還需要促進血管生成。管狀組織工程的發展是一個具有挑戰性的研究領域，旨在提供組織替代品，此外也為藥物和醫療設備的測試提供體外模型，甚至用于研究疾病的生理和病理過程[18]。現將組織工程化膽管的發展現狀作一綜述，旨在給臨床及科研人員提供新的治療方案及科研思路。
1 膽管的體內修復
目前膽管的缺損及離斷損傷修復模型的構建主要集中在兔、狗、豬等實驗動物，相關的研究主要集中在支架材料的制備、種子細胞的獲取、種子細胞在支架材料上的生物相容性及支架在動物模型中的應用效果上。
1.1 支架材料
國內外關于支架材料的研究包括不可吸收材料、可降解材料、復合材料等。其中，復合材料是當下研究的熱點。
1.1.1 不可吸收材料
在人工膽管研究初期，包括滌綸、各種合金、聚四氟乙烯等聚合物在內的不可吸收材料的應用較為廣泛[12]。在不可吸收材料的研究領域，2011 年 Schanaider 團隊[19]對 10 只膽道梗阻的狗使用膨脹聚四氟乙烯補片治療，結果在 6 只狗中發現補片作為游離腔異物部分黏附于膽總管，提示了聚四氟乙烯的使用應該慎重。2017 年，Tal 等[20]通過一項多中心隨機試驗，比較了 48 例被確診為原位肝移植術后吻合口膽管狹窄（anastomotic biliary stricture，ABS）患者使用塑料和金屬支架的不同效果，發現有 10 例（20.8%）患者在中位隨訪 500 d 后（范圍 48～1 317 d）出現狹窄復發。這不僅給患者增加了經濟負擔，也提示了不可吸收材料在組織工程化膽管領域的發展中具有局限性。
1.1.2 可降解高分子合成材料
常用的可降解高分子合成材料有聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚己內酯（PCL）等各種聚合物[12]。同時，研究者也在不斷地開發各種新型材料。2016 年馬利鋒等[21]對 15 只巴馬小型豬采用團隊新制備的聚癸二酸丙二醇聚酯支架聯合大網膜進行膽道損傷修復，術后的修復效果優于單純的對膽道進行間斷縫合（對照組），術后 6 個月可見 α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）明顯較對照組減少，說明他們制備的新型生物可降解支架材料具有良好的生物特性，應用于膽道損傷中可以獲得理想的修復效果，但是由于膽道的瘢痕形成及由于瘢痕導致的膽道狹窄及梗阻最常發生于術后的 12～18 個月，所以該種材料的修復效果還有待進一步的深入研究。
1.1.3 脫細胞的 ECM
在脫細胞方案標準化后，大多數的研究表明，脫細胞 ECM 支架可以為不同類型的種子細胞生長提供一個最佳的平臺，通過對該平臺再細胞化處理后、開發完全個性化的臨床方法成為研究熱點[13]。針對膽管替代 ECM 材料的國內外研究包括臍靜脈脫細胞基質、輸尿管脫細胞基質、人胎盤絨毛膜無細胞血管基質等[14, 22-23]。
2016 年，Struecker 等[3]使用自體膽管細胞再細胞化的同種異體血管脫細胞基質構建的新膽管，植入 5 頭家豬體內，14 d 后處死實驗動物。所有豬都在整個研究期間存活，血液檢查及磁共振結果未見嚴重并發癥；組織學檢查發現中性粒細胞侵入新膽管，并在植入組織周圍和內部觀察到新血管生成。2019 年，Liu 等[24]使用異體膽管上皮細胞再細胞化的異種脫細胞動脈基質修復滇南小耳豬肝外膽道缺損模型，取得了良好的效果，實驗組動物可長期存活達 8 周；在術后 1、2、4 和 8 周通過磁共振膽道成像、肝功能檢測、血常規檢測、HE 染色、免疫熒光、蛋白質印跡（Western Blot）等方法初步評價了再細胞化人源脫細胞動脈基質修復豬膽總管節段性缺損的可行性。
1.1.4 復合材料
復合材料是當下研究的熱點，各種支架材料均可以經過浸涂、電鍍、疊層組裝、水解、等離子處理、電子束輻射、接枝共聚合、界面聚合等表層修飾方法獲得一定的表面改性，進而增加細胞在材料上的黏附及增殖效果[25-27]。2018 年，Khorramirouz 等[28]考慮到支架材料在體內可能發生形變而影響效果，通過大鼠皮下植入手術證明了與傳統方法相比，由 PCL 纖維組成的支架是一種有效的支撐結構，可以有效地保持支架的位置，防止降解，減少炎癥。這提示復合材料可能更加適用于于組織工程化膽管的構建。
2020 年 Park 等[29]使用涂覆有銀納米顆粒（silver nanoparticles，AgNPs）的自膨脹金屬支架（SEMS）對 24 只兔進行膽管重建，通過膽道造影、大體觀察、Masson 染色等方法證明了覆有 AgNPs 涂層的金屬支架網可以顯著抑制支架誘導的組織增生和兔膽管內膽汁淤積物的形成。而 Yan 等[30]為了增強 3D 打印支架內的生物反應特性，開發了一種添加肽兩親物（peptides amphiphiles，PAs）的 3D 可印刷巰基化明膠生物，以定制其生物活性和納米結構，從而增強細胞與支架材料的生物相容性。他們證明了通過在含有膽管細胞的 3D 打印生物油墨中使用基于層黏連蛋白 A 鏈肽 I-5-V（ile-lys-val-ala-val，IKVAV）的 PAs 系統，可以刺激膽管細胞形成功能性管狀結構。總之，材料學的發展會極大地促進組織工程化膽管的發展。
1.2 種子細胞
膽道完全接受肝動脈單一供血，加上膽管上皮細胞具有高耗氧、高代謝、低缺氧耐受的特性，膽管上皮細胞損傷后更加難以恢復，不僅給各種膽道損傷的治療帶來困擾，也給組織工程化膽管中種子細胞的選取帶來不便[10, 31-32]。近年來，隨著干細胞技術的發展，種子細胞的選擇又增加了一種途徑[25, 33]。有大量的研究者已經通過干細胞的定向誘導分化得到了膽管上皮細胞，例如，Cardinale 等[34]和 Carpino 等[35]團隊成功將膽管來源的干細胞在體外誘導分化為膽管上皮細胞。隨后，Zhou 等[36]利用類似方法將豬骨髓間充質干細胞（BMSCs）成功誘導分化為膽管上皮樣細胞。筆者所在團隊在李立教授的帶領下，在滇南小耳豬及大鼠[37]肝卵圓細胞（HOC）的定向誘導分化中也取得了良好的效果，團隊采用表皮生長因子（EGF）、干細胞生長因子（SCF）、白血病抑制因子（LIF）等細胞因子聯合定向誘導 HOC 定向分化為表達膽管上皮細胞特異標志物的細胞，表明經定向誘導分化后的 HOC 亦可作為組織工程化膽管的種子細胞。2019 年 Wu等[38]報道了一種在體外使用混合培養基將人類多能干細胞（PSCs）分化為具有膽囊和膽管的肝組織的方法，該方法分為 3 個階段、共 45 d。這一發現不僅為體外研究人類肝膽疾病的分子基礎提供了一個強有力的方法，而且為組織工程化膽管的建立提供了新的方向。不同來源的膽管上皮細胞的優劣見表 1。
表1
不同來源膽管上皮細胞的優劣
1.3 細胞和材料的復合及體內修復
膽管的生理位置及功能要求組織工程化膽管不僅具有引流功能，還能夠耐受膽汁的浸泡，這就要求支架材料在植入前最好就在表面形成覆膜，這給種子細胞與材料的相容性提出了更高的要求[12, 25]。
2015 年，楊揚等[39]將來源于豬的 BMSCs 定向誘導分化為膽管內皮細胞，并證實了其與聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）納米纖維具有良好的生物相容性。2017 年 Zong 等[40]利用新型雙層聚合物支架結合人骨髓間充質干細胞（hMSCs）用于膽道疾病的治療，他們首先通過體外實驗證實 PCL/PLGA 支架與 hMSCs 具有生物相容性，證明了新型支架能夠支持 hMSCs 的黏附、增殖和基質沉積，并制備了 hMSCs-PCL/PLGA 構建體（MPPCs）；然后通過大體觀察和組織學方法評估了 MPPCs 在 18 只豬中的體內膽管修復效果，結果所有實驗動物均無膽管狹窄和膽汁淤積的跡象，且發現該支架不僅能支撐膽道，允許膽汁自由流動，而且對損傷膽管的修復具有直接或間接的積極作用；移植后 4 周通過冰凍切片、并使用共聚焦顯微鏡進行體內細胞追蹤，可見移植后豬模型中的人類細胞仍然存活，在 12 周后人類細胞消失；6 個月時，與空白 PCL/PLGA 支架相比，MPPCs 對膽管損傷具有更好的再灌注效果。該結果說明 hMSCs 在膽道的修復過程中可能起到了一定的過渡作用，在宿主細胞未移行至覆蓋支架前對支架具有一定的保護作用。2019 年，Liu 等[24]在異種脫細胞動脈基質修復滇南小耳豬肝外膽道缺損的研究中到了類似的效果：在免疫熒光檢測中可見移植 8 周后術前植入的綠色熒光蛋白 GFP+ 的膽管細胞仍然存活，這也提示了移植前植入的膽管上皮細胞形成了被覆上皮，可以成功地抵抗膽汁入侵，保護無細胞動脈基質，直至新生膽管形成。
2019 年，Chen 等[41]在工程化大鼠肝移植后肝內膽管再生的研究中，在灌注條件下對移植物再細胞化，通過組織學分析發現膽道上皮細胞形成了管狀結構，存活的肝細胞團駐留在實質間隙，其排列方式與天然組織高度相似。這一發現不僅證明了在脫細胞大鼠肝臟中重建膽管的可行性，也給 EHBD 支架表層覆膜的構建提供了新的思路。
2 體外膽管平臺
體外膽管平臺的建立可以彌補傳統二維細胞培養和動物實驗的不足，可以動態操控和實時觀察重要的生理病理過程，提高疾病的研究水平和藥物的研發效率。近年來，組織工程化膽管的體外平臺建設取得一些階段性的成果，特別是 3D 打印技術的普遍應用也助力了膽管體外測試平臺的進展。在生物材料領域中，關于 3D 打印的研究[42]表明，利用生物相容性打印角化細胞、成纖維細胞和干細胞是可能的。雖然重塑組織或器官的結構完整性和功能尚未實現，但是 3D 打印制備的組織工程化的管狀組織可以作為體外測試平臺，用于藥物測試和管狀組織的功能測定（包括力學、生物學等功能的測定），以及用于建立腫瘤模型。2019 年 Tysoe 等[43]開發了一種適用于膽管重建的生物工程化膽管組織的生成方案，他們在人源膽總管上分離膽管細胞，2 周內即可衍生出表達關鍵膽汁標志物并保留原代肝外或肝內膽管細胞功能的膽管細胞器官樣細胞（COs）。COs 對應于成熟的功能性膽管細胞，為膽管生理學和病理生理學的研究提供了一個獨特的平臺，由此產生的生物工程組織在再生醫學和膽管疾病方面有著廣泛的應用。2020 年，Li 等[44]采用三維打印技術制備了 PCL/明膠/PCL 復合支架，作為 COs 增殖、遷移和分化的基質；其具有良好的力學性能，壓縮模量可達 17.41 kPa，楊氏模量可達 5.03 kPa，能夠滿足植入體內的相關要求，亦可用于未來仿生人工膽管的構建。Thomas 等[45]通過計算機輔助設計（CAD）生成 EHBD 模型，并評估了福拉思彈性樹脂、柔性樹脂和耐久樹脂 3 種材料在37 ℃ 下浸泡于水、PBS 或膽汁酸溶液中 1 周后的機械性能變化，最終建立了精確的 EHBD 模型，其有助于更真實的膽道支架原型臨床前體外測試。已有大量研究證明，在生物反應器系統中培養的 3D 多孔支架上干細胞的擴增有利于在組織工程策略中維持原始細胞功能，但這也使獲取祖細胞群成為一項挑戰[46]。Du 等[47]報道了一種具有功能的膽管芯片，作為一個體外平臺，這種膽管芯片在結構和器官功能上具有膽管的基本特征，可利用各種來源的膽管細胞對膽管的病理生理學進行研究。
2018 年，在組織工程化血管領域，Loy 等[18]報道了一種新穎的具有成本效益的管狀多層組織培養系統（TMCS），其利用纖維素化膠原凝膠作為支架，采用簡單的成型技術和旋轉系統上的內皮化步驟，在 48 h 內輕松制備出細胞結構精細的三層動脈壁模型。該方法在未來亦可在組織工程化膽管的體外測試平臺建立中加以應用。
總之，組織工程化膽管的體外測試平臺的發展給臨床及動物模型的研究帶來了極大的便利，推動著管狀組織工程的進步（圖 1）。
圖1
示體外膽管測試平臺的應用
3 小結
組織工程化膽管在過去的幾十年中得到了較為廣泛的研究，但在臨床上的研究還較為落后。一方面是因為隨著膽腸吻合技術的標準化，臨床上的大部分醫源性膽道損傷可以通過此術式或簡單的吻合在一定程度上得以重建；另一方面是因為，目前的組織工程化的膽管解決不了移植物在體內的快速血管化過程，這就限制了其在臨床上的應用價值。雖然 Struecker 團隊[3]及李立團隊[24]在動物模型中，分別于術后 2 周及 8 周都檢測到了移植物上有膽管上皮細胞的覆蓋，且經磁共振胰膽管成像（magnetic resonance cholangiopancreatography，MRCP）證實了膽道的通暢；但是考慮到移植物的血管重建進程及膽管上皮細胞不耐受缺血缺氧的特性，在移植部位檢測到的膽管上皮細胞的來源尚有待商榷，相應的組織工程化膽管發揮的究竟是過渡還是替代作用尚未有明確的結論。在膽道吻合手術后 6～18 個月吻合部位的瘢痕形成問題也缺乏有力的研究，組織工程化膽管是否能長期替代天然膽管仍需科研工作者進行更長時間、更深層次的研究。體外膽管測試平臺的發展僅僅對組織工程化膽管生物學、力學等特性的研究提供了便利，給動物實驗提供一定的指導，但并不能代替動物實驗。組織工程化膽管的血管形成問題仍在極大程度上限制著其臨床應用，但是隨著材料學、表面改性技術、細胞學和 3D 打印技術的發展，包括血管內皮生長因子的使用，以及支架上聯合培養周細胞、內皮細胞等方法的使用[48]，組織工程化膽管材料的性能會更加全面、優越，在未來組織工程化膽管的發展會更加迅速。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：馮世明負責文章撰寫；李立負責文章內容的審閱及提出意見；胡繼仲及劉威負責文獻的補充查閱。
