引用本文： 鐘勇輝, 謝福川, 魏宜勝, 黃學軍. eIF6 基因表達對結直腸癌細胞侵襲轉移及Wnt/β-catenin 信號通路的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(9): 1148-1154. doi: 10.7507/1007-9424.202012136 復制
在我國，結直腸癌位居腫瘤病死率的第 5 位，威脅人們的健康生活。針對結直腸癌發生發展相關基因的研究，有利于篩選針對結直腸癌的防治靶標。真核起始因子 6（eukaryotic initiation factor 6，eIF6）參與核糖體合成，并且在蛋白質翻譯過程中發揮重要的調控作用[1-2]。有研究[3]報道，eIF6 可通過調控相關信號通路促進結直腸癌的發展，腫瘤的發生發展與上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）過程密切相關，EMT 促進腫瘤細胞的侵襲和遷移，而 Wnt/β-catenin 通路則調節 EMT 的發生。本研究回顧性分析了結直腸癌組織中 eIF6 的表達情況，并通過體外細胞實驗，探究調控 Wnt/β-catenin 通路的分子機制以及在結直腸癌發展中的作用。
1 材料與方法
1.1 主要材料
100 例組織標本（癌組織和癌旁組織）收集于惠州市中心人民醫院 2020 年 1～12 月期間診治的結直腸癌患者；人正常結直腸黏膜細胞 FHC 和人結直腸癌細胞 SW837 購自上海 ATCC 細胞庫；eIF6 基因表達腺病毒、eIF6 shRNA 干擾腺病毒和空質粒腺病毒購自云舟生物科技（廣州）有限公司；4～5 周齡 BALB/C 裸鼠購自成都達碩實驗動物有限公司；兔抗人 eIF6 抗體、兔抗人 β-連環蛋白（β-catenin）抗體、兔抗人糖原合成酶激酶 3β（GSK-3β）抗體、兔抗人腺瘤性息肉蛋白（APC）抗體、兔抗人鋅指轉錄因子 1（Snail）抗體、兔抗人上皮鈣依賴黏附蛋白（E-cadherin）抗體、兔抗人波形蛋白（Vimentin）抗體和羊抗兔 IgG（HRP）抗體均購自艾博抗（上海）貿易有限公司。
1.2 檢測指標及方法
1.2.1 結直腸癌組織及其癌旁組織中 eIF6 蛋白表達檢測
采用免疫組化方法（IHC）。主要步驟：① 取結直腸癌組織及其癌旁組織常規脫水后，進行透明和石蠟包埋，4 μm 厚連續切片，于 60 ℃ 恒溫箱中烘烤 12 h。② 將切片浸入二甲苯和各梯度乙醇，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗 3 次。③ 用檸檬酸鹽溶液浸沒切片，置于高壓蒸汽鍋中加熱 3 min，冷卻至室溫。④ 向切片上滴加 3 % 雙氧水，避光 10 min，PBS 沖洗。⑤ 向切片上滴加兔抗人 eIF6 抗體稀釋液（1∶200），室溫 4 h，PBS 沖洗。⑥ 再滴加羊抗兔 IgG 抗體稀釋液（1∶1 000），室溫 30 min，PBS 沖洗。⑦ 經 DAB 顯色、水洗后，進行蘇木精復染，0.1 % 稀鹽酸用作分化處理，水洗；梯度乙醇脫水，透明后封片，光鏡觀察。結果判定標準：細胞無著色，記作 0 分；呈淡黃色，記作 1 分；呈棕黃色，記作 2 分；呈棕褐色，記作 3 分。陽性細胞占比<5%，記作 0 分；陽性細胞占比 5%～30%，記作 1 分；陽性細胞占比 30%～70%，記作 2 分；陽性細胞占比>70%，記作 3 分。最終計算細胞著色評分×陽性細胞占比評分，評分≤3 分判為陰性，評分>3 分判為陽性。
1.2.2 細胞轉染
分別取 FHC 細胞和 SW837 細胞以 1×106 個/mL 接種到 96 孔細胞培養板中，37 ℃、5 %CO2 條件下培養過夜。SW837 細胞分為對照組、空質粒組、過表達組和敲低組。對照組不做轉染；空質粒組轉入空質粒腺病毒；過表達組轉入 eIF6 基因過表達腺病毒；敲低組轉入 eIF6 shRNA 干擾腺病毒。轉染后細胞置于細胞培養箱中培養 48 h 以備后續實驗。實驗重復檢測 6 次。
1.2.3 qRT-PCR 實驗檢測 eIF6 mRNA 表達情況
收集 1.2.2 中 4 組 SW837 細胞提取總 RNA，逆轉錄為 cDNA，用于 qRT-PCR 反應，以上操作均嚴格按照試劑盒說明書進行，設置 GAPDH 為內參，數據處理采用 2?ΔΔCt 法，引物序列見表 1。
表1
各基因引物序列
1.2.4 蛋白質免疫印跡技術（WB）實驗檢測 eIF6、β-catenin、GSK-3β、APC、Snail、E-cadherin、Vimentin 蛋白表達情況
收集 1.2.2 中 FHC 細胞及 4 組 SW83 細胞經裂解液裂解后，離心 15 min，條件為 4 ℃、15 000 r/min，離心半徑 10 cm。取上清，行 eIF6 蛋白定量檢測：① 取 50 μg 與上樣緩沖液混合，沸水浴 10 min，上樣電泳。② 取凝膠進行 PVDF 轉膜，結束后浸于 5% 脫脂奶封閉，洗滌后加入稀釋一抗（1∶500 稀釋的 eIF6 抗體、β-catenin 抗體、GSK-3β 抗體、APC 抗體、Snail 抗體、E-cadherin 抗體和 Vimentin 抗體），置于 4 ℃ 搖床，過夜孵育。③ 洗滌，加入稀釋二抗（1∶1 000 稀釋的羊抗兔 IgG 抗體），置于室溫搖床，1 h 孵育。④ 洗滌，顯色后通過成像系統獲取結果圖，ImageJ 軟件進行分析，以目的蛋白與 GAPDH 蛋白的條帶灰度值比值表示目的蛋白表達水平。
1.2.5 Transwell 侵襲實驗
基質膠包被 Transwell 小室，凝固后備用。取 1.2.2 中 4 組 SW83 細胞經胰酶消化、離心（15 000 r/min、15 min、離心半徑 10 cm）收集，重懸為 5×105 個/mL，取 100 μL 加入 Transwell 小室內層，取 500 μL 10% 胎牛血清細胞培養基加入 Transwell 小室外層，細胞培養箱中培養 48 h，取出 Transwell 小室，輕拭去內層面細胞，經固定和結晶紫染色，晾干后用顯微鏡觀察侵襲細胞數。
1.2.6 劃痕實驗
取 1.2.2 中 4 組 SW83 細胞，借助滅菌直尺，使用無菌 10 μL 槍頭在培養板底部垂直劃過細胞層，加入細胞培養基清洗去除未貼壁細胞和細胞碎片，倒置顯微鏡下拍照，此時劃痕距離記作 0 h。在細胞培養箱中培養 24 h 后，再次拍照，劃痕距離記作 24 h。Image Pro Plus 6.0 軟件分析圖片，劃痕愈合率=（0 h 距離?24 h 距離）/0 h 距離×100%。
1.2.7 皮下成瘤實驗
取 1.2.2 中 4 組 SW83 細胞，經胰酶消化、離心（15 000 r/min、15 min、離心半徑 10 cm）收集，重懸為 5×106 個/mL，取 200 μL 注射于 BALB/C 裸鼠右腋窩皮下，分別記錄為對照組、空質粒組、過表達組和敲低組，每組 6 只。接種細胞后，對裸鼠進行密切觀察，每間隔 2 d 進行 1 次瘤體直徑測量，共測量 10 次，腫瘤體積=1/2（短徑2×長徑）。
1.2.8 移植腫瘤病理學改變
皮下成瘤實驗結束，麻醉并處死裸鼠，取腫瘤組織用 4% 多聚甲醛固定，PBS 沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片，厚度為 5 μm。將切片進行脫蠟、水化后，蘇木精染色，水洗，1% 鹽酸乙醇分化，水洗，伊紅染色，脫水并透明，樹膠封片，顯微鏡觀察。
1.3 統計學方法
SPSS20.0 統計學軟件用以分析數據。計數資料以例（%）的形式呈現，行配對卡方檢驗；計量資料經正態分布檢驗均符合正態分布，以（
±s）的形式呈現，多組間行單因素方差分析（One-Way ANOVA），進一步兩兩分析行 SNK-q 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 結直腸癌組織及其癌旁組織、人正常結直腸黏膜細胞 FHC 和人結直腸癌細胞 SW837 中 eIF6 蛋白表達檢測結果
結直腸癌組織及其癌旁組織中 eIF6 蛋白表達陽性呈棕褐色顆粒（圖 1a、1b）。本研究 100 例結直腸癌患者中，結直腸癌組織中 eIF6 蛋白表達陽性者 83 例（83.00%），癌旁組織中 eIF6 蛋白表達陽性者 29 例（29.00%），差異具有統計學意義（配對 χ2 檢驗，χ2=59.712，P<0.001）。人結直腸癌細胞 SW837 中 eIF6 蛋白相對表達量高于人正常結直腸黏膜細胞 FHC（2.53±0.26 比 0.97±0.13，P<0.001），見圖 1c、1d。
圖1
示 eIF6 蛋白在結直腸癌組織（a）及其癌旁組織（b）中的表達（IHC ×100）以及在 FHC 細胞和 SW837 細胞中表達的電泳圖（c）和相對表達量檢測結果（d）
2.2 各組 SW837 細胞中 eIF6 mRNA 和蛋白表達檢測結果
相較于對照組，過表達組 SW837 細胞中 eIF6 mRNA 和蛋白的表達水平升高，差異有統計學意義（P<0.05），敲低組 SW837 細胞中的 eIF6 mRNA 和蛋白的表達水平則降低，差異有統計學意義（P<0.05）；空質粒組 SW837 細胞中的 eIF6 mRNA 和蛋白表達水平與對照組的差異無統計學意義（P>0.05）。提示過表達/敲低 eIF6 的 SW837 細胞株構建成功，可用于后續實驗。具體見表 2 和圖 2a、2b。
表2
各組 SW837 細胞中 eIF6 mRNA 和蛋白表達檢測結果（
，n=6）
圖2
各組 SW837 細胞中 eIF6 蛋白表達電泳圖（a）及相對表達量結果（b）
2.3 各組 SW837 細胞中 Wnt/β-catenin 信號通路相關蛋白表達檢測結果
相較于對照組，過表達組的 SW837 細胞中 β-catenin 和 Snail 蛋白表達水平增高，GSK-3β 和 APC 蛋白表達水平降低（P<0.05）；敲低組 SW837 細胞中 β-catenin 和 Snail 蛋白表達水平降低，GSK-3β 和 APC 蛋白表達水平增高（P<0.05）；空質粒組 4 種蛋白的表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。具體見表 3。
表3
各組 SW837 細胞中 Wnt/β-catenin 信號通路相關蛋白表達及 EMT 標志物檢測結果（
，n=6）
2.4 各組 SW837 細胞中 EMT 標志物檢測結果
相較于對照組，過表達組 SW837 細胞中 EMT 標志物 E-cadherin 蛋白表達降低，Vimentin 蛋白表達升高（P<0.05）；敲低組 SW837 細胞中 E-cadherin 蛋白表達升高，Vimentin 蛋白表達降低（P<0.05）；空質粒組 SW837 細胞中 E-cadherin 和 Vimentin 蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05）。具體見表 3。
2.5 各組 SW837 細胞侵襲遷移能力檢測結果
相較于對照組，過表達組 SW837 細胞侵襲數增多，劃痕愈合率升高（P<0.05），敲低組 SW837 細胞侵襲數減少，劃痕愈合率降低（P<0.05），空質粒組 SW837 細胞侵襲數和劃痕愈合率差異無統計學意義（P>0.05）。具體見表 4 和圖 3a。
表4
各組 SW837 細胞侵襲遷移能力檢測結果（
，n=6）
圖3
示各組 SW837 細胞侵襲實驗和劃痕實驗結果以及體內成瘤情況及其病理學檢查結果
a：Transwell 侵襲實驗結果（結晶紫染色 ×200）及劃痕實驗結果（×100）；b：各組腫瘤體積；c：各組移植瘤大體觀，從左到右依次為對照組、空質粒組、過表達組、敲低組；d–g：對照組（d）、空質粒組（e）、過表達組（f）和敲低組（g）移植瘤病理學檢查結果（HE ×200）
2.6 各組 SW837 細胞體內成瘤情況
對照組腫瘤體積隨時間推移不斷增大，空質粒組腫瘤體積基本與對照組同步增加，過表達組腫瘤體積相較于對照組有所增大，敲低組腫瘤體積相較于對照組有所減小（圖 3b、3c）。
2.7 各組 SW837 細胞的移植瘤病理學檢查結果
HE 染色可觀察到呈現圓形或橢圓形的癌細胞，排列紊亂、核大、深染，具有病理性核分裂像，并且組織間含有豐富的間質血管（圖 3d-3g）。
3 討論
結直腸癌是我國常見惡性腫瘤，確診時多已為中晚期，預后較差。尋找有效監控結直腸癌發生發展的分子標志物，是其防治和預后判斷的關鍵。研究[3-4]表明，eIF6 是翻譯起始的限速因子，對腫瘤的發生發展具有重要的調節作用。Gantenbein 等[5]研究發現，肺腺癌和肺鱗狀細胞癌中 eIF6 蛋白表達明顯高于健康組織，高水平 eIF6 與腺癌患者的總生存期縮短相關，敲除 eIF6 可抑制癌細胞增殖并誘導其凋亡。Golob-Schwarzl 等[6]研究報道，與非腫瘤性組織相比，膽囊癌組織中 eIF6 的表達水平顯著升高，在膽囊癌細胞系中敲除 eIF6 可抑制癌細胞增殖。本研究發現，在 100 例結直腸癌組織中 83 例 eIF6 蛋白表達陽性，在其對應的癌旁組織中 eIF6 蛋白表達陽性者 29 例，同時人結直腸癌細胞 SW837 中 eIF6 蛋白相對表達量高于人正常結直腸黏膜細胞，其差異均有統計學意義（P<0.001），該結果提示結直腸癌的發生發展可能與 eIF6 表達異常相關。本研究還發現，過表達 eIF6 組結直腸癌細胞的體內成瘤能力相比于對照組有所增強，敲低 eIF6 組結直腸癌細胞的體內成瘤能力相比于對照組有所減弱，提示 eIF6 對癌細胞成瘤能力具有調控作用，但具體機制還需進一步研究。
有研究[7-9]報道，Wnt 信號通路在結直腸癌發生發展中起重要作用，約 90 % 的結直腸癌患者體內存在 Wnt 信號通路的異常激活，其中以 β-catenin 和 APC 異常最為常見。Wnt 信號通路未激活時，細胞質中一部分 β-catenin 與 E-cadherin 和細胞骨架肌動蛋白絲結合在一起[10-12]；一部分與 GSK-3β、APC、酪蛋白激酶 1、體軸抑制蛋白 1（Axin1）和體軸抑制蛋白 2（Axin2）形成復合體，從而 β-catenin 被磷酸化、泛素化，并最終降解[13-15]；以游離形式存在的 β-catenin 較少，因此無法進入細胞核中激活相應靶基因。當 Wnt 信號通路被激活后，上述復合體解離，釋放大量 β-catenin 進入細胞核后激活靶基因，誘導 EMT，促進腫瘤發生發展[16-18]。Li 等[19]研究發現，抑制 β-catenin 入核活性，下調 Wnt 信號通路，可抑制結直腸癌細胞的干細胞樣潛能。Chen 等[20]研究報道，激活 AKT/GSK-3β/β-catenin 信號通路可誘導結直腸癌細胞生長和侵襲。在本研究中，過表達 eIF6 組細胞相比于對照組細胞，β-catenin 蛋白和通路下游 Snail 蛋白的表達增加，GSK-3β 和 APC 蛋白表達減少；敲低 eIF6 組細胞 β-catenin 及 Snail 蛋白表達減少，GSK-3β 和 APC 蛋白表達增加。該結果提示 eIF6 對癌細胞成瘤能力的調控機制可能是通過激活 Wnt/β-catenin 信號通路，調控通路下游蛋白的表達發揮作用的。
現已知 Wnt/β-catenin 信號通路異常激活，可促進 EMT 進程，加速腫瘤的發生發展[21]。Guo 等[22]研究報道，使骨肉瘤中 Wnt/β-catenin 信號通路失活能夠抑制腫瘤生長和轉移。Gu 等[23]研究發現，藥物抑制 Wnt/β-catenin 信號通路的激活，可抑制 EMT，并且進一步體內研究證實調控 Wnt/β-catenin 信號通路可抑制 EMT，抑制腫瘤生長。Wu 等[24]研究發現，降低 β-catenin 磷酸化水平來增強 β-catenin 的表達和核轉位，可調控 EMT 并促進結直腸癌轉移。本研究結果顯示，過表達 eIF6 組細胞相比于對照組細胞，E-cadherin 蛋白表達降低，Vimentin 蛋白表達升高，細胞侵襲數增多，劃痕愈合率升高；敲低 eIF6 的細胞 E-cadherin 蛋白表達升高，Vimentin 蛋白表達降低，細胞侵襲數減少，劃痕愈合率降低。結合之前實驗結果，推測 eIF6 可能通過 Wnt/β-catenin 信號通路調控 EMT，影響結直腸癌細胞的侵襲遷移能力。
綜上所述，結直腸癌組織中存在 eIF6 表達上調，eIF6 可能促進 Wnt/β-catenin 信號通路的激活，加速 EMT 進程，提高結直腸癌細胞遷移侵襲能力和體內成瘤能力。本研究結果提示，eIF6 可能為篩選結直腸癌治療藥物及預后評估的潛在分子標志物。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們不存在相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：鐘勇輝參與實驗設計及實驗研究，謝福川及魏宜勝參與部分實驗研究及數據的統計分許，黃學軍參與文章的校對及修改。
倫理聲明：本研究已通過惠州市中心人民醫院倫理委員會的審核批準（審批文號：kyll2019052）。
在我國，結直腸癌位居腫瘤病死率的第 5 位，威脅人們的健康生活。針對結直腸癌發生發展相關基因的研究，有利于篩選針對結直腸癌的防治靶標。真核起始因子 6（eukaryotic initiation factor 6，eIF6）參與核糖體合成，并且在蛋白質翻譯過程中發揮重要的調控作用[1-2]。有研究[3]報道，eIF6 可通過調控相關信號通路促進結直腸癌的發展，腫瘤的發生發展與上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）過程密切相關，EMT 促進腫瘤細胞的侵襲和遷移，而 Wnt/β-catenin 通路則調節 EMT 的發生。本研究回顧性分析了結直腸癌組織中 eIF6 的表達情況，并通過體外細胞實驗，探究調控 Wnt/β-catenin 通路的分子機制以及在結直腸癌發展中的作用。
1 材料與方法
1.1 主要材料
100 例組織標本（癌組織和癌旁組織）收集于惠州市中心人民醫院 2020 年 1～12 月期間診治的結直腸癌患者；人正常結直腸黏膜細胞 FHC 和人結直腸癌細胞 SW837 購自上海 ATCC 細胞庫；eIF6 基因表達腺病毒、eIF6 shRNA 干擾腺病毒和空質粒腺病毒購自云舟生物科技（廣州）有限公司；4～5 周齡 BALB/C 裸鼠購自成都達碩實驗動物有限公司；兔抗人 eIF6 抗體、兔抗人 β-連環蛋白（β-catenin）抗體、兔抗人糖原合成酶激酶 3β（GSK-3β）抗體、兔抗人腺瘤性息肉蛋白（APC）抗體、兔抗人鋅指轉錄因子 1（Snail）抗體、兔抗人上皮鈣依賴黏附蛋白（E-cadherin）抗體、兔抗人波形蛋白（Vimentin）抗體和羊抗兔 IgG（HRP）抗體均購自艾博抗（上海）貿易有限公司。
1.2 檢測指標及方法
1.2.1 結直腸癌組織及其癌旁組織中 eIF6 蛋白表達檢測
采用免疫組化方法（IHC）。主要步驟：① 取結直腸癌組織及其癌旁組織常規脫水后，進行透明和石蠟包埋，4 μm 厚連續切片，于 60 ℃ 恒溫箱中烘烤 12 h。② 將切片浸入二甲苯和各梯度乙醇，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗 3 次。③ 用檸檬酸鹽溶液浸沒切片，置于高壓蒸汽鍋中加熱 3 min，冷卻至室溫。④ 向切片上滴加 3 % 雙氧水，避光 10 min，PBS 沖洗。⑤ 向切片上滴加兔抗人 eIF6 抗體稀釋液（1∶200），室溫 4 h，PBS 沖洗。⑥ 再滴加羊抗兔 IgG 抗體稀釋液（1∶1 000），室溫 30 min，PBS 沖洗。⑦ 經 DAB 顯色、水洗后，進行蘇木精復染，0.1 % 稀鹽酸用作分化處理，水洗；梯度乙醇脫水，透明后封片，光鏡觀察。結果判定標準：細胞無著色，記作 0 分；呈淡黃色，記作 1 分；呈棕黃色，記作 2 分；呈棕褐色，記作 3 分。陽性細胞占比<5%，記作 0 分；陽性細胞占比 5%～30%，記作 1 分；陽性細胞占比 30%～70%，記作 2 分；陽性細胞占比>70%，記作 3 分。最終計算細胞著色評分×陽性細胞占比評分，評分≤3 分判為陰性，評分>3 分判為陽性。
1.2.2 細胞轉染
分別取 FHC 細胞和 SW837 細胞以 1×106 個/mL 接種到 96 孔細胞培養板中，37 ℃、5 %CO2 條件下培養過夜。SW837 細胞分為對照組、空質粒組、過表達組和敲低組。對照組不做轉染；空質粒組轉入空質粒腺病毒；過表達組轉入 eIF6 基因過表達腺病毒；敲低組轉入 eIF6 shRNA 干擾腺病毒。轉染后細胞置于細胞培養箱中培養 48 h 以備后續實驗。實驗重復檢測 6 次。
1.2.3 qRT-PCR 實驗檢測 eIF6 mRNA 表達情況
收集 1.2.2 中 4 組 SW837 細胞提取總 RNA，逆轉錄為 cDNA，用于 qRT-PCR 反應，以上操作均嚴格按照試劑盒說明書進行，設置 GAPDH 為內參，數據處理采用 2?ΔΔCt 法，引物序列見表 1。
表1
各基因引物序列
1.2.4 蛋白質免疫印跡技術（WB）實驗檢測 eIF6、β-catenin、GSK-3β、APC、Snail、E-cadherin、Vimentin 蛋白表達情況
收集 1.2.2 中 FHC 細胞及 4 組 SW83 細胞經裂解液裂解后，離心 15 min，條件為 4 ℃、15 000 r/min，離心半徑 10 cm。取上清，行 eIF6 蛋白定量檢測：① 取 50 μg 與上樣緩沖液混合，沸水浴 10 min，上樣電泳。② 取凝膠進行 PVDF 轉膜，結束后浸于 5% 脫脂奶封閉，洗滌后加入稀釋一抗（1∶500 稀釋的 eIF6 抗體、β-catenin 抗體、GSK-3β 抗體、APC 抗體、Snail 抗體、E-cadherin 抗體和 Vimentin 抗體），置于 4 ℃ 搖床，過夜孵育。③ 洗滌，加入稀釋二抗（1∶1 000 稀釋的羊抗兔 IgG 抗體），置于室溫搖床，1 h 孵育。④ 洗滌，顯色后通過成像系統獲取結果圖，ImageJ 軟件進行分析，以目的蛋白與 GAPDH 蛋白的條帶灰度值比值表示目的蛋白表達水平。
1.2.5 Transwell 侵襲實驗
基質膠包被 Transwell 小室，凝固后備用。取 1.2.2 中 4 組 SW83 細胞經胰酶消化、離心（15 000 r/min、15 min、離心半徑 10 cm）收集，重懸為 5×105 個/mL，取 100 μL 加入 Transwell 小室內層，取 500 μL 10% 胎牛血清細胞培養基加入 Transwell 小室外層，細胞培養箱中培養 48 h，取出 Transwell 小室，輕拭去內層面細胞，經固定和結晶紫染色，晾干后用顯微鏡觀察侵襲細胞數。
1.2.6 劃痕實驗
取 1.2.2 中 4 組 SW83 細胞，借助滅菌直尺，使用無菌 10 μL 槍頭在培養板底部垂直劃過細胞層，加入細胞培養基清洗去除未貼壁細胞和細胞碎片，倒置顯微鏡下拍照，此時劃痕距離記作 0 h。在細胞培養箱中培養 24 h 后，再次拍照，劃痕距離記作 24 h。Image Pro Plus 6.0 軟件分析圖片，劃痕愈合率=（0 h 距離?24 h 距離）/0 h 距離×100%。
1.2.7 皮下成瘤實驗
取 1.2.2 中 4 組 SW83 細胞，經胰酶消化、離心（15 000 r/min、15 min、離心半徑 10 cm）收集，重懸為 5×106 個/mL，取 200 μL 注射于 BALB/C 裸鼠右腋窩皮下，分別記錄為對照組、空質粒組、過表達組和敲低組，每組 6 只。接種細胞后，對裸鼠進行密切觀察，每間隔 2 d 進行 1 次瘤體直徑測量，共測量 10 次，腫瘤體積=1/2（短徑2×長徑）。
1.2.8 移植腫瘤病理學改變
皮下成瘤實驗結束，麻醉并處死裸鼠，取腫瘤組織用 4% 多聚甲醛固定，PBS 沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片，厚度為 5 μm。將切片進行脫蠟、水化后，蘇木精染色，水洗，1% 鹽酸乙醇分化，水洗，伊紅染色，脫水并透明，樹膠封片，顯微鏡觀察。
1.3 統計學方法
SPSS20.0 統計學軟件用以分析數據。計數資料以例（%）的形式呈現，行配對卡方檢驗；計量資料經正態分布檢驗均符合正態分布，以（±s）的形式呈現，多組間行單因素方差分析（One-Way ANOVA），進一步兩兩分析行 SNK-q 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 結直腸癌組織及其癌旁組織、人正常結直腸黏膜細胞 FHC 和人結直腸癌細胞 SW837 中 eIF6 蛋白表達檢測結果
結直腸癌組織及其癌旁組織中 eIF6 蛋白表達陽性呈棕褐色顆粒（圖 1a、1b）。本研究 100 例結直腸癌患者中，結直腸癌組織中 eIF6 蛋白表達陽性者 83 例（83.00%），癌旁組織中 eIF6 蛋白表達陽性者 29 例（29.00%），差異具有統計學意義（配對 χ2 檢驗，χ2=59.712，P<0.001）。人結直腸癌細胞 SW837 中 eIF6 蛋白相對表達量高于人正常結直腸黏膜細胞 FHC（2.53±0.26 比 0.97±0.13，P<0.001），見圖 1c、1d。
圖1
示 eIF6 蛋白在結直腸癌組織（a）及其癌旁組織（b）中的表達（IHC ×100）以及在 FHC 細胞和 SW837 細胞中表達的電泳圖（c）和相對表達量檢測結果（d）
2.2 各組 SW837 細胞中 eIF6 mRNA 和蛋白表達檢測結果
相較于對照組，過表達組 SW837 細胞中 eIF6 mRNA 和蛋白的表達水平升高，差異有統計學意義（P<0.05），敲低組 SW837 細胞中的 eIF6 mRNA 和蛋白的表達水平則降低，差異有統計學意義（P<0.05）；空質粒組 SW837 細胞中的 eIF6 mRNA 和蛋白表達水平與對照組的差異無統計學意義（P>0.05）。提示過表達/敲低 eIF6 的 SW837 細胞株構建成功，可用于后續實驗。具體見表 2 和圖 2a、2b。
表2
各組 SW837 細胞中 eIF6 mRNA 和蛋白表達檢測結果（，n=6）
圖2
各組 SW837 細胞中 eIF6 蛋白表達電泳圖（a）及相對表達量結果（b）
2.3 各組 SW837 細胞中 Wnt/β-catenin 信號通路相關蛋白表達檢測結果
相較于對照組，過表達組的 SW837 細胞中 β-catenin 和 Snail 蛋白表達水平增高，GSK-3β 和 APC 蛋白表達水平降低（P<0.05）；敲低組 SW837 細胞中 β-catenin 和 Snail 蛋白表達水平降低，GSK-3β 和 APC 蛋白表達水平增高（P<0.05）；空質粒組 4 種蛋白的表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。具體見表 3。
表3
各組 SW837 細胞中 Wnt/β-catenin 信號通路相關蛋白表達及 EMT 標志物檢測結果（，n=6）
2.4 各組 SW837 細胞中 EMT 標志物檢測結果
相較于對照組，過表達組 SW837 細胞中 EMT 標志物 E-cadherin 蛋白表達降低，Vimentin 蛋白表達升高（P<0.05）；敲低組 SW837 細胞中 E-cadherin 蛋白表達升高，Vimentin 蛋白表達降低（P<0.05）；空質粒組 SW837 細胞中 E-cadherin 和 Vimentin 蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05）。具體見表 3。
2.5 各組 SW837 細胞侵襲遷移能力檢測結果
相較于對照組，過表達組 SW837 細胞侵襲數增多，劃痕愈合率升高（P<0.05），敲低組 SW837 細胞侵襲數減少，劃痕愈合率降低（P<0.05），空質粒組 SW837 細胞侵襲數和劃痕愈合率差異無統計學意義（P>0.05）。具體見表 4 和圖 3a。
表4
各組 SW837 細胞侵襲遷移能力檢測結果（，n=6）
圖3
示各組 SW837 細胞侵襲實驗和劃痕實驗結果以及體內成瘤情況及其病理學檢查結果
a：Transwell 侵襲實驗結果（結晶紫染色 ×200）及劃痕實驗結果（×100）；b：各組腫瘤體積；c：各組移植瘤大體觀，從左到右依次為對照組、空質粒組、過表達組、敲低組；d–g：對照組（d）、空質粒組（e）、過表達組（f）和敲低組（g）移植瘤病理學檢查結果（HE ×200）
2.6 各組 SW837 細胞體內成瘤情況
對照組腫瘤體積隨時間推移不斷增大，空質粒組腫瘤體積基本與對照組同步增加，過表達組腫瘤體積相較于對照組有所增大，敲低組腫瘤體積相較于對照組有所減小（圖 3b、3c）。
2.7 各組 SW837 細胞的移植瘤病理學檢查結果
HE 染色可觀察到呈現圓形或橢圓形的癌細胞，排列紊亂、核大、深染，具有病理性核分裂像，并且組織間含有豐富的間質血管（圖 3d-3g）。
3 討論
結直腸癌是我國常見惡性腫瘤，確診時多已為中晚期，預后較差。尋找有效監控結直腸癌發生發展的分子標志物，是其防治和預后判斷的關鍵。研究[3-4]表明，eIF6 是翻譯起始的限速因子，對腫瘤的發生發展具有重要的調節作用。Gantenbein 等[5]研究發現，肺腺癌和肺鱗狀細胞癌中 eIF6 蛋白表達明顯高于健康組織，高水平 eIF6 與腺癌患者的總生存期縮短相關，敲除 eIF6 可抑制癌細胞增殖并誘導其凋亡。Golob-Schwarzl 等[6]研究報道，與非腫瘤性組織相比，膽囊癌組織中 eIF6 的表達水平顯著升高，在膽囊癌細胞系中敲除 eIF6 可抑制癌細胞增殖。本研究發現，在 100 例結直腸癌組織中 83 例 eIF6 蛋白表達陽性，在其對應的癌旁組織中 eIF6 蛋白表達陽性者 29 例，同時人結直腸癌細胞 SW837 中 eIF6 蛋白相對表達量高于人正常結直腸黏膜細胞，其差異均有統計學意義（P<0.001），該結果提示結直腸癌的發生發展可能與 eIF6 表達異常相關。本研究還發現，過表達 eIF6 組結直腸癌細胞的體內成瘤能力相比于對照組有所增強，敲低 eIF6 組結直腸癌細胞的體內成瘤能力相比于對照組有所減弱，提示 eIF6 對癌細胞成瘤能力具有調控作用，但具體機制還需進一步研究。
有研究[7-9]報道，Wnt 信號通路在結直腸癌發生發展中起重要作用，約 90 % 的結直腸癌患者體內存在 Wnt 信號通路的異常激活，其中以 β-catenin 和 APC 異常最為常見。Wnt 信號通路未激活時，細胞質中一部分 β-catenin 與 E-cadherin 和細胞骨架肌動蛋白絲結合在一起[10-12]；一部分與 GSK-3β、APC、酪蛋白激酶 1、體軸抑制蛋白 1（Axin1）和體軸抑制蛋白 2（Axin2）形成復合體，從而 β-catenin 被磷酸化、泛素化，并最終降解[13-15]；以游離形式存在的 β-catenin 較少，因此無法進入細胞核中激活相應靶基因。當 Wnt 信號通路被激活后，上述復合體解離，釋放大量 β-catenin 進入細胞核后激活靶基因，誘導 EMT，促進腫瘤發生發展[16-18]。Li 等[19]研究發現，抑制 β-catenin 入核活性，下調 Wnt 信號通路，可抑制結直腸癌細胞的干細胞樣潛能。Chen 等[20]研究報道，激活 AKT/GSK-3β/β-catenin 信號通路可誘導結直腸癌細胞生長和侵襲。在本研究中，過表達 eIF6 組細胞相比于對照組細胞，β-catenin 蛋白和通路下游 Snail 蛋白的表達增加，GSK-3β 和 APC 蛋白表達減少；敲低 eIF6 組細胞 β-catenin 及 Snail 蛋白表達減少，GSK-3β 和 APC 蛋白表達增加。該結果提示 eIF6 對癌細胞成瘤能力的調控機制可能是通過激活 Wnt/β-catenin 信號通路，調控通路下游蛋白的表達發揮作用的。
現已知 Wnt/β-catenin 信號通路異常激活，可促進 EMT 進程，加速腫瘤的發生發展[21]。Guo 等[22]研究報道，使骨肉瘤中 Wnt/β-catenin 信號通路失活能夠抑制腫瘤生長和轉移。Gu 等[23]研究發現，藥物抑制 Wnt/β-catenin 信號通路的激活，可抑制 EMT，并且進一步體內研究證實調控 Wnt/β-catenin 信號通路可抑制 EMT，抑制腫瘤生長。Wu 等[24]研究發現，降低 β-catenin 磷酸化水平來增強 β-catenin 的表達和核轉位，可調控 EMT 并促進結直腸癌轉移。本研究結果顯示，過表達 eIF6 組細胞相比于對照組細胞，E-cadherin 蛋白表達降低，Vimentin 蛋白表達升高，細胞侵襲數增多，劃痕愈合率升高；敲低 eIF6 的細胞 E-cadherin 蛋白表達升高，Vimentin 蛋白表達降低，細胞侵襲數減少，劃痕愈合率降低。結合之前實驗結果，推測 eIF6 可能通過 Wnt/β-catenin 信號通路調控 EMT，影響結直腸癌細胞的侵襲遷移能力。
綜上所述，結直腸癌組織中存在 eIF6 表達上調，eIF6 可能促進 Wnt/β-catenin 信號通路的激活，加速 EMT 進程，提高結直腸癌細胞遷移侵襲能力和體內成瘤能力。本研究結果提示，eIF6 可能為篩選結直腸癌治療藥物及預后評估的潛在分子標志物。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們不存在相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：鐘勇輝參與實驗設計及實驗研究，謝福川及魏宜勝參與部分實驗研究及數據的統計分許，黃學軍參與文章的校對及修改。
倫理聲明：本研究已通過惠州市中心人民醫院倫理委員會的審核批準（審批文號：kyll2019052）。
