引用本文： 羅雪, 趙代偉, 陳松, 高慶軍. 程序性細胞死亡配體1在甲狀腺乳頭狀癌合并橋本甲狀腺炎中的表達及其臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(9): 1155-1158. doi: 10.7507/1007-9424.202012040 復制
甲狀腺癌作為最常見的內分泌惡性腫瘤，在過去的 30 年其發病率增加了 3 倍[1]，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌中最常見的類型，約占甲狀腺癌的 85%，其發病機制目前尚未完全明確[2]。與甲狀腺癌其他類型相比，PTC 具有相對較好的生存率，但疾病復發也很常見，并且再次發生時會增加患者病死率。近年來，以程序性細胞死亡配體 1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）為代表的的免疫檢查點分子免疫治療在不斷發展，有許多研究[3-7]表明，PD-L1 途徑參與了許多疾病的發生和發展，也成為多種惡性腫瘤中新的有希望的分子靶標之一，其能調節 T 細胞活化、耐受性和免疫介導的組織損傷、在上皮細胞中被誘導并在各種腫瘤細胞中表達，因此認為，PD-L1 表達是腫瘤細胞在腫瘤微環境中抑制抗腫瘤免疫力的重要因素之一。近年來，PD-L1 與甲狀腺癌間關系的研究也日益增多，有研究[8]結果顯示，PTC 組織中 PD-L1 表達呈現出明顯的差異，其表達陽性率為 6.1%～82.5%，其原因可能與實驗方法、PD-L1 表達位點、陽性染色閾值判斷等有關。既往評估 PD-L1 在甲狀腺癌研究中的焦點大部分是考慮 PD-L1 的表達與甲狀腺癌臨床病理特征之間的關系，而很少特地關注當甲狀腺癌合并自身免疫性疾病橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s thyroiditis，HT）時的情況。因此，本研究主要目的是探討當 PTC 合并 HT 時是否改變了 PD-L1 在 PTC 組織中的表達情況，為進一步探討自身免疫性甲狀腺疾病對 PTC 微環境和疾病進展的影響。
1 資料與方法
1.1 病例資料
選取 2017 年 3 月至 2019 年 5 月期間在貴州醫科大學附屬醫院甲狀腺外科接受甲狀腺切除術的 PTC 患者。納入研究的患者需符合以下條件：① 首次行甲狀腺手術；② 術后有明確的 PTC 組織病理學診斷結果；③ 臨床病理資料完整；④ 術前檢查均排除自身免疫性及感染性疾病；⑤ 術前均未行放化療；⑥ 排除術后病理診斷為濾泡性甲狀腺癌、髓樣癌、未分化性甲狀腺癌、淋巴瘤等其他組織學類型。患者的術后病理報告由貴州醫科大學附屬醫院病理科兩位從事病理學研究 10 年以上的高年資醫師最終評判。
1.2 方法
1.2.1 主要試劑
兔抗人多克隆抗體 PD-L1 購自 Abcam 公司，蘇木精購自北京中杉金橋公司。
1.2.2 免疫組織化學染色方法
采用免疫組織化學 EnVision 兩步法，將所有標本在離體后立即放入 10% 中性甲醛中浸泡，常規石蠟包埋，5 μm 厚連續切片，經二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3% H2O2 去除內源性酶，高壓處理熱修復抗原，加一抗（兔單克隆抗體 PD-L1）后 4 ℃ 過夜，中性樹膠封片，鏡檢。操作步驟嚴格按產品說明書進行。
1.2.3 結果判讀
由 2 名病理學家在對臨床參數不了解情況下，對 PTC 組織病理學標本中 PD-L1 表達進行評估，若出現差異則通過協商一致解決。當癌細胞的胞質和（或）胞膜出現棕黃色或棕褐色顆粒時視為 PD-L1 染色陽性。在 PD-L1 染色陽性基礎上以陽性細胞是否達到百分率 20% 為界，≥20% 判定為 PD-L1 高表達即表達陽性，<20% 判定為 PD-L1 低表達即表達陰性[9]。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 23.0 統計軟件對數據進行分析。采用χ2檢驗分析 PD-L1 表達陽性率與 PTC 患者臨床病理特征的關系；采用 Spearman 等級相關分析 PD-L1 陽性表達與是否伴 HT 的關系；多因素分析采用二元 logistic 回歸模型進行評價，采用向后有條件選擇變量。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 本研究納入患者的基本情況
本研究共納入 138 例 PTC 患者，其中男 38 例，女 100 例；年齡 17～80 歲、平均年齡 47 歲；有腺外侵犯 58 例，無腺外侵犯 80 例；有淋巴結轉移 90 例，無淋巴結轉移 48 例；TNM 分期Ⅰ期 89 例、Ⅱ期 26 例、Ⅲ期 13 例、Ⅳ期 10 例；單純 PTC 104 例，合并 HT 的 PTC 34 例。
2.2 PTC 組織中 PD-L1 陽性表達與其臨床病理特征的關系
免疫組織化學染色法檢測 PD-L1 蛋白在 PTC 組織中的表達情況見圖 1。PD-L1 蛋白在 PTC 組織中的表達陽性率為 35.5%（49/138）。單因素分析結果發現，PD-L1 表達陽性率與 PTC 患者的腫瘤大小（指直徑）、有無腺外侵犯以及是否合并 HT 有關（P<0.05），且發現 PD-L1 在 PTC 組織中表達陽性率與腫瘤大小（rs=0.173，P=0.041）和有無腺外侵犯（rs=0.197，P=0.021）呈正相關，即 PD-L1 高表達的患者，其腫瘤直徑往往較大并容易出現腺外侵犯，而其與是否合并 HT 呈負相關（rs=–0.284，P=0.001），即合并 HT 的 PTC 癌組織中 PD-L1 表達陽性率較不合并 HT 者低；其與患者性別、年齡、有無淋巴結轉移及 TNM 分期無關（P>0.05），見表 1；對這些差異有統計學意義的變量進行二元 logistic 回歸多因素分析結果顯示，PTC 不合并 HT 是 PD-L1 表達的獨立危險因素 ［OR=5.720，95%CI（1.879，17.411），P=0.002］，見表 2。
圖1
示 PD-L1 在 PTC 組織中的表達情況（SP ×200）
a：PD-L1 在 PTC 組織中染色陰性；b：PD-L1 在單純 PTC 組織中低表達；c：PD-L1 在單純 PTC 組織中高表達；d：PD-L1 在 PTC 合并 HT 組織中高表達
表1
PD-L1 表達與 PTC 患者臨床病理特征的關系
表2
PD-L1 表達陽性率的 logistic 回歸多因素分析結果
3 討論
HT 是一種以彌漫性淋巴細胞浸潤為主要特征的慢性甲狀腺免疫性疾病，全球年發病率為（3～15）/10 000，在女性中更普遍，其與 PTC 發生密切相關[10-12]，但其發生關系一直備受爭議，其原因可能是 HT 的定義不統一，或是臨床病理學與自身免疫性疾病的血清學診斷標準差異導致，然而二者間相關性和具體機制仍然未知。有相關研究[13-16]報道，PTC 和 HT 呈正相關甚至是因果關系，在一般人群中合并 HT 的 PTC 占比 10%～58%（平均 27.6%），地區和人群間有差異。本研究納入的 138 例 PTC 組織中，PTC 合并 HT 者 34 例（ 24.6%），與文獻[13-16]報道基本一致。
PD-L1 也被稱為 CD274，是 B7 家族的一種細胞表面糖蛋白，它表達于包括實體腫瘤在內的多種組織中，能與細胞毒性 T 淋巴細胞表面表達的程序性細胞死亡受體-1 受體結合，抑制蛋白激酶的磷酸化，進而導致白細胞介素 2（IL-2）和 T 細胞衰竭，被認為是癌細胞逃逸宿主免疫監視的基本機制之一[17]。在本研究中發現，PD-L1 在 PTC 組織中陽性率為 35.5%，這與 Fadia 等[8]報道基本一致；而且 PD-L1 表達陽性率與 PTC 腫瘤大小和腺外侵犯明顯相關，這與 Chowdhury 等[18]的研究報道基本一致，且 PD-L1 表達陽性率是甲狀腺癌預后不良的重要特征，是治療后復發及影響生存率的原因之一。
最新研究認為，慢性炎癥會上調細胞因子，從而影響 PD-L1 的表達。本研究通過檢測單純 PTC 組織和有 HT 背景下 PTC 組織中 PD-L1 的表達情況，發現有 HT 背景下的 PTC 組織中 PD-L1 的表達陽性率明顯降低，這與之前 Han 等[19]的相關研究結論一致。合并 HT 的 PTC 組織中 PD-L1 表達陽性率降低的原因可能是，PTC 合并 HT 時，組織中的 IL-2 表達增強，增強的 IL-2 細胞因子通過增強人類白細胞抗原Ⅰ類分子與主要組織相容性復合體Ⅰ類分子的表達而促進 CD3+ 和 CD8+ T 細胞的活化，從而抑制 PD-L1 的表達，進而增強 T 細胞的免疫性，限制 PTC 的進程[20]，這也許是為何合并 HT 的 PTC 患者在臨床上往往預后更好的原因。然而也有與本研究結果相矛盾的研究[21-22]報道，認為具有 HT 背景的 PTC 病例中，PD-L1 在單純 HT 和合并 HT 的 PTC 的病例中均表達升高，且合并 HT 的 PTC 患者往往伴有淋巴結轉移，其原因也許是 HT 的診斷和 PD-L1 陽性閾值差異所致。
可見，合并 HT 的 PTC 組織中 PD-L1 表達的影響機制仍不清楚，伴有 HT 背景的 PTC 可能與單純 PTC 的免疫微環境有所不同。PTC 組織中 PD-L1 表達可能與 HT 免疫微環境失調息息相關，且 HT 可能是 PD-L1 表達的抑制性因素，提示 PTC 的免疫微環境相關因子參與了甲狀腺癌的發生發展，這意味著在 PTC 發生之前就存在局部免疫失調，而這可能影響 PTC 的生物學行為以及對治療的反應性，需要在以后的研究中擴大樣本深入探討 PD-L1 對其的發病機理。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：高慶軍和趙代偉完成研究構思與設計、行政和物資支持、論文修改及研究監督；羅雪、陳松協助完成臨床數據獲取、研究執行、數據分析及稿件撰寫。
倫理聲明：本研究通過了貴州醫科大學附屬醫院倫理委員會審批 ［批文編號：2019 倫審第 （281） 號）］。
甲狀腺癌作為最常見的內分泌惡性腫瘤，在過去的 30 年其發病率增加了 3 倍[1]，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌中最常見的類型，約占甲狀腺癌的 85%，其發病機制目前尚未完全明確[2]。與甲狀腺癌其他類型相比，PTC 具有相對較好的生存率，但疾病復發也很常見，并且再次發生時會增加患者病死率。近年來，以程序性細胞死亡配體 1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）為代表的的免疫檢查點分子免疫治療在不斷發展，有許多研究[3-7]表明，PD-L1 途徑參與了許多疾病的發生和發展，也成為多種惡性腫瘤中新的有希望的分子靶標之一，其能調節 T 細胞活化、耐受性和免疫介導的組織損傷、在上皮細胞中被誘導并在各種腫瘤細胞中表達，因此認為，PD-L1 表達是腫瘤細胞在腫瘤微環境中抑制抗腫瘤免疫力的重要因素之一。近年來，PD-L1 與甲狀腺癌間關系的研究也日益增多，有研究[8]結果顯示，PTC 組織中 PD-L1 表達呈現出明顯的差異，其表達陽性率為 6.1%～82.5%，其原因可能與實驗方法、PD-L1 表達位點、陽性染色閾值判斷等有關。既往評估 PD-L1 在甲狀腺癌研究中的焦點大部分是考慮 PD-L1 的表達與甲狀腺癌臨床病理特征之間的關系，而很少特地關注當甲狀腺癌合并自身免疫性疾病橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s thyroiditis，HT）時的情況。因此，本研究主要目的是探討當 PTC 合并 HT 時是否改變了 PD-L1 在 PTC 組織中的表達情況，為進一步探討自身免疫性甲狀腺疾病對 PTC 微環境和疾病進展的影響。
1 資料與方法
1.1 病例資料
選取 2017 年 3 月至 2019 年 5 月期間在貴州醫科大學附屬醫院甲狀腺外科接受甲狀腺切除術的 PTC 患者。納入研究的患者需符合以下條件：① 首次行甲狀腺手術；② 術后有明確的 PTC 組織病理學診斷結果；③ 臨床病理資料完整；④ 術前檢查均排除自身免疫性及感染性疾病；⑤ 術前均未行放化療；⑥ 排除術后病理診斷為濾泡性甲狀腺癌、髓樣癌、未分化性甲狀腺癌、淋巴瘤等其他組織學類型。患者的術后病理報告由貴州醫科大學附屬醫院病理科兩位從事病理學研究 10 年以上的高年資醫師最終評判。
1.2 方法
1.2.1 主要試劑
兔抗人多克隆抗體 PD-L1 購自 Abcam 公司，蘇木精購自北京中杉金橋公司。
1.2.2 免疫組織化學染色方法
采用免疫組織化學 EnVision 兩步法，將所有標本在離體后立即放入 10% 中性甲醛中浸泡，常規石蠟包埋，5 μm 厚連續切片，經二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3% H2O2 去除內源性酶，高壓處理熱修復抗原，加一抗（兔單克隆抗體 PD-L1）后 4 ℃ 過夜，中性樹膠封片，鏡檢。操作步驟嚴格按產品說明書進行。
1.2.3 結果判讀
由 2 名病理學家在對臨床參數不了解情況下，對 PTC 組織病理學標本中 PD-L1 表達進行評估，若出現差異則通過協商一致解決。當癌細胞的胞質和（或）胞膜出現棕黃色或棕褐色顆粒時視為 PD-L1 染色陽性。在 PD-L1 染色陽性基礎上以陽性細胞是否達到百分率 20% 為界，≥20% 判定為 PD-L1 高表達即表達陽性，<20% 判定為 PD-L1 低表達即表達陰性[9]。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 23.0 統計軟件對數據進行分析。采用χ2檢驗分析 PD-L1 表達陽性率與 PTC 患者臨床病理特征的關系；采用 Spearman 等級相關分析 PD-L1 陽性表達與是否伴 HT 的關系；多因素分析采用二元 logistic 回歸模型進行評價，采用向后有條件選擇變量。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 本研究納入患者的基本情況
本研究共納入 138 例 PTC 患者，其中男 38 例，女 100 例；年齡 17～80 歲、平均年齡 47 歲；有腺外侵犯 58 例，無腺外侵犯 80 例；有淋巴結轉移 90 例，無淋巴結轉移 48 例；TNM 分期Ⅰ期 89 例、Ⅱ期 26 例、Ⅲ期 13 例、Ⅳ期 10 例；單純 PTC 104 例，合并 HT 的 PTC 34 例。
2.2 PTC 組織中 PD-L1 陽性表達與其臨床病理特征的關系
免疫組織化學染色法檢測 PD-L1 蛋白在 PTC 組織中的表達情況見圖 1。PD-L1 蛋白在 PTC 組織中的表達陽性率為 35.5%（49/138）。單因素分析結果發現，PD-L1 表達陽性率與 PTC 患者的腫瘤大小（指直徑）、有無腺外侵犯以及是否合并 HT 有關（P<0.05），且發現 PD-L1 在 PTC 組織中表達陽性率與腫瘤大小（rs=0.173，P=0.041）和有無腺外侵犯（rs=0.197，P=0.021）呈正相關，即 PD-L1 高表達的患者，其腫瘤直徑往往較大并容易出現腺外侵犯，而其與是否合并 HT 呈負相關（rs=–0.284，P=0.001），即合并 HT 的 PTC 癌組織中 PD-L1 表達陽性率較不合并 HT 者低；其與患者性別、年齡、有無淋巴結轉移及 TNM 分期無關（P>0.05），見表 1；對這些差異有統計學意義的變量進行二元 logistic 回歸多因素分析結果顯示，PTC 不合并 HT 是 PD-L1 表達的獨立危險因素 ［OR=5.720，95%CI（1.879，17.411），P=0.002］，見表 2。
圖1
示 PD-L1 在 PTC 組織中的表達情況（SP ×200）
a：PD-L1 在 PTC 組織中染色陰性；b：PD-L1 在單純 PTC 組織中低表達；c：PD-L1 在單純 PTC 組織中高表達；d：PD-L1 在 PTC 合并 HT 組織中高表達
表1
PD-L1 表達與 PTC 患者臨床病理特征的關系
表2
PD-L1 表達陽性率的 logistic 回歸多因素分析結果
3 討論
HT 是一種以彌漫性淋巴細胞浸潤為主要特征的慢性甲狀腺免疫性疾病，全球年發病率為（3～15）/10 000，在女性中更普遍，其與 PTC 發生密切相關[10-12]，但其發生關系一直備受爭議，其原因可能是 HT 的定義不統一，或是臨床病理學與自身免疫性疾病的血清學診斷標準差異導致，然而二者間相關性和具體機制仍然未知。有相關研究[13-16]報道，PTC 和 HT 呈正相關甚至是因果關系，在一般人群中合并 HT 的 PTC 占比 10%～58%（平均 27.6%），地區和人群間有差異。本研究納入的 138 例 PTC 組織中，PTC 合并 HT 者 34 例（ 24.6%），與文獻[13-16]報道基本一致。
PD-L1 也被稱為 CD274，是 B7 家族的一種細胞表面糖蛋白，它表達于包括實體腫瘤在內的多種組織中，能與細胞毒性 T 淋巴細胞表面表達的程序性細胞死亡受體-1 受體結合，抑制蛋白激酶的磷酸化，進而導致白細胞介素 2（IL-2）和 T 細胞衰竭，被認為是癌細胞逃逸宿主免疫監視的基本機制之一[17]。在本研究中發現，PD-L1 在 PTC 組織中陽性率為 35.5%，這與 Fadia 等[8]報道基本一致；而且 PD-L1 表達陽性率與 PTC 腫瘤大小和腺外侵犯明顯相關，這與 Chowdhury 等[18]的研究報道基本一致，且 PD-L1 表達陽性率是甲狀腺癌預后不良的重要特征，是治療后復發及影響生存率的原因之一。
最新研究認為，慢性炎癥會上調細胞因子，從而影響 PD-L1 的表達。本研究通過檢測單純 PTC 組織和有 HT 背景下 PTC 組織中 PD-L1 的表達情況，發現有 HT 背景下的 PTC 組織中 PD-L1 的表達陽性率明顯降低，這與之前 Han 等[19]的相關研究結論一致。合并 HT 的 PTC 組織中 PD-L1 表達陽性率降低的原因可能是，PTC 合并 HT 時，組織中的 IL-2 表達增強，增強的 IL-2 細胞因子通過增強人類白細胞抗原Ⅰ類分子與主要組織相容性復合體Ⅰ類分子的表達而促進 CD3+ 和 CD8+ T 細胞的活化，從而抑制 PD-L1 的表達，進而增強 T 細胞的免疫性，限制 PTC 的進程[20]，這也許是為何合并 HT 的 PTC 患者在臨床上往往預后更好的原因。然而也有與本研究結果相矛盾的研究[21-22]報道，認為具有 HT 背景的 PTC 病例中，PD-L1 在單純 HT 和合并 HT 的 PTC 的病例中均表達升高，且合并 HT 的 PTC 患者往往伴有淋巴結轉移，其原因也許是 HT 的診斷和 PD-L1 陽性閾值差異所致。
可見，合并 HT 的 PTC 組織中 PD-L1 表達的影響機制仍不清楚，伴有 HT 背景的 PTC 可能與單純 PTC 的免疫微環境有所不同。PTC 組織中 PD-L1 表達可能與 HT 免疫微環境失調息息相關，且 HT 可能是 PD-L1 表達的抑制性因素，提示 PTC 的免疫微環境相關因子參與了甲狀腺癌的發生發展，這意味著在 PTC 發生之前就存在局部免疫失調，而這可能影響 PTC 的生物學行為以及對治療的反應性，需要在以后的研究中擴大樣本深入探討 PD-L1 對其的發病機理。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：高慶軍和趙代偉完成研究構思與設計、行政和物資支持、論文修改及研究監督；羅雪、陳松協助完成臨床數據獲取、研究執行、數據分析及稿件撰寫。
倫理聲明：本研究通過了貴州醫科大學附屬醫院倫理委員會審批 ［批文編號：2019 倫審第 （281） 號）］。
