引用本文： 趙帥華, 董衛紅, 楊敬, 韓保衛. ABHD5 過表達對結腸癌細胞侵襲、遷移及 AMPK/mTOR 通路的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(7): 850-855. doi: 10.7507/1007-9424.202011010 復制
結腸癌是一種常見的惡性消化道腫瘤，具有較高的發病率和致死率，嚴重威脅人類健康和生命[1]。結腸癌發生發展過程中多種代謝相關基因出現異常表達或活性發生改變[2-3]，然而具體機制并不清楚。脂質代謝不僅能夠調節細胞生長、凋亡、運動、膜穩態等生物學過程，與機體化療反應、腫瘤免疫、耐藥等也有關[4]。脂質代謝異常與結腸癌的發生發展有關[5]，含自水解酶域蛋白 5（alpha/beta hydrolase domain-containing protein 5，ABHD5）是一個重要的抑癌基因，也是一種脂肪代謝基因。研究表明，ABHD5 能夠抑制結腸癌[6]、子宮內膜癌[7]、肺癌[8]等癌細胞的生長。單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK） 是一種進化保守的蛋白激酶，在調節細胞能量平衡過程中發揮重要作用，與細胞增殖、分化等多種生物學過程有關[9]。雷帕霉素靶體蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，mTOR 信號傳導能夠調節葡萄糖、核苷酸、脂肪酸和脂質的代謝，與腫瘤細胞的生長和新陳代謝有關[10]。研究[11]表明，山楂酸能夠通過激活 AMPK 并負調控 mTOR 途徑，進而抑制結腸癌細胞的增殖和遷移。目前對結腸癌中 ABHD5 與 AMPK/mTOR 通路之間的關系還少有研究。因此，本研究通過體外培養結腸癌細胞，并轉染 ABHD5 重組質粒，探討 ABHD5 過表達對結腸癌細胞侵襲、遷移以及 AMPK/mTOR 通路的影響，為結腸癌發病機制的研究提供參考。
1 材料與方法
1.1 主要材料與試劑
人結腸癌細胞株 HCT116，購自通派（上海）生物科技有限公司；RNAiso Plus 試劑盒（9108）、反轉錄試劑盒（639547）和實時熒光定量 PCR （qRT-PCR）試劑盒（RR820Q），購于日本 TaKaRa 公司；Lipofectamine 2000 試劑盒（11668-027），購于 Invitrogen 公司；胎牛血清、青霉素-鏈霉素、RPMI 1640 培養基和消化胰酶（貨號：10099、15070063、61870036、25200056）購自美國 Gibco 公司；基質金屬蛋白酶 9（matrix metalloprotein 9，MMP-9；13667）、E-鈣黏附蛋白（E-cadherin，3195）、Snail（3879）、p-AMPK（4370）、AMPK（4695）、p-mTOR（5536）、mTOR（2972）和 GAPDH（5174）單抗，購自美國 Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶標記二抗（A0208）、蛋白提取試劑盒（P0033）、BCA 蛋白定量試劑盒（P0012）和 細胞計數試劑盒（cell counting Kit-8，CCK-8 ；C0037），購自南通碧云天生物技術公司；酶標儀和蛋白凝膠成像儀，購自美國 ThermoFisher 公司；流式細胞儀，購自美國貝克曼庫爾特公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 數據庫分析 ABHD5 在結腸癌中的表達
UALCAN 數據庫（
1.2.2 細胞培養
取 1 mL 凍存 HCT116 細胞株 37 ℃ 解凍，轉移至離心管中，加入 9 mL RPMI 1640 培養基，混勻，1 000 r/min（離心半徑 13.5 cm）離心 5 min，棄上清，加入含有 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素-鏈霉素的 RPMI 1640 培養基中，37 ℃、5% CO2 培養箱中培養傳代。
1.2.3 質粒轉染
取 1.2.2 中處于對數期的 HCT116 細胞，調整細胞濃度為 5×105 個/mL，制備單細胞懸液。利用 Lipofectamine 2000 試劑盒將轉染試劑、轉染空質粒 pcDNA3.1 和轉染重組質粒 pcDNA3.1-ABHD5 分別轉染至 HCT116 細胞，并分別命名為對照組、陰性轉染組和 ABHD5 轉染組。采用 PCR 對 pcDNA3.1-ABHD5 中 ABHD5 片段進行擴增，上游引物序列為 5′ -CCCAAGCTTATGGCGGCGG-AGGAGGAG-3′ ，下游引物序列為 5′ -CCGGAATTC-TCAGTCCACAGTGTCGCAGAT-3 ′ 。轉染后將細胞置于 37 ℃、5% CO2 培養箱中培養 48 h，收集細胞上清。倒置顯微鏡觀察 HCT116 細胞，細胞發出綠色熒光即為轉染成功。
1.2.4 qRT-PCR 法檢測各組細胞中 ABHD5 mRNA 表達
利用 RNAiso Plus 試劑盒提取各組細胞中 RNA，反轉錄試劑盒對提取的 RNA 進行反轉錄成 cDNA，之后進行 qRT-PCR 反應，反應條件為預變性 95 ℃ 60 s，變性 95 ℃ 30 s，退火 60 ℃ 45 s，延伸 72 ℃ 30 s，共計 40 個循環。以 GAPDH 作為內參基因，采用 2?ΔΔCt 法計算各組細胞中 ABHD5 mRNA 的相對表達量。其中 ABHD5 上游引物序列為 5′ -AAGCTTAT-GGCCGGTGCCACCGCCGTC-3′ ，下游引物序列為5′ -GGATCCTCAGTCCACAGAATCACAG-3′ ；GAPDH 上游引物序列為 5′ -AATCCCATCACCATCTTC-3′ ，下游引物序列為5′ -AGGCTGTTGTCATACTTC-3′ 。
1.2.5 CCK-8 法檢測細胞增殖
取 1.2.3 中轉染后的 HCT116 細胞，細胞濃度調整為 1×105 個/mL，制備單細胞懸液；將細胞懸液加至 96 孔中，100 μL/孔，每組設置 6 個復孔，同時設置空白孔（僅添加細胞培養液），37 ℃、5% CO2 培養箱中分別培養 48 h 后，加入 10 μL CCK-8 試劑，37 ℃ 避光培養 2 h，棄上清，酶標儀 450 nm 波長處檢測每孔吸光度值（A 值），計算細胞增殖抑制率=［（對照組 A 值–實驗組 A 值）/對照組 A 值］×100%。
1.2.6 Transwell 法檢測細胞侵襲、遷移能力
① 細胞侵襲實驗：取 1.2.3 中轉染后培養 48 h 的 HCT116 細胞，調整細胞濃度為 1×105 個/mL，接種于鋪有基質膠（Matrigel）的 Transwell 小室上室，下室加入 600 μL 含胎牛血清的 RPMI 1640 培養液，每組設置 3 個重復，每個重復設置 3 個復孔；細胞于 37 ℃ 培養 24 h，倒掉上室培養液，棉簽將未遷移細胞以及 Matrigel 膠輕輕擦去，無水甲醇固定 30 min；0.1% 結晶紫溶液染色 20 min，顯微鏡下隨機選取 5 個視野對染色細胞進行計數，計算平均值。② 細胞遷移實驗：Transwell 小室上室不加 Matrigel 膠，后續步驟同細胞侵襲實驗。
1.2.7 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達情況
取 1.2.3 中轉染培養 48 h 的 HCT116 細胞，每組設置 3 個重復，每個重復設置 3 個復孔。用蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白；BCA 試劑盒對總蛋白濃度進行測定；制備十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 分離膠，蛋白樣品與緩沖液混合，加熱變性，進行 SDS-PAGE；電泳結束后將蛋白轉至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉遮光封閉 2 h；分別加入一抗稀釋液（MMP-9、E-cadherin、Snail、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、GAPDH），稀釋比均為 1∶1 000，4 ℃ 孵育過夜；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-Hcl）+Tween（TBST）緩沖液洗膜 3 次，加入辣根過氧化物酶標記二抗稀釋液（1∶1 000），室溫孵育 1 h，TBST 洗膜 3 次。蛋白凝膠成像儀分析蛋白表達水平。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 25.0 進行數據統計分析。計量數據通過 K-S 法檢驗，符合正態分布者采用均數±標準差（
）表示，多組間比較采用完全隨機設計資料的單因素方差分析，組間兩兩比較采用 SNK-q 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 ABHD5 在結腸癌及正常結腸組織中的表達情況
UALCAN 數據庫分析結果表明，與正常結腸組織比較，結腸癌組織中 ABHD5 mRNA的相對表達量降低（P<0.05），見圖 1a。
圖1
示 ABHD5 mRNA 在結腸癌組織及正常結腸組織中的表達及其與結腸癌臨床病理特征間的關系（UALCAN 數據庫）
a：ABHD5 mRNA 在結腸癌組織及正常結腸組織中的表達，正常
2.2 ABHD5 的表達與結腸癌臨床病理特征間的關系
UALCAN 數據庫分析結果表明，結腸癌組織中 ABHD5 mRNA 的相對表達量在不同年齡、性別、種族、腫瘤分期和淋巴結轉移 N0 與 N2 期以及 N1 與 N2 期間比較差異均無統計學意義（P>0.05），其在腺癌和N1 分期中分別低于黏液腺癌及 N0 分期（P<0.05），見圖 1b-1g。
2.3 轉染細胞株鑒定結果
轉染 48 h 后，轉染后的 HCT116 細胞發出綠色熒光，提示轉染成功（圖 2）。
圖2
示倒置顯微鏡下觀察暗場（a）和熒光場（b）ABHD5 轉染組 HCT116 細胞轉染效果（GFP 熒光染色 ×50）
2.4 qRT-PCR 法檢測轉染后 HCT116 細胞 ABHD5 mRNA 的表達結果
與對照組和陰性轉染組比較，ABHD5 轉染組的 ABHD5 mRNA 相對表達量升高（P<0.05），見表 1。
表1
各組 HCT116 細胞的 ABHD5 mRNA 相對表達量、增殖抑制率及侵襲和遷移情況檢測結果（
）
2.5 CCK-8 法檢測轉染后 HCT116 細胞增殖情況
細胞轉染 48 h 后，與對照組和陰性轉染組比較，ABHD5 轉染組 HCT116 細胞增殖抑制率明顯升高（P<0.05），見表 1。
2.6 Transwell 法檢測轉染后 HCT116 細胞侵襲和遷移情況
與對照組和陰性轉染組比較，ABHD5 轉染組 HCT116 細胞的遷移和侵襲細胞數目減少（P<0.05），見表 1 和圖 3。
圖3
示 3 組 HCT116 細胞的侵襲和遷移情況（a，結晶紫染色 ×200）以及各蛋白表達情況（b）
2.7 轉染后 HCT116 細胞的 MMP-9、E-cadherin 和 Snail 蛋白表達檢測結果
與對照組和陰性轉染組比較，ABHD5 轉染組 HCT116 細胞的 MMP-9 及 Snail 蛋白相對表達量降低，而 E-cadherin 蛋白相對表達量升高（P<0.05），見圖 3 和表 2。
表2
3 組 HCT116 細胞各蛋白相對表達量（
，n=9）
2.8 轉染后 HCT116 細胞 AMPK、mTOR 通路蛋白表達檢測結果
與對照組和陰性轉染組比較，ABHD5 轉染組 HCT116 細胞的 p-AMPK/AMPK 蛋白相對表達量升高，而 p-mTOR/mTOR 蛋白相對表達量降低（P<0.05），見圖 3 和表 2。
3 討論
細胞代謝重編程在腫瘤細胞生長中具有重要作用，腫瘤細胞代謝能夠從營養缺乏環境中獲取必要的營養，進而維持生存能力，腫瘤的發生發展過程中存在著多種代謝相關基因的表達及代謝異常[12]。正常細胞代謝是通過線粒體氧化磷酸化及三羧酸循環分解葡萄糖來獲得能量，而腫瘤細胞則是通過糖酵解途徑分解葡萄糖[13]。研究[14]表明，脂質代謝異常是腫瘤發生發展的主要原因。Mika 等[15]研究表明，結腸癌組織中脂質成分發生多種變化，可能發生脂質代謝的重編程。ABHD5 是甘油三酯脂肪酶的輔酶，能夠將細胞內的甘油三酯分解為甘油二酯和游離脂肪酸，其在人類結腸癌細胞中表達量顯著降低且與惡性特征呈負相關[6]。本研究利用 UALCAN 數據庫分析 ABHD5 在結腸癌中的表達及其與結腸癌患者臨床病理特征間的關系，結果表明，ABHD5 在結腸癌組織中的表達低于正常結腸組織，且 ABHD5 的表達與結腸癌的組織學類型有關，提示 ABHD5 可能與結腸癌的發生有關。Liang 等[8]研究表明，ABHD5 缺乏會促進巨噬細胞中核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族吡啉結構域蛋白 3 炎性體的活化，誘導巨噬細胞代謝重編程，進而促進肺癌的發展。本研究以質粒 pcDNA3.1 為表達載體，體外構建 pcDNA3.1-ABHD5 重組質粒，將其轉染至 HCT116 細胞中，結果表明轉染后 HCT116 細胞發出綠色熒光；qRT-PCR 結果表明 ABHD5 轉染組 HCT116 細胞 ABHD5 mRNA 相對表達量高于對照組和陰性轉染組（P<0.05），表明細胞轉染成功，可以用于后續實驗。本研究對轉染后 HCT116 細胞進行檢測，結果表明 ABHD5 轉染組 HCT116 細胞增殖抑制率高于對照組和陰性轉染組（P<0.05），表明 ABHD5 能夠抑制 HCT116 細胞的增殖。
腫瘤侵襲和遷移是導致腫瘤惡化的主要因素，復發和轉移是結腸癌患者死亡的主要原因，同時也是影響患者預后及治療的關鍵因素。Shang 等[16]研究表明，與非遷移性巨噬細胞比較，遷移的巨噬細胞 ABHD5 含量較低，且巨噬細胞 ABHD5 的缺乏會導致核因子кB p65 依賴的 MMP 水平的升高。本研究結果表明，與對照組及陰性轉染組比較，ABHD5 轉染組 HCT116 細胞的侵襲和遷移數目減少（P<0.05），侵襲蛋白 MMP-9 的表達降低（P<0.05），表明 ABHD5 能夠抑制 HCT116 細胞的侵襲和遷移。上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在細胞發育過程中有重要作用，與細胞的轉移、侵襲及腫瘤的發生有關[17]。E-cadherin 蛋白屬于鈣黏附蛋白，是上皮細胞標志物，Snail 蛋白是 EMT 過程中 E-cadherin 的關鍵轉錄抑制因子。有研究[18]表明，結直腸癌患者 E-cadherin 蛋白與 Snail 蛋白表達呈負相關。本研究結果表明，ABHD5 轉染組 HCT116 細胞的 E-cadherin 蛋白相對表達量高于對照組和陰性轉染組（P<0.05），而 Snail 蛋白的相對表達量低于對照組和陰性轉染組（P<0.05），提示 ABHD5 可能通過影響 EMT 的發生，進而抑制結腸癌細胞的侵襲和遷移。
AMPK 是一種進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞中充當能量傳感器，能夠影響細胞的分解代謝和合成代謝[19]。AMPK 活性受細胞內 AMP/ATP 比例的調控，AMPK 能夠抑制消耗 ATP 的合成代謝過程，促進 ATP 的分解代謝過程，調節細胞內能量平衡。mTOR 能夠整合上游多種信號通路、調節細胞生長，與多種疾病的發病機制有關。Li 等[20]研究表明，在胰腺癌中丙酮酸脫氫酶磷酸酶 1 下調 AMPK 的表達，激活 mTOR，導致胰腺癌細胞的增殖和侵襲，促進胰腺癌的進展。Bu 等[21]研究表明，冬凌草素能夠上調結腸癌 DLD-1 細胞的 p-AMPK 表達水平，下調 p-mTOR 的水平，通過激活 AMPK/mTOR 信號通路促進結腸癌 DLD-1 細胞的凋亡。本研究結果表明，ABHD5 轉染組 HCT116 細胞 p-AMPK/AMPK 蛋白相對表達量升高，p-mTOR/mTOR 蛋白相對表達量降低（P<0.05），提示 ABHD5 可能通過磷酸化 AMPK 進而抑制 mTOR 的表達，從而在抑制結腸癌發展過程中發揮作用。
綜上所述，ABHD5 過表達能夠抑制結腸癌細胞的侵襲和遷移，可能影響 AMPK/mTOR 信號通路進而影響結腸癌發生發展過程中的細胞增殖，可能是結腸癌治療的潛在靶標。但本研究僅通過細胞實驗就 ABHD5 對結腸癌的影響進行了分析，體外環境與體內環境存在一定的差異性，因此下一步還需在臨床水平上檢測 ABHD5 對結腸癌的影響，進一步探討 ABHD5 在抑制結腸癌發展中的作用。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：趙帥華負責數據整理與文章撰寫；董衛紅負責實驗設計和數據整理；楊敬負責收集資料、參與論文撰寫；韓保衛負責指導研究。
結腸癌是一種常見的惡性消化道腫瘤，具有較高的發病率和致死率，嚴重威脅人類健康和生命[1]。結腸癌發生發展過程中多種代謝相關基因出現異常表達或活性發生改變[2-3]，然而具體機制并不清楚。脂質代謝不僅能夠調節細胞生長、凋亡、運動、膜穩態等生物學過程，與機體化療反應、腫瘤免疫、耐藥等也有關[4]。脂質代謝異常與結腸癌的發生發展有關[5]，含自水解酶域蛋白 5（alpha/beta hydrolase domain-containing protein 5，ABHD5）是一個重要的抑癌基因，也是一種脂肪代謝基因。研究表明，ABHD5 能夠抑制結腸癌[6]、子宮內膜癌[7]、肺癌[8]等癌細胞的生長。單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK） 是一種進化保守的蛋白激酶，在調節細胞能量平衡過程中發揮重要作用，與細胞增殖、分化等多種生物學過程有關[9]。雷帕霉素靶體蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，mTOR 信號傳導能夠調節葡萄糖、核苷酸、脂肪酸和脂質的代謝，與腫瘤細胞的生長和新陳代謝有關[10]。研究[11]表明，山楂酸能夠通過激活 AMPK 并負調控 mTOR 途徑，進而抑制結腸癌細胞的增殖和遷移。目前對結腸癌中 ABHD5 與 AMPK/mTOR 通路之間的關系還少有研究。因此，本研究通過體外培養結腸癌細胞，并轉染 ABHD5 重組質粒，探討 ABHD5 過表達對結腸癌細胞侵襲、遷移以及 AMPK/mTOR 通路的影響，為結腸癌發病機制的研究提供參考。
1 材料與方法
1.1 主要材料與試劑
人結腸癌細胞株 HCT116，購自通派（上海）生物科技有限公司；RNAiso Plus 試劑盒（9108）、反轉錄試劑盒（639547）和實時熒光定量 PCR （qRT-PCR）試劑盒（RR820Q），購于日本 TaKaRa 公司；Lipofectamine 2000 試劑盒（11668-027），購于 Invitrogen 公司；胎牛血清、青霉素-鏈霉素、RPMI 1640 培養基和消化胰酶（貨號：10099、15070063、61870036、25200056）購自美國 Gibco 公司；基質金屬蛋白酶 9（matrix metalloprotein 9，MMP-9；13667）、E-鈣黏附蛋白（E-cadherin，3195）、Snail（3879）、p-AMPK（4370）、AMPK（4695）、p-mTOR（5536）、mTOR（2972）和 GAPDH（5174）單抗，購自美國 Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶標記二抗（A0208）、蛋白提取試劑盒（P0033）、BCA 蛋白定量試劑盒（P0012）和 細胞計數試劑盒（cell counting Kit-8，CCK-8 ；C0037），購自南通碧云天生物技術公司；酶標儀和蛋白凝膠成像儀，購自美國 ThermoFisher 公司；流式細胞儀，購自美國貝克曼庫爾特公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 數據庫分析 ABHD5 在結腸癌中的表達
UALCAN 數據庫（
1.2.2 細胞培養
取 1 mL 凍存 HCT116 細胞株 37 ℃ 解凍，轉移至離心管中，加入 9 mL RPMI 1640 培養基，混勻，1 000 r/min（離心半徑 13.5 cm）離心 5 min，棄上清，加入含有 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素-鏈霉素的 RPMI 1640 培養基中，37 ℃、5% CO2 培養箱中培養傳代。
1.2.3 質粒轉染
取 1.2.2 中處于對數期的 HCT116 細胞，調整細胞濃度為 5×105 個/mL，制備單細胞懸液。利用 Lipofectamine 2000 試劑盒將轉染試劑、轉染空質粒 pcDNA3.1 和轉染重組質粒 pcDNA3.1-ABHD5 分別轉染至 HCT116 細胞，并分別命名為對照組、陰性轉染組和 ABHD5 轉染組。采用 PCR 對 pcDNA3.1-ABHD5 中 ABHD5 片段進行擴增，上游引物序列為 5′ -CCCAAGCTTATGGCGGCGG-AGGAGGAG-3′ ，下游引物序列為 5′ -CCGGAATTC-TCAGTCCACAGTGTCGCAGAT-3 ′ 。轉染后將細胞置于 37 ℃、5% CO2 培養箱中培養 48 h，收集細胞上清。倒置顯微鏡觀察 HCT116 細胞，細胞發出綠色熒光即為轉染成功。
1.2.4 qRT-PCR 法檢測各組細胞中 ABHD5 mRNA 表達
利用 RNAiso Plus 試劑盒提取各組細胞中 RNA，反轉錄試劑盒對提取的 RNA 進行反轉錄成 cDNA，之后進行 qRT-PCR 反應，反應條件為預變性 95 ℃ 60 s，變性 95 ℃ 30 s，退火 60 ℃ 45 s，延伸 72 ℃ 30 s，共計 40 個循環。以 GAPDH 作為內參基因，采用 2?ΔΔCt 法計算各組細胞中 ABHD5 mRNA 的相對表達量。其中 ABHD5 上游引物序列為 5′ -AAGCTTAT-GGCCGGTGCCACCGCCGTC-3′ ，下游引物序列為5′ -GGATCCTCAGTCCACAGAATCACAG-3′ ；GAPDH 上游引物序列為 5′ -AATCCCATCACCATCTTC-3′ ，下游引物序列為5′ -AGGCTGTTGTCATACTTC-3′ 。
1.2.5 CCK-8 法檢測細胞增殖
取 1.2.3 中轉染后的 HCT116 細胞，細胞濃度調整為 1×105 個/mL，制備單細胞懸液；將細胞懸液加至 96 孔中，100 μL/孔，每組設置 6 個復孔，同時設置空白孔（僅添加細胞培養液），37 ℃、5% CO2 培養箱中分別培養 48 h 后，加入 10 μL CCK-8 試劑，37 ℃ 避光培養 2 h，棄上清，酶標儀 450 nm 波長處檢測每孔吸光度值（A 值），計算細胞增殖抑制率=［（對照組 A 值–實驗組 A 值）/對照組 A 值］×100%。
1.2.6 Transwell 法檢測細胞侵襲、遷移能力
① 細胞侵襲實驗：取 1.2.3 中轉染后培養 48 h 的 HCT116 細胞，調整細胞濃度為 1×105 個/mL，接種于鋪有基質膠（Matrigel）的 Transwell 小室上室，下室加入 600 μL 含胎牛血清的 RPMI 1640 培養液，每組設置 3 個重復，每個重復設置 3 個復孔；細胞于 37 ℃ 培養 24 h，倒掉上室培養液，棉簽將未遷移細胞以及 Matrigel 膠輕輕擦去，無水甲醇固定 30 min；0.1% 結晶紫溶液染色 20 min，顯微鏡下隨機選取 5 個視野對染色細胞進行計數，計算平均值。② 細胞遷移實驗：Transwell 小室上室不加 Matrigel 膠，后續步驟同細胞侵襲實驗。
1.2.7 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達情況
取 1.2.3 中轉染培養 48 h 的 HCT116 細胞，每組設置 3 個重復，每個重復設置 3 個復孔。用蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白；BCA 試劑盒對總蛋白濃度進行測定；制備十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 分離膠，蛋白樣品與緩沖液混合，加熱變性，進行 SDS-PAGE；電泳結束后將蛋白轉至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉遮光封閉 2 h；分別加入一抗稀釋液（MMP-9、E-cadherin、Snail、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、GAPDH），稀釋比均為 1∶1 000，4 ℃ 孵育過夜；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-Hcl）+Tween（TBST）緩沖液洗膜 3 次，加入辣根過氧化物酶標記二抗稀釋液（1∶1 000），室溫孵育 1 h，TBST 洗膜 3 次。蛋白凝膠成像儀分析蛋白表達水平。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 25.0 進行數據統計分析。計量數據通過 K-S 法檢驗，符合正態分布者采用均數±標準差（）表示，多組間比較采用完全隨機設計資料的單因素方差分析，組間兩兩比較采用 SNK-q 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 ABHD5 在結腸癌及正常結腸組織中的表達情況
UALCAN 數據庫分析結果表明，與正常結腸組織比較，結腸癌組織中 ABHD5 mRNA的相對表達量降低（P<0.05），見圖 1a。
圖1
示 ABHD5 mRNA 在結腸癌組織及正常結腸組織中的表達及其與結腸癌臨床病理特征間的關系（UALCAN 數據庫）
a：ABHD5 mRNA 在結腸癌組織及正常結腸組織中的表達，正常
2.2 ABHD5 的表達與結腸癌臨床病理特征間的關系
UALCAN 數據庫分析結果表明，結腸癌組織中 ABHD5 mRNA 的相對表達量在不同年齡、性別、種族、腫瘤分期和淋巴結轉移 N0 與 N2 期以及 N1 與 N2 期間比較差異均無統計學意義（P>0.05），其在腺癌和N1 分期中分別低于黏液腺癌及 N0 分期（P<0.05），見圖 1b-1g。
2.3 轉染細胞株鑒定結果
轉染 48 h 后，轉染后的 HCT116 細胞發出綠色熒光，提示轉染成功（圖 2）。
圖2
示倒置顯微鏡下觀察暗場（a）和熒光場（b）ABHD5 轉染組 HCT116 細胞轉染效果（GFP 熒光染色 ×50）
2.4 qRT-PCR 法檢測轉染后 HCT116 細胞 ABHD5 mRNA 的表達結果
與對照組和陰性轉染組比較，ABHD5 轉染組的 ABHD5 mRNA 相對表達量升高（P<0.05），見表 1。
表1
各組 HCT116 細胞的 ABHD5 mRNA 相對表達量、增殖抑制率及侵襲和遷移情況檢測結果（）
2.5 CCK-8 法檢測轉染后 HCT116 細胞增殖情況
細胞轉染 48 h 后，與對照組和陰性轉染組比較，ABHD5 轉染組 HCT116 細胞增殖抑制率明顯升高（P<0.05），見表 1。
2.6 Transwell 法檢測轉染后 HCT116 細胞侵襲和遷移情況
與對照組和陰性轉染組比較，ABHD5 轉染組 HCT116 細胞的遷移和侵襲細胞數目減少（P<0.05），見表 1 和圖 3。
圖3
示 3 組 HCT116 細胞的侵襲和遷移情況（a，結晶紫染色 ×200）以及各蛋白表達情況（b）
2.7 轉染后 HCT116 細胞的 MMP-9、E-cadherin 和 Snail 蛋白表達檢測結果
與對照組和陰性轉染組比較，ABHD5 轉染組 HCT116 細胞的 MMP-9 及 Snail 蛋白相對表達量降低，而 E-cadherin 蛋白相對表達量升高（P<0.05），見圖 3 和表 2。
表2
3 組 HCT116 細胞各蛋白相對表達量（，n=9）
2.8 轉染后 HCT116 細胞 AMPK、mTOR 通路蛋白表達檢測結果
與對照組和陰性轉染組比較，ABHD5 轉染組 HCT116 細胞的 p-AMPK/AMPK 蛋白相對表達量升高，而 p-mTOR/mTOR 蛋白相對表達量降低（P<0.05），見圖 3 和表 2。
3 討論
細胞代謝重編程在腫瘤細胞生長中具有重要作用，腫瘤細胞代謝能夠從營養缺乏環境中獲取必要的營養，進而維持生存能力，腫瘤的發生發展過程中存在著多種代謝相關基因的表達及代謝異常[12]。正常細胞代謝是通過線粒體氧化磷酸化及三羧酸循環分解葡萄糖來獲得能量，而腫瘤細胞則是通過糖酵解途徑分解葡萄糖[13]。研究[14]表明，脂質代謝異常是腫瘤發生發展的主要原因。Mika 等[15]研究表明，結腸癌組織中脂質成分發生多種變化，可能發生脂質代謝的重編程。ABHD5 是甘油三酯脂肪酶的輔酶，能夠將細胞內的甘油三酯分解為甘油二酯和游離脂肪酸，其在人類結腸癌細胞中表達量顯著降低且與惡性特征呈負相關[6]。本研究利用 UALCAN 數據庫分析 ABHD5 在結腸癌中的表達及其與結腸癌患者臨床病理特征間的關系，結果表明，ABHD5 在結腸癌組織中的表達低于正常結腸組織，且 ABHD5 的表達與結腸癌的組織學類型有關，提示 ABHD5 可能與結腸癌的發生有關。Liang 等[8]研究表明，ABHD5 缺乏會促進巨噬細胞中核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族吡啉結構域蛋白 3 炎性體的活化，誘導巨噬細胞代謝重編程，進而促進肺癌的發展。本研究以質粒 pcDNA3.1 為表達載體，體外構建 pcDNA3.1-ABHD5 重組質粒，將其轉染至 HCT116 細胞中，結果表明轉染后 HCT116 細胞發出綠色熒光；qRT-PCR 結果表明 ABHD5 轉染組 HCT116 細胞 ABHD5 mRNA 相對表達量高于對照組和陰性轉染組（P<0.05），表明細胞轉染成功，可以用于后續實驗。本研究對轉染后 HCT116 細胞進行檢測，結果表明 ABHD5 轉染組 HCT116 細胞增殖抑制率高于對照組和陰性轉染組（P<0.05），表明 ABHD5 能夠抑制 HCT116 細胞的增殖。
腫瘤侵襲和遷移是導致腫瘤惡化的主要因素，復發和轉移是結腸癌患者死亡的主要原因，同時也是影響患者預后及治療的關鍵因素。Shang 等[16]研究表明，與非遷移性巨噬細胞比較，遷移的巨噬細胞 ABHD5 含量較低，且巨噬細胞 ABHD5 的缺乏會導致核因子кB p65 依賴的 MMP 水平的升高。本研究結果表明，與對照組及陰性轉染組比較，ABHD5 轉染組 HCT116 細胞的侵襲和遷移數目減少（P<0.05），侵襲蛋白 MMP-9 的表達降低（P<0.05），表明 ABHD5 能夠抑制 HCT116 細胞的侵襲和遷移。上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在細胞發育過程中有重要作用，與細胞的轉移、侵襲及腫瘤的發生有關[17]。E-cadherin 蛋白屬于鈣黏附蛋白，是上皮細胞標志物，Snail 蛋白是 EMT 過程中 E-cadherin 的關鍵轉錄抑制因子。有研究[18]表明，結直腸癌患者 E-cadherin 蛋白與 Snail 蛋白表達呈負相關。本研究結果表明，ABHD5 轉染組 HCT116 細胞的 E-cadherin 蛋白相對表達量高于對照組和陰性轉染組（P<0.05），而 Snail 蛋白的相對表達量低于對照組和陰性轉染組（P<0.05），提示 ABHD5 可能通過影響 EMT 的發生，進而抑制結腸癌細胞的侵襲和遷移。
AMPK 是一種進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞中充當能量傳感器，能夠影響細胞的分解代謝和合成代謝[19]。AMPK 活性受細胞內 AMP/ATP 比例的調控，AMPK 能夠抑制消耗 ATP 的合成代謝過程，促進 ATP 的分解代謝過程，調節細胞內能量平衡。mTOR 能夠整合上游多種信號通路、調節細胞生長，與多種疾病的發病機制有關。Li 等[20]研究表明，在胰腺癌中丙酮酸脫氫酶磷酸酶 1 下調 AMPK 的表達，激活 mTOR，導致胰腺癌細胞的增殖和侵襲，促進胰腺癌的進展。Bu 等[21]研究表明，冬凌草素能夠上調結腸癌 DLD-1 細胞的 p-AMPK 表達水平，下調 p-mTOR 的水平，通過激活 AMPK/mTOR 信號通路促進結腸癌 DLD-1 細胞的凋亡。本研究結果表明，ABHD5 轉染組 HCT116 細胞 p-AMPK/AMPK 蛋白相對表達量升高，p-mTOR/mTOR 蛋白相對表達量降低（P<0.05），提示 ABHD5 可能通過磷酸化 AMPK 進而抑制 mTOR 的表達，從而在抑制結腸癌發展過程中發揮作用。
綜上所述，ABHD5 過表達能夠抑制結腸癌細胞的侵襲和遷移，可能影響 AMPK/mTOR 信號通路進而影響結腸癌發生發展過程中的細胞增殖，可能是結腸癌治療的潛在靶標。但本研究僅通過細胞實驗就 ABHD5 對結腸癌的影響進行了分析，體外環境與體內環境存在一定的差異性，因此下一步還需在臨床水平上檢測 ABHD5 對結腸癌的影響，進一步探討 ABHD5 在抑制結腸癌發展中的作用。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：趙帥華負責數據整理與文章撰寫；董衛紅負責實驗設計和數據整理；楊敬負責收集資料、參與論文撰寫；韓保衛負責指導研究。
