引用本文： 劉宇, 張洪偉, 楊鵬, 黃堯, 盧晨, 張煜, 胡佳. 神經纖毛蛋白-1 在大鼠血管平滑肌細胞增殖遷移中的功能作用和潛在機制研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2021, 28(7): 849-857. doi: 10.7507/1007-4848.202005091 復制
由于人口老齡化及心血管病危險因素的加劇，我國冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的患病率及死亡率整體呈現逐年上升的趨勢[1]。對于合并多支冠狀動脈病變的患者，冠狀動脈旁路移植術是其首選治療方法[2]。但約有 30%～40% 的靜脈橋會在術后 1 年內失效，高達 70% 的靜脈橋在 10 年后將完全閉塞，嚴重影響患者的生活質量和遠期生存[2]。
新生內膜增生（neointimal hyperplasia，NIH）及進行性粥樣硬化是冠狀動脈旁路移植術后靜脈橋中遠期失效的中心環節[3-8]。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖和內向性遷移是 NIH 的關鍵因素[3-8]。因此，負向調控 VSMCs 的增殖遷移，可有效抑制 NIH 及靜脈橋增殖性重構[8-10]。
血管損傷及血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）等生長因子和細胞因子的刺激，可促使 VSMCs 發生表型轉換及增殖遷移[3-4, 11-13]。研究[12-14]發現，神經纖毛蛋白-1（neuropilin-1，NRP1）的表達上調與 PDGF 誘導的人和大鼠的 VSMCs 增殖遷移密切相關。但是，NRP1 在 VSMCs 生物學功能中的作用及相關調控機制尚未闡述清楚。本研究將通過 NRP1 基因干擾腺病毒靶向抑制 NRP1 在大鼠 VSMCs 中的表達，探究 NRP1 在大鼠 VSMCs 增殖、凋亡和遷移中的功能作用以及其可能介導的相關下游信號傳導通路，初步探討 NRP1 在靜脈橋增殖重構進程中的潛在作用。
1 材料與方法
1.1 細胞來源
本實驗所用大鼠 VSMCs：型號 A7r5，購置于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫（來源于美國 ATCC 公司，保持了原有細胞的基本生物學特性）。
1.2 主要實驗試劑
主要實驗試劑包括：NRP1 兔來源單克隆抗體（Abcam，英國）、胎牛血清（BioInd，以色列）、DMEM 培養基（Thermo Fisher，美國）、DMSO（Sigma，美國）、CCK-8 試劑盒（MCE，美國）、PBS（北京索萊寶）、PDGF-BB（Peprotech，#100-14B，美國）、蛋白上樣指示劑（BIO-RAD，美國）、PVDF 膜（Millipore，美國）、RIPA 細胞/組織高效裂解液（北京索萊寶）及 Annexin V/PI 凋亡檢測試劑盒（北京四正柏）。
1.3 主要實驗器材
細胞培養箱（BINDER，美國）、脫色搖床（OHAUS，美國）、酶標儀（Bio TEX，美國）、電泳儀（BIO-RAD，美國）、化學成像系統（BIO-RAD，美國）、熒光定量 PCR 儀（BIO-RAD，美國）、流式分析儀（Beckman Coulter，Navios，美國）、倒置熒光顯微鏡（ZEISSm，OBSERVER D1，德國）、圖像采集系統（ZEISS，AX10 cam HRC，德國）。
1.4 研究方法
1.4.1 NRP1 基因靶向干擾腺病毒的構建
委托上海吉凱基因化學技術有限公司完成。登錄美國 Gene Bank 數據庫（網址
1.4.2 大鼠 VSMCs 鑒定
采用 STR 多重熒光試劑盒對樣品 DNA 進行擴增，然后使用 DNA 分析儀（Applied Biosystems）對 PCR 產物進行分析比對以排除大鼠 VSMCs 細胞被人源細胞交叉污染；通過對樣品的 COX-1 基因進行擴增與電泳測試，獲取基因條帶，根據 COX-1 條帶大小判斷物種來源；制作大鼠 VSMCs 細胞爬片，通過免疫組化檢測平滑肌細胞標志物 α-SMA 來確證該細胞系是否是平滑肌細胞。
1.4.3 檢測大鼠 VSMCs 中 NRP1 的表達情況
1.4.3.1 實時熒光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）測定大鼠 VSMCs 中 NRP1 的表達
細胞 RNA 采用 Magen 公司的 RaPure Total RNA Kit（單柱法）試劑盒進行提取。將提取到的總 RNA 逆轉錄合成 cDNA，逆轉錄體系中 RNA 的體積根據 RNA 濃度計算：需要的 RNA 質量/濃度，20 μL 逆轉錄體系中，SYBR Green qPCR 最多可使用 1 μg 總 RNA；在冰上配置去基因組 DNA 反應混合液；42℃ 反應 2 min，去除基因組 DNA；再在冰上配制逆轉錄反應混合液；瞬時離心，普通 PCR 儀進行逆轉反應生成 cDNA（反應條件：37℃ 15 min、85℃ 5 s），所得 cDNA 于–20℃ 冰箱保存。使用 Primer Premier 6 軟件設計 qPCR 引物序列，在 NCBI Primer-BLAST 中驗證，使用 β-actin 作內參基因，配制 qPCR 反應混合物 10 μL，瞬時離心，熒光定量 PCR 儀上機檢測，利用 BIO-RAD iQ 5 軟件進行分析。確定 Ct 值，并計算 ΔCt 值（目標基因 Ct 值–內參 β-actin 的 Ct 值）。再計算 ΔΔCt（實驗組 ΔCt–對照組 ΔCt），再以 2ΔΔCt 計算相對拷貝數。相同基因 ΔΔCt 越大，相對拷貝數就越低，基因表達量就越低。
1.4.3.2 WB 測定大鼠 VSMCs 中 NRP1 的表達
將培養瓶或 6 孔板放在冰塊上，用預冷 PBS 洗滌細胞 2～3 次，吸干 PBS 后，再加入預冷的 RIPA，使用細胞刮將貼壁的細胞從培養瓶壁刮下，然后將懸液轉移至新預冷 EP 管，冰上放置 30 min，每 10 min 振蕩一次，4℃ 預冷離心機中 13 000 rpm 離心 15～20 min，取出 EP 管置于冰上，吸出上清液到預冷的新管中，棄去沉淀。將提取到的細胞蛋白按照碧云天 BCA 試劑盒說明進行蛋白濃度的測定，經過 SDS-PAGE 電泳和轉模后進行抗體結合和檢測。
1.4.4 實驗分組
（1）陰性對照腺病毒（Ad.NC）組 在含 10%FBS 的 DMEM 培養的大鼠 VSMCs 中，轉染不含基因序列的陰性對照腺病毒。
（2）NRP1 干擾腺病毒（Ad.shNRP1）組 在含 10%FBS 的 DMEM 培養的大鼠 VSMCs 中，轉染負載 NRP1-shRNA 的腺病毒。
將長勢良好的 VSMCs 接種到培養皿中，待細胞融合達到 50% 時給予最佳稀釋度的腺病毒進行轉染。培養皿置于 37℃、5% CO2 的培養箱中孵育，病毒轉染 48 h 后，細胞重新計數鋪板，通過 qPCR 和 WB 檢測 NRP1 表達情況，并分別進行細胞增殖活力、凋亡及遷移能力等檢測。
1.4.5 CCK-8 檢測細胞增殖活力
兩組細胞的增殖活力采用 CCK-8（cell counting kit-8）試劑進行檢測，其試劑中含有的 2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽，能被線粒體中的酶還原為高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazan dye），而黃色甲瓚產物的量與活細胞數量成正相關。
1.4.6 流式細胞術檢測細胞凋亡情況
取病毒轉染后 48 h 的 VSMCs，細胞重懸計數后接種于 6 孔板，培養 48 h 后將 VSMCs 制成細胞懸液，充分混勻后 2 000 rpm 離心 5 min，棄上清液。加入 100 μL Binding Buffer 重懸細胞，然后加入 2 μL Annexic V-APC 混勻，再加入 1 μL PI，輕輕混勻后避光室溫孵育 15 min，再補加 200 μL Binding Buffer，40 μm 濾網過濾后，進行流式檢測。
1.4.7 Transwell 檢測細胞遷移能力
取病毒轉染 48 h 后的細胞重懸，每個 Transwell 小室加入 5×104個細胞。上室為無血清 DMEM 培養基 200 μL，下室加入含 10% FBS 的完全 DMEM 培養基 600 μL，注意小室底部不可有氣泡。繼續培養 48 h 后取出細胞，取出小室后首先需擦除里面的細胞及液體，然后在下室中加入甲醇 600 μL 固定 30 min，風干，再用結晶紫染色液 600 μL 染色 20 min 后用 PBS 洗滌后晾干。顯微鏡下計數 3 個不同視野中穿過膜的細胞數，并計算平均值，若細胞數較少時可全部計數。
為了探索 NRP1 在大鼠 VSMCs 中可能通過哪些信號通路發揮作用，我們挑選了 PI3K/Akt、MAPK/ERK 和 NF-κB 這 3 條 VSMCs 增殖遷移過程中的經典信號通路進行研究。靶向干擾大鼠 VSMCs 中 NRP1 的表達后，分別檢測其下游 Akt、ERK1/2 及 NF-κB 通路蛋白磷酸化和總表達水平的變化，推測 NRP1 在大鼠 VSMCs 中發揮作用可能介導的信號通路。
1.5 統計學分析
應用 SPSS 19.0 統計軟件（SPSS Inc，Chicago，IL，美國）進行數據統計分析，GraphPad Prism 6 軟件（GraphPad Inc，La Jolla，CA，美國）作圖。數據以均數±標準差（
±s）表示，兩組之間比較使用獨立樣本 t 檢驗，多組之間比較則采用單因素方差分析。P≤0.05 表示差異有統計學意義。
1.6 倫理審查
本研究已通過四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會審查通過，批準號：2018103A。
2 結果
2.1 大鼠 VSMCs 鑒定結果
本研究中所使用的細胞在 STR 圖譜中未檢測到擴增峰，表明未受到人源細胞污染（圖1a）。
圖1
大鼠血管平滑肌細胞鑒定結果
a：STR 基因分型圖譜；b：COX-1 基因電泳圖譜（條帶位于 196bp 處，常見物種 COX-1 基因大小：人類 391bp；恒河猴 287bp；長尾猴 222bp；牛 102bp；犬 172bp；大鼠 196bp；小鼠 150bp；倉鼠 315bp；昆蟲 70bp）；c：免疫組化結果，紅色為 α-SMA 蛋白，藍色為 DAPI 染色的細胞核（20×10 倍）
在 COX-1 基因電泳中，將僅有的位于 196bp 的條帶與常見物種 COX-1 基因大小進行對比，提示本研究所使用的細胞來源于大鼠并且不存在物種污染（圖1b）。
細胞免疫組化結果顯示 VSMCs 標志物 α-SMA 陽性表達，進一步證實本研究所使用的細胞為未受污染的大鼠 VSMCs（圖1c）。
2.2 PDGF 及腺病毒的濃度選擇
分別使用 0 ng/mL，15 ng/mL 和 30 ng/mL 的 PDGF-BB 誘導大鼠 VSMCs，通過 qPCR 和 WB 檢測發現，在基因轉錄和翻譯兩種水平，NRP1 在大鼠 VSMCs 中的表達均隨著 PDGF 的誘導劑量逐漸增高，提示 PDGF 能夠促進 NRP1 的表達（圖2a）。因此，我們采用 30 ng/mL 的 PDGF-BB 進行后續研究。
圖2
PDGF 及腺病毒的濃度選擇
a：大鼠 VSMCs 中 NRP1 在不同濃度 PDGF 誘導下的表達情況（*：與 0 ng/mL 組比較，
使用構建的腺病毒感染大鼠 VSMCs，病毒轉染后 48 h，采用流式細胞術檢測 VSMCs 的存活率及熒光表達率。研究發現（圖2b），在腺病毒 10–3稀釋度下，VSMCs 的存活率為 85.4%，標記腺病毒的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達率為 93.4%；而在病毒 10-4稀釋度下，VSMCs 存活率為 92.1%，GFP 表達率為 91.7%。綜合評估得出腺病毒在 10-3稀釋度下，對 VSMCs 可達到最佳的轉染效果，遂以此稀釋度下的病毒濃度進行后續實驗。
2.3 腺病毒成功轉染大鼠 VSMCs
熒光顯微鏡下可以看到 NRP1-shRNA 腺病毒和陰性對照腺病毒均成功轉染 VSMCs（圖3a）。通過流式細胞術檢測觀察到兩組 GFP 表達率均達到 80%，病毒轉染效率未見明顯差別，滿足細胞功能及機制研究的要求（圖3b）。
圖3
腺病毒成功轉染大鼠血管平滑肌細胞
a：熒光顯微鏡下觀察腺病毒在大鼠 VSMCs 中轉染效率（20×10 倍）；b：流式細胞術檢測腺病毒在大鼠 VSMCs 中轉染效率
2.4 NRP1 基因靶向干擾腺病毒抑制大鼠 VSMCs 中 NRP1 的表達
通過 qPCR 及 WB 檢測，NRP1 基因靶向干擾腺病毒轉染大鼠 VSMCs 后，在基因及蛋白水平，NRP1 的表達均被顯著抑制（圖4）。
圖4
靶向干擾腺病毒抑制 NRP1 在血管平滑肌細胞中的表達
*：與 Ad.NC 組比較，
2.5 下調 NRP1 表達對大鼠 VSMCs 增殖活力的影響
在探究 NRP1 對大鼠 VSMCs 具體生物學功能的影響時，首先采用 CCK-8 實驗檢測增殖活力的變化，結果顯示在 24 h、48 h 和 72 h 時，Ad.NRP1 組細胞的增殖活力較 Ad.NC 組均有明顯降低（圖5），提示 NRP1 表達下調可以抑制大鼠 VSMCs 的增殖活力。
圖5
CCK-8 檢測 NRP1 表達下調對大鼠血管平滑肌細胞增殖的影響
*：與 Ad.shNRP1 組比較，
2.6 下調 NRP1 表達對大鼠 VSMCs 凋亡的影響
為了研究下調 NRP1 表達對大鼠 VSMCs 凋亡的影響，我們采用了 Annexin V-APC/PI 雙染法流式細胞術檢測凋亡百分比，結果顯示 Ad.NRP1 組細胞凋亡百分比顯著高于 Ad.NC 組（圖6），表明下調 NRP1 表達促進了大鼠 VSMCs 的凋亡。
圖6
流式細胞術檢測下調 NRP1 表達對大鼠血管平滑肌細胞凋亡的影響
a：凋亡細胞的流式散點圖分析；b：細胞凋亡百分比對比；*：與 Ad.NC 組比較，
2.7 下調 NRP1 表達對大鼠 VSMCs 遷移能力的影響
在檢測了抑制 NRP1 表達對大鼠 VSMCs 增殖和凋亡的影響之后，進一步采用 Transwell 實驗檢測遷移能力的變化，結果顯示 Ad.NRP1 組遷移至小室膜外表面的細胞數明顯少于 Ad.NC 組（圖7），提示下調 NRP1 表達可以顯著抑制大鼠 VSMCs 的遷移。
圖7
Transwell 檢測下調 NRP1 表達對大鼠血管平滑肌細胞遷移的影響（20×10 倍）
a：顯微鏡下觀察Transwell小室聚碳酸酯膜外表面的細胞；b：單個顯微鏡視野下遷移的細胞數量對比；*：與 Ad.NC 組比較，
2.8 下調 NRP1 表達對其下游信號通路蛋白表達的影響
為了探究 NRP1 在大鼠 VSMCs 中發揮生物學效應可能介導的下游信號通路，我們挑選了 PI3K/Akt、MAPK/ERK 和 NF-κB 這 3 條 VSMCs 增殖遷移過程中的經典信號通路進行研究。采用 WB 檢測 NRP1 下調后下游信號通路蛋白表達情況，結果顯示 p-Akt 和 p-NF-κB 明顯下降，而 t-Akt、t-NF-κB、t-ERK1/2 和 p-ERK1/2 無顯著變化，說明抑制 NRP1 表達可以同時抑制其下游 PI3K/Akt 及 NF-κB 信號通路激活，但對 MAPK/ERK 信號通路無明顯影響。結果提示 NRP1 在大鼠 VSMCs 中可通過介導下游 PI3K/Akt 及 NF-κB 信號通路發揮作用（圖8）。
圖8
WB 檢測下調 NRP1 表達對大鼠血管平滑肌細胞下游信號通路蛋白表達的影響
3 討論
本研究發現，PDGF 可誘導大鼠 VSMCs 中 NRP1 表達上調，使用腺病毒 shRNA 靶向干擾 NRP1 在 VSMCs 中的表達，可顯著抑制 PDGF 誘導的 VSMCs 增殖、遷移并促進細胞凋亡，表明 NRP1 對 VSMCs 的增殖與遷移具有重要的促進作用。同時，下調 NRP1 表達后，Akt 及 NF-κB 信號通路蛋白的磷酸化水平也明顯降低，推測 NRP1 可通過介導下游 PI3K/Akt 及 NF-κB 信號通路積極參與調控 VSMCs 的生物學功能。
中膜 VSMCs 的增殖和遷移是冠狀動脈旁路移植術后靜脈橋增殖重構進程中的關鍵環節[3-8]。靜脈移植術后內皮細胞功能受損導致血小板和白細胞粘附聚集，大量促凝、促炎和生長因子釋放，促使靜脈中膜 VSMCs 由收縮型轉換為合成型，大量增殖并向血管內膜遷移，同時分泌過量的細胞外基質，形成新生內膜，導致靜脈橋管壁增厚發生再狹窄[3-8, 15-16]。在這一進程中，受損的內皮細胞、活化的 VSMCs 以及激活的血小板和巨噬細胞，均能分泌釋放大量 PDGF[4, 17-18]。研究[12-14, 19-20]發現，PDGF 是一種強效的促有絲分裂因子，在 VSMCs 的表型轉換及增殖、遷移過程中發揮了重要的促進作用。而通過抑制 PDGF 的表達或其受體的活化來阻斷 PDGF 信號傳導通路，可有效抑制 VSMCs 過度增殖和內向性遷移，從而減輕血管壁增殖性重構改變[21-24]。
NRP1 是一種多功能的非酪氨酸激酶跨膜糖蛋白，可積極參與 PDGF 介導的信號轉導，在 VSMCs 增殖、遷移和凋亡中發揮重要作用[12-14, 25-26]。本研究發現，NRP1 由 VSMCs 分泌產生，而 PDGF 可誘導其表達上調。Banerjee 等[26]在人體主動脈 VSMCs 中加入 PDGF（50 ng/mL），可刺激 NRP1 在基因和蛋白水平的表達分別增加 2.6 倍和 2.8 倍。研究[12-13]發現，NRP1 在 VSMCs 中可與 PDGF 受體 α（PDGFRα）共定位，而 PDGF-BB 通過與 PDGFRα–NRP1 復合物結合，在人體冠狀動脈和大鼠主動脈 VSMCs 中發揮功能調節作用，而靶向抑制 NRP1 的表達，可干預 PDGF 誘導的 PDGFRα 磷酸化，從而抑制 VSMCs 遷移。因而，有人提出 NRP1 參與 VSMC 的生物學功能，可能主要是由于激活了 PDGF 的信號傳導[12]。然而，Li 等[27]發現無論 PDGF-BB 刺激與否，過表達 MicroRNA-320 均會通過下調 NRP1 表達，抑制 VSMCs 的增殖與遷移。此外，作為 VEGF 的共受體，也有研究[28-29]表明 NRP1 可在 VEGF 介導下促進 VSMCs 遷移。本研究通過 shRNA 靶向抑制 NRP1 表達，不僅顯著抑制了大鼠 VSMCs 的趨化遷移，同時也抑制了 VSMCs 增殖，并促進其凋亡。因而，我們推測 NRP1 表達上調可能會通過促進 VSMCs 的增殖和遷移，加速冠狀動脈旁路移植術后靜脈橋失效。
VSMCs 的增殖與遷移需要通過介導多種復雜的細胞傳導通路完成。PI3K/Akt、MAPK/ERK 及 NF-κB 均是調控 VSMCs 生物學功能的經典信號通路，廣泛參與了靜脈橋增殖重構進程[30-34]。然而，這些通路在 NRP1 介導 VSMCs 增殖、遷移與凋亡的過程中究竟發揮怎樣的作用，目前尚不明確。既往研究[12, 27, 29]發現，不同的生長因子誘導下，NRP1 參與調控 VSMCs 功能所介導的信號通路也不盡相同。Liu 等[29]發現，b-FGF 作為誘導劑刺激人 VSMCs 后，可激活 ERK1/2 及 NF-κB 信號途徑，而對 Akt 的磷酸化卻無影響；反之，特異性抑制 ERK1/2 和 NF-κB 信號通路，可明顯下調 b-FGF 誘導的 VSMCs 中 NRP1 的表達，而 PI3K/Akt 的特異性抑制劑 wortmannin 對 NRP1 的表達并無影響。然而，Banerjee 等[28]的研究卻發現 NRP1 有賴于 PI3K/Akt 途徑參與 VEGF 誘導的人主動脈 VSMCs 遷移。而 Pellet-Many 等[12]發現，在 PDGF 誘導的人冠狀動脈 VSMCs 中敲除 NRP1 基因，ERK1/2 和 Akt 的磷酸化水平沒有降低，提示二者并不參與 NRP1 調控的 VSMCs 遷移。本研究中，靶向干擾 NRP1 在大鼠 VSMCs 中的表達后，可顯著下調 Akt 和 NF-κB 磷酸化水平，而不抑制 ERK1/2 通路蛋白的激活。因此，我們推測 NRP1 可能通過其下游的 PI3K/Akt 及 NF-κB 信號通路，參與大鼠 VSMCs 的增殖與遷移，而 MAPK/ERK 信號通路則不參與 NRP1 介導的該過程。
綜上所述，本研究表明 NRP1 可能通過促進 VSMCs 的增殖與遷移，在靜脈橋增殖重構進程中發揮潛在的促進作用，但尚需進一步的動物研究驗證。除此之外，冠狀動脈旁路移植術后靜脈橋失效是一個極其復雜的過程，以 NRP1 為靶點的治療策略是否有助于減少 NIH 形成，從而降低靜脈橋失效發生率，需要進一步深入研究。
利益沖突：無。
作者貢獻：劉宇負責實驗設計與執行、撰寫文章；張洪偉負責指導協助實驗執行；楊鵬、黃堯負責資料收集與整理；盧晨負責圖片編輯與排版；張煜負責統計分析；胡佳負責實驗指導、論文審閱與修改。
由于人口老齡化及心血管病危險因素的加劇，我國冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的患病率及死亡率整體呈現逐年上升的趨勢[1]。對于合并多支冠狀動脈病變的患者，冠狀動脈旁路移植術是其首選治療方法[2]。但約有 30%～40% 的靜脈橋會在術后 1 年內失效，高達 70% 的靜脈橋在 10 年后將完全閉塞，嚴重影響患者的生活質量和遠期生存[2]。
新生內膜增生（neointimal hyperplasia，NIH）及進行性粥樣硬化是冠狀動脈旁路移植術后靜脈橋中遠期失效的中心環節[3-8]。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖和內向性遷移是 NIH 的關鍵因素[3-8]。因此，負向調控 VSMCs 的增殖遷移，可有效抑制 NIH 及靜脈橋增殖性重構[8-10]。
血管損傷及血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）等生長因子和細胞因子的刺激，可促使 VSMCs 發生表型轉換及增殖遷移[3-4, 11-13]。研究[12-14]發現，神經纖毛蛋白-1（neuropilin-1，NRP1）的表達上調與 PDGF 誘導的人和大鼠的 VSMCs 增殖遷移密切相關。但是，NRP1 在 VSMCs 生物學功能中的作用及相關調控機制尚未闡述清楚。本研究將通過 NRP1 基因干擾腺病毒靶向抑制 NRP1 在大鼠 VSMCs 中的表達，探究 NRP1 在大鼠 VSMCs 增殖、凋亡和遷移中的功能作用以及其可能介導的相關下游信號傳導通路，初步探討 NRP1 在靜脈橋增殖重構進程中的潛在作用。
1 材料與方法
1.1 細胞來源
本實驗所用大鼠 VSMCs：型號 A7r5，購置于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫（來源于美國 ATCC 公司，保持了原有細胞的基本生物學特性）。
1.2 主要實驗試劑
主要實驗試劑包括：NRP1 兔來源單克隆抗體（Abcam，英國）、胎牛血清（BioInd，以色列）、DMEM 培養基（Thermo Fisher，美國）、DMSO（Sigma，美國）、CCK-8 試劑盒（MCE，美國）、PBS（北京索萊寶）、PDGF-BB（Peprotech，#100-14B，美國）、蛋白上樣指示劑（BIO-RAD，美國）、PVDF 膜（Millipore，美國）、RIPA 細胞/組織高效裂解液（北京索萊寶）及 Annexin V/PI 凋亡檢測試劑盒（北京四正柏）。
1.3 主要實驗器材
細胞培養箱（BINDER，美國）、脫色搖床（OHAUS，美國）、酶標儀（Bio TEX，美國）、電泳儀（BIO-RAD，美國）、化學成像系統（BIO-RAD，美國）、熒光定量 PCR 儀（BIO-RAD，美國）、流式分析儀（Beckman Coulter，Navios，美國）、倒置熒光顯微鏡（ZEISSm，OBSERVER D1，德國）、圖像采集系統（ZEISS，AX10 cam HRC，德國）。
1.4 研究方法
1.4.1 NRP1 基因靶向干擾腺病毒的構建
委托上海吉凱基因化學技術有限公司完成。登錄美國 Gene Bank 數據庫（網址
1.4.2 大鼠 VSMCs 鑒定
采用 STR 多重熒光試劑盒對樣品 DNA 進行擴增，然后使用 DNA 分析儀（Applied Biosystems）對 PCR 產物進行分析比對以排除大鼠 VSMCs 細胞被人源細胞交叉污染；通過對樣品的 COX-1 基因進行擴增與電泳測試，獲取基因條帶，根據 COX-1 條帶大小判斷物種來源；制作大鼠 VSMCs 細胞爬片，通過免疫組化檢測平滑肌細胞標志物 α-SMA 來確證該細胞系是否是平滑肌細胞。
1.4.3 檢測大鼠 VSMCs 中 NRP1 的表達情況
1.4.3.1 實時熒光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）測定大鼠 VSMCs 中 NRP1 的表達
細胞 RNA 采用 Magen 公司的 RaPure Total RNA Kit（單柱法）試劑盒進行提取。將提取到的總 RNA 逆轉錄合成 cDNA，逆轉錄體系中 RNA 的體積根據 RNA 濃度計算：需要的 RNA 質量/濃度，20 μL 逆轉錄體系中，SYBR Green qPCR 最多可使用 1 μg 總 RNA；在冰上配置去基因組 DNA 反應混合液；42℃ 反應 2 min，去除基因組 DNA；再在冰上配制逆轉錄反應混合液；瞬時離心，普通 PCR 儀進行逆轉反應生成 cDNA（反應條件：37℃ 15 min、85℃ 5 s），所得 cDNA 于–20℃ 冰箱保存。使用 Primer Premier 6 軟件設計 qPCR 引物序列，在 NCBI Primer-BLAST 中驗證，使用 β-actin 作內參基因，配制 qPCR 反應混合物 10 μL，瞬時離心，熒光定量 PCR 儀上機檢測，利用 BIO-RAD iQ 5 軟件進行分析。確定 Ct 值，并計算 ΔCt 值（目標基因 Ct 值–內參 β-actin 的 Ct 值）。再計算 ΔΔCt（實驗組 ΔCt–對照組 ΔCt），再以 2ΔΔCt 計算相對拷貝數。相同基因 ΔΔCt 越大，相對拷貝數就越低，基因表達量就越低。
1.4.3.2 WB 測定大鼠 VSMCs 中 NRP1 的表達
將培養瓶或 6 孔板放在冰塊上，用預冷 PBS 洗滌細胞 2～3 次，吸干 PBS 后，再加入預冷的 RIPA，使用細胞刮將貼壁的細胞從培養瓶壁刮下，然后將懸液轉移至新預冷 EP 管，冰上放置 30 min，每 10 min 振蕩一次，4℃ 預冷離心機中 13 000 rpm 離心 15～20 min，取出 EP 管置于冰上，吸出上清液到預冷的新管中，棄去沉淀。將提取到的細胞蛋白按照碧云天 BCA 試劑盒說明進行蛋白濃度的測定，經過 SDS-PAGE 電泳和轉模后進行抗體結合和檢測。
1.4.4 實驗分組
（1）陰性對照腺病毒（Ad.NC）組 在含 10%FBS 的 DMEM 培養的大鼠 VSMCs 中，轉染不含基因序列的陰性對照腺病毒。
（2）NRP1 干擾腺病毒（Ad.shNRP1）組 在含 10%FBS 的 DMEM 培養的大鼠 VSMCs 中，轉染負載 NRP1-shRNA 的腺病毒。
將長勢良好的 VSMCs 接種到培養皿中，待細胞融合達到 50% 時給予最佳稀釋度的腺病毒進行轉染。培養皿置于 37℃、5% CO2 的培養箱中孵育，病毒轉染 48 h 后，細胞重新計數鋪板，通過 qPCR 和 WB 檢測 NRP1 表達情況，并分別進行細胞增殖活力、凋亡及遷移能力等檢測。
1.4.5 CCK-8 檢測細胞增殖活力
兩組細胞的增殖活力采用 CCK-8（cell counting kit-8）試劑進行檢測，其試劑中含有的 2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽，能被線粒體中的酶還原為高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazan dye），而黃色甲瓚產物的量與活細胞數量成正相關。
1.4.6 流式細胞術檢測細胞凋亡情況
取病毒轉染后 48 h 的 VSMCs，細胞重懸計數后接種于 6 孔板，培養 48 h 后將 VSMCs 制成細胞懸液，充分混勻后 2 000 rpm 離心 5 min，棄上清液。加入 100 μL Binding Buffer 重懸細胞，然后加入 2 μL Annexic V-APC 混勻，再加入 1 μL PI，輕輕混勻后避光室溫孵育 15 min，再補加 200 μL Binding Buffer，40 μm 濾網過濾后，進行流式檢測。
1.4.7 Transwell 檢測細胞遷移能力
取病毒轉染 48 h 后的細胞重懸，每個 Transwell 小室加入 5×104個細胞。上室為無血清 DMEM 培養基 200 μL，下室加入含 10% FBS 的完全 DMEM 培養基 600 μL，注意小室底部不可有氣泡。繼續培養 48 h 后取出細胞，取出小室后首先需擦除里面的細胞及液體，然后在下室中加入甲醇 600 μL 固定 30 min，風干，再用結晶紫染色液 600 μL 染色 20 min 后用 PBS 洗滌后晾干。顯微鏡下計數 3 個不同視野中穿過膜的細胞數，并計算平均值，若細胞數較少時可全部計數。
為了探索 NRP1 在大鼠 VSMCs 中可能通過哪些信號通路發揮作用，我們挑選了 PI3K/Akt、MAPK/ERK 和 NF-κB 這 3 條 VSMCs 增殖遷移過程中的經典信號通路進行研究。靶向干擾大鼠 VSMCs 中 NRP1 的表達后，分別檢測其下游 Akt、ERK1/2 及 NF-κB 通路蛋白磷酸化和總表達水平的變化，推測 NRP1 在大鼠 VSMCs 中發揮作用可能介導的信號通路。
1.5 統計學分析
應用 SPSS 19.0 統計軟件（SPSS Inc，Chicago，IL，美國）進行數據統計分析，GraphPad Prism 6 軟件（GraphPad Inc，La Jolla，CA，美國）作圖。數據以均數±標準差（±s）表示，兩組之間比較使用獨立樣本 t 檢驗，多組之間比較則采用單因素方差分析。P≤0.05 表示差異有統計學意義。
1.6 倫理審查
本研究已通過四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會審查通過，批準號：2018103A。
2 結果
2.1 大鼠 VSMCs 鑒定結果
本研究中所使用的細胞在 STR 圖譜中未檢測到擴增峰，表明未受到人源細胞污染（圖1a）。
圖1
大鼠血管平滑肌細胞鑒定結果
a：STR 基因分型圖譜；b：COX-1 基因電泳圖譜（條帶位于 196bp 處，常見物種 COX-1 基因大小：人類 391bp；恒河猴 287bp；長尾猴 222bp；牛 102bp；犬 172bp；大鼠 196bp；小鼠 150bp；倉鼠 315bp；昆蟲 70bp）；c：免疫組化結果，紅色為 α-SMA 蛋白，藍色為 DAPI 染色的細胞核（20×10 倍）
在 COX-1 基因電泳中，將僅有的位于 196bp 的條帶與常見物種 COX-1 基因大小進行對比，提示本研究所使用的細胞來源于大鼠并且不存在物種污染（圖1b）。
細胞免疫組化結果顯示 VSMCs 標志物 α-SMA 陽性表達，進一步證實本研究所使用的細胞為未受污染的大鼠 VSMCs（圖1c）。
2.2 PDGF 及腺病毒的濃度選擇
分別使用 0 ng/mL，15 ng/mL 和 30 ng/mL 的 PDGF-BB 誘導大鼠 VSMCs，通過 qPCR 和 WB 檢測發現，在基因轉錄和翻譯兩種水平，NRP1 在大鼠 VSMCs 中的表達均隨著 PDGF 的誘導劑量逐漸增高，提示 PDGF 能夠促進 NRP1 的表達（圖2a）。因此，我們采用 30 ng/mL 的 PDGF-BB 進行后續研究。
圖2
PDGF 及腺病毒的濃度選擇
a：大鼠 VSMCs 中 NRP1 在不同濃度 PDGF 誘導下的表達情況（*：與 0 ng/mL 組比較，
使用構建的腺病毒感染大鼠 VSMCs，病毒轉染后 48 h，采用流式細胞術檢測 VSMCs 的存活率及熒光表達率。研究發現（圖2b），在腺病毒 10–3稀釋度下，VSMCs 的存活率為 85.4%，標記腺病毒的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達率為 93.4%；而在病毒 10-4稀釋度下，VSMCs 存活率為 92.1%，GFP 表達率為 91.7%。綜合評估得出腺病毒在 10-3稀釋度下，對 VSMCs 可達到最佳的轉染效果，遂以此稀釋度下的病毒濃度進行后續實驗。
2.3 腺病毒成功轉染大鼠 VSMCs
熒光顯微鏡下可以看到 NRP1-shRNA 腺病毒和陰性對照腺病毒均成功轉染 VSMCs（圖3a）。通過流式細胞術檢測觀察到兩組 GFP 表達率均達到 80%，病毒轉染效率未見明顯差別，滿足細胞功能及機制研究的要求（圖3b）。
圖3
腺病毒成功轉染大鼠血管平滑肌細胞
a：熒光顯微鏡下觀察腺病毒在大鼠 VSMCs 中轉染效率（20×10 倍）；b：流式細胞術檢測腺病毒在大鼠 VSMCs 中轉染效率
2.4 NRP1 基因靶向干擾腺病毒抑制大鼠 VSMCs 中 NRP1 的表達
通過 qPCR 及 WB 檢測，NRP1 基因靶向干擾腺病毒轉染大鼠 VSMCs 后，在基因及蛋白水平，NRP1 的表達均被顯著抑制（圖4）。
圖4
靶向干擾腺病毒抑制 NRP1 在血管平滑肌細胞中的表達
*：與 Ad.NC 組比較，
2.5 下調 NRP1 表達對大鼠 VSMCs 增殖活力的影響
在探究 NRP1 對大鼠 VSMCs 具體生物學功能的影響時，首先采用 CCK-8 實驗檢測增殖活力的變化，結果顯示在 24 h、48 h 和 72 h 時，Ad.NRP1 組細胞的增殖活力較 Ad.NC 組均有明顯降低（圖5），提示 NRP1 表達下調可以抑制大鼠 VSMCs 的增殖活力。
圖5
CCK-8 檢測 NRP1 表達下調對大鼠血管平滑肌細胞增殖的影響
*：與 Ad.shNRP1 組比較，
2.6 下調 NRP1 表達對大鼠 VSMCs 凋亡的影響
為了研究下調 NRP1 表達對大鼠 VSMCs 凋亡的影響，我們采用了 Annexin V-APC/PI 雙染法流式細胞術檢測凋亡百分比，結果顯示 Ad.NRP1 組細胞凋亡百分比顯著高于 Ad.NC 組（圖6），表明下調 NRP1 表達促進了大鼠 VSMCs 的凋亡。
圖6
流式細胞術檢測下調 NRP1 表達對大鼠血管平滑肌細胞凋亡的影響
a：凋亡細胞的流式散點圖分析；b：細胞凋亡百分比對比；*：與 Ad.NC 組比較，
2.7 下調 NRP1 表達對大鼠 VSMCs 遷移能力的影響
在檢測了抑制 NRP1 表達對大鼠 VSMCs 增殖和凋亡的影響之后，進一步采用 Transwell 實驗檢測遷移能力的變化，結果顯示 Ad.NRP1 組遷移至小室膜外表面的細胞數明顯少于 Ad.NC 組（圖7），提示下調 NRP1 表達可以顯著抑制大鼠 VSMCs 的遷移。
圖7
Transwell 檢測下調 NRP1 表達對大鼠血管平滑肌細胞遷移的影響（20×10 倍）
a：顯微鏡下觀察Transwell小室聚碳酸酯膜外表面的細胞；b：單個顯微鏡視野下遷移的細胞數量對比；*：與 Ad.NC 組比較，
2.8 下調 NRP1 表達對其下游信號通路蛋白表達的影響
為了探究 NRP1 在大鼠 VSMCs 中發揮生物學效應可能介導的下游信號通路，我們挑選了 PI3K/Akt、MAPK/ERK 和 NF-κB 這 3 條 VSMCs 增殖遷移過程中的經典信號通路進行研究。采用 WB 檢測 NRP1 下調后下游信號通路蛋白表達情況，結果顯示 p-Akt 和 p-NF-κB 明顯下降，而 t-Akt、t-NF-κB、t-ERK1/2 和 p-ERK1/2 無顯著變化，說明抑制 NRP1 表達可以同時抑制其下游 PI3K/Akt 及 NF-κB 信號通路激活，但對 MAPK/ERK 信號通路無明顯影響。結果提示 NRP1 在大鼠 VSMCs 中可通過介導下游 PI3K/Akt 及 NF-κB 信號通路發揮作用（圖8）。
圖8
WB 檢測下調 NRP1 表達對大鼠血管平滑肌細胞下游信號通路蛋白表達的影響
3 討論
本研究發現，PDGF 可誘導大鼠 VSMCs 中 NRP1 表達上調，使用腺病毒 shRNA 靶向干擾 NRP1 在 VSMCs 中的表達，可顯著抑制 PDGF 誘導的 VSMCs 增殖、遷移并促進細胞凋亡，表明 NRP1 對 VSMCs 的增殖與遷移具有重要的促進作用。同時，下調 NRP1 表達后，Akt 及 NF-κB 信號通路蛋白的磷酸化水平也明顯降低，推測 NRP1 可通過介導下游 PI3K/Akt 及 NF-κB 信號通路積極參與調控 VSMCs 的生物學功能。
中膜 VSMCs 的增殖和遷移是冠狀動脈旁路移植術后靜脈橋增殖重構進程中的關鍵環節[3-8]。靜脈移植術后內皮細胞功能受損導致血小板和白細胞粘附聚集，大量促凝、促炎和生長因子釋放，促使靜脈中膜 VSMCs 由收縮型轉換為合成型，大量增殖并向血管內膜遷移，同時分泌過量的細胞外基質，形成新生內膜，導致靜脈橋管壁增厚發生再狹窄[3-8, 15-16]。在這一進程中，受損的內皮細胞、活化的 VSMCs 以及激活的血小板和巨噬細胞，均能分泌釋放大量 PDGF[4, 17-18]。研究[12-14, 19-20]發現，PDGF 是一種強效的促有絲分裂因子，在 VSMCs 的表型轉換及增殖、遷移過程中發揮了重要的促進作用。而通過抑制 PDGF 的表達或其受體的活化來阻斷 PDGF 信號傳導通路，可有效抑制 VSMCs 過度增殖和內向性遷移，從而減輕血管壁增殖性重構改變[21-24]。
NRP1 是一種多功能的非酪氨酸激酶跨膜糖蛋白，可積極參與 PDGF 介導的信號轉導，在 VSMCs 增殖、遷移和凋亡中發揮重要作用[12-14, 25-26]。本研究發現，NRP1 由 VSMCs 分泌產生，而 PDGF 可誘導其表達上調。Banerjee 等[26]在人體主動脈 VSMCs 中加入 PDGF（50 ng/mL），可刺激 NRP1 在基因和蛋白水平的表達分別增加 2.6 倍和 2.8 倍。研究[12-13]發現，NRP1 在 VSMCs 中可與 PDGF 受體 α（PDGFRα）共定位，而 PDGF-BB 通過與 PDGFRα–NRP1 復合物結合，在人體冠狀動脈和大鼠主動脈 VSMCs 中發揮功能調節作用，而靶向抑制 NRP1 的表達，可干預 PDGF 誘導的 PDGFRα 磷酸化，從而抑制 VSMCs 遷移。因而，有人提出 NRP1 參與 VSMC 的生物學功能，可能主要是由于激活了 PDGF 的信號傳導[12]。然而，Li 等[27]發現無論 PDGF-BB 刺激與否，過表達 MicroRNA-320 均會通過下調 NRP1 表達，抑制 VSMCs 的增殖與遷移。此外，作為 VEGF 的共受體，也有研究[28-29]表明 NRP1 可在 VEGF 介導下促進 VSMCs 遷移。本研究通過 shRNA 靶向抑制 NRP1 表達，不僅顯著抑制了大鼠 VSMCs 的趨化遷移，同時也抑制了 VSMCs 增殖，并促進其凋亡。因而，我們推測 NRP1 表達上調可能會通過促進 VSMCs 的增殖和遷移，加速冠狀動脈旁路移植術后靜脈橋失效。
VSMCs 的增殖與遷移需要通過介導多種復雜的細胞傳導通路完成。PI3K/Akt、MAPK/ERK 及 NF-κB 均是調控 VSMCs 生物學功能的經典信號通路，廣泛參與了靜脈橋增殖重構進程[30-34]。然而，這些通路在 NRP1 介導 VSMCs 增殖、遷移與凋亡的過程中究竟發揮怎樣的作用，目前尚不明確。既往研究[12, 27, 29]發現，不同的生長因子誘導下，NRP1 參與調控 VSMCs 功能所介導的信號通路也不盡相同。Liu 等[29]發現，b-FGF 作為誘導劑刺激人 VSMCs 后，可激活 ERK1/2 及 NF-κB 信號途徑，而對 Akt 的磷酸化卻無影響；反之，特異性抑制 ERK1/2 和 NF-κB 信號通路，可明顯下調 b-FGF 誘導的 VSMCs 中 NRP1 的表達，而 PI3K/Akt 的特異性抑制劑 wortmannin 對 NRP1 的表達并無影響。然而，Banerjee 等[28]的研究卻發現 NRP1 有賴于 PI3K/Akt 途徑參與 VEGF 誘導的人主動脈 VSMCs 遷移。而 Pellet-Many 等[12]發現，在 PDGF 誘導的人冠狀動脈 VSMCs 中敲除 NRP1 基因，ERK1/2 和 Akt 的磷酸化水平沒有降低，提示二者并不參與 NRP1 調控的 VSMCs 遷移。本研究中，靶向干擾 NRP1 在大鼠 VSMCs 中的表達后，可顯著下調 Akt 和 NF-κB 磷酸化水平，而不抑制 ERK1/2 通路蛋白的激活。因此，我們推測 NRP1 可能通過其下游的 PI3K/Akt 及 NF-κB 信號通路，參與大鼠 VSMCs 的增殖與遷移，而 MAPK/ERK 信號通路則不參與 NRP1 介導的該過程。
綜上所述，本研究表明 NRP1 可能通過促進 VSMCs 的增殖與遷移，在靜脈橋增殖重構進程中發揮潛在的促進作用，但尚需進一步的動物研究驗證。除此之外，冠狀動脈旁路移植術后靜脈橋失效是一個極其復雜的過程，以 NRP1 為靶點的治療策略是否有助于減少 NIH 形成，從而降低靜脈橋失效發生率，需要進一步深入研究。
利益沖突：無。
作者貢獻：劉宇負責實驗設計與執行、撰寫文章；張洪偉負責指導協助實驗執行；楊鵬、黃堯負責資料收集與整理；盧晨負責圖片編輯與排版；張煜負責統計分析；胡佳負責實驗指導、論文審閱與修改。
