引用本文： 趙亮, 梅方超, 周瑜, 李滿, 王衛星, 余佳, 鄧文宏. 外源性胰島素對重癥急性胰腺炎大鼠相對腎上腺功能不全的保護作用研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(6): 721-726. doi: 10.7507/1007-9424.202010087 復制
急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是臨床上常見的急腹癥，根據病理生理特點和病情的嚴重程度可分為輕、中、重 3 型，其中重癥急性急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）易出現全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）及多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），病情兇險，進展快，嚴重危害患者的生命健康[1-3]。既往研究[4-6]發現，機體出現嚴重疾病時容易并發相對腎上腺功能不全（relative adrenal insufficiency，RAI），機體合成皮質酮（醇）的能力下降，嚴重影響疾病預后。SAP 常合并腎上腺病理損傷和功能異常，這可能是導致 SAP 相關 MODS 和 SIRS 的重要原因之一[7-8]，但 SAP 相關 RAI 的病理生理機制未能完全闡明。本團隊前期研究[9]發現，SAP 12 h 后，大鼠腎上腺皮質細胞中線粒體腫脹，內質網擴張，胞漿中脂質耗竭，提示腎上腺可能存在脂質攝取合成障礙，這可能是 SAP 相關 RAI 發生發展的重要原因。胰島素是胰島 β 細胞合成釋放的多肽類激素，不僅參與糖類代謝，還參與機體內多個組織器官的調控脂質轉運和代謝[10]。既往研究[11-12]發現，AP 時給以外源性的胰島素可以減輕患者的病情，改善患者的預后，但其詳細機制仍不清楚，尤其是外源胰島素對 SAP 相關性 RAI 是否存在作用鮮有研究。本研究擬通過建立 SAP 動物模型，給予外源性胰島素進行干預，觀察其對于 SAP 相關 RAI 的作用。
1 材料與方法
1.1 動物模型制備及實驗分組
SPF 級 SD 大鼠 80 只，體質量 180～200 g（湖南斯萊克景達公司）。根據隨機數字表法隨機分為假手術組（SO 組，n=16）、SAP 組（n=16）、胰島素低劑量干預組（低劑量組，n=16，0.05 U/100 g）、胰島素中劑量干預組（中劑量組，n=16，0.1 U/100 g）和胰島素高劑量干預組（高劑量組，n=16，0.2 U/100 g）。為了甄別是否存在相對性腎上腺功能不全，以上各組再隨機分為二十四肽促皮質素試驗（CST）亞組和非 CST（NCST）亞組，每個亞組 8 只大鼠。
異氟烷（上海雅培公司，誘導 4%～5%，維持 2%～3%，氧流量為 1.5 L/min）麻醉后逐層入腹，4.5 號頭皮針穿過十二指腸對系膜緣，經腸腔進入十二指腸乳頭逆行插入膽胰管，以 0.1 mL/min 恒速注射 5% 牛磺膽酸鈉（美國 Sigma 公司）溶液（1.0 mL/kg）造模，隨即夾閉主胰管，5 min 后見胰腺出現廣泛水腫、出血，即表明 SAP 模型制備成功[13-14]。建模后大鼠頸背部皮下多點注射無菌生理鹽水（2 mL/100 g）。建模完成后 0.5 h 按實驗方案分別給予皮下注射胰島素，CST 亞組大鼠在獲取標本前 0.5 h 給予二十四肽促皮質素（1 mg/kg）腹腔注射[15]。
1.2 檢測指標及方法
1.2.1 血清學指標
模型建立后 3 h，異氟烷麻醉大鼠，原手術切口入腹，下腔靜脈采血 3 mL，3 000 r/min 離心 15 min（r=100 mm）分離血清，?80 ℃ 保存備用。采用全自動生化儀（日本奧林巴斯公司）檢測各組的 NCST 亞組大鼠血清中淀粉酶（AMY）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、尿素（Ur）和肌酐（Cr）水平。按照生產廠商提供的說明書，使用皮質酮（Cor）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（武漢 Elabscience 公司）檢測各組的 NCST 亞組大鼠血清中腫瘤壞死因子-α （TNF-α） 水平以及各組的 NCST 亞組和 CST 亞組大鼠血清 Cor 水平。
1.2.2 胰腺、腎上組織病理學評估
血液標本采集完成后處死大鼠，取各 NCST 亞組大鼠胰頭和同側腎上腺組織于 4% 甲醛溶液中固定，石蠟包埋、切片，行 HE 染色，根據 Schmidt 等[16]的方法，對胰腺水腫、腺泡壞死、出血及脂肪壞死和炎癥浸潤在光鏡下進行病理學觀察及評分；根據 Deng 等[8]的方法，對腎上腺組織是否有血竇擴張、細胞變性、細胞壞死及炎性細胞浸潤進行病理學觀察及評分。
1.2.3 腎上腺油紅 O 染色
建模后 3 h 處死大鼠，取各 NCST 亞組大鼠腎上腺組織行冰凍包埋、切片，行油紅 O 染色，光鏡下觀察腎上腺組織油紅 O 染色情況。
1.3 統計學方法
采用 Graphpad Prism 6.0 統計軟件對數據進行分析。計量數據采用 K-S 法進行正態檢驗，均符合正態分布，采用均數±標準差（
）表示，各 NCST 亞組大鼠組間比較采用單因素方差分析，CST 亞組與 NCST 亞組大鼠組間數據比較采用 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 各組大鼠血清學指標檢測結果
與 SO 組比較，SAP 組大鼠血清 AMY、AST 和 Cr 水平顯著升高（P<0.05）；與 SAP 比較，低劑量組大鼠這 3 項指標無顯著下降（P>0.05），中、高劑量組大鼠這 3 項指標均顯著下降（P<0.05）且顯著低于低劑量組（P<0.05），但中劑量組和高劑量組之間的差異無統計學意義 P>0.05）。與 SO 組比較，SAP 組大鼠血清 ALT 水平顯著升高（P<0.05）；與 SAP 組比較，低、中和高劑量組大鼠血清 ALT 水平均顯著降低（P<0.05）；中、高劑量組大鼠血清 ALT 均顯著低于低劑量組（P<0.05），但中劑量組和高劑量組之間的差異無統計學意義（P>0.05）。與 SO 組比較，SAP 組大鼠血清 Ur 水平顯著升高（P<0.05）；與 SAP 組比較，低劑量組 Ur 水平無顯著下降（P>0.05），中、高劑量組 Ur 水平均顯著降低（P<0.05）；低、中、高 3 個劑量組 Ur 水平的差異無統計學意義（P>0.05）。與 SO 組比較，SAP 組大鼠血清 TNF-α 水平顯著升高（P<0.05）；與 SAP 組比較，低、中、高劑量組 TNF-α 水平均顯著降低（P<0.05）；中劑量組的 TNF-α 水平最低，顯著低于低劑量組（P<0.05），高劑量組 TNF-α 水平與中劑量組間的差異無統計學意義（P>0.05）。與 SO 組 NCST 亞組比較，SAP 組 NCST 亞組大鼠血清 Cor 水平顯著升高（P<0.05）；與 SAP 組 NCST 亞組比較，低劑量組 NCST 亞組 Cor 水平無顯著升高（P>0.05），中、高劑量組的 NCST 亞組 Cor 水平均顯著升高（P<0.05）；中、高劑量組 NCST 亞組 Cor 水平均顯著高于低劑量組 NCST 亞組（P<0.05），但中劑量組和高劑量組 NCST 亞組之間的差異無統計學意義（P>0.05）。二十四肽促皮質素干預后（CST 亞組）結果顯示，與 NCST 亞組比較，SO 組、中劑量組和高劑量組的 CST 亞組大鼠血清 Cor 水平均顯著升高（P<0.05），而 SAP 組和低劑量組的 CST 亞組大鼠血清 Cor 水平均無顯著升高（P>0.05）。具體見表 1。
表1
各組大鼠血清學指標以及胰腺和腎上腺病理評分結果（
，n=8）
2.2 各 NCST 亞組大鼠胰腺組織病理學改變
光鏡下可見，SO 組胰腺結構清晰完整，未見明顯病理學改變；SAP 組胰腺組織可見彌漫小葉間隙擴張，胰腺實質出現廣泛出血、壞死，局部可見炎性細胞浸潤，病理評分均較 SO 組升高（P<0.05）；低劑量組胰腺組織同樣存在胰腺實質出血、壞死、胰腺小葉結構破壞等典型病理改變，其病理評分與 SAP 組比較差異無統計學意義（P>0.05）；中劑量組胰腺實質出血、壞死的程度和面積顯著改善，炎性細胞浸潤顯著減少，胰腺小葉結構尚可見，其病理評分顯著低于 SAP 組和低劑量組（P<0.05）；高劑量組胰腺組織的病理改變與中劑量組相當，其病理評分顯著低于 SAP 組和低劑量組（P<0.05），但與中劑量組比較差異無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 1a-1e 和表 1。
圖1
示各 NCST 亞組大鼠胰腺和腎上腺組織的病理改變及腎上腺組織油紅 O 染色結果
a–e：示各組大鼠胰腺組織的病理改變（HE ×200，標尺長度 100 μm）；f–j：示各組大鼠腎上腺組織的病理改變（HE ×200，標尺長度 50 μm）；k–o：示各組大鼠腎上腺組織的油紅 O 染色結果（油紅 O ×400，標尺長度 25 μm）
2.3 各 NCST 亞組大鼠腎上腺組織病理學改變
光鏡下可見，SO 組腎上腺組織結構清晰、完整，血液灌注良好；SAP 組腎上腺組織血液灌注不良，部分血竇擴張改變，皮質細胞出現空泡化改變，甚至出現結構消失、壞死等改變，散在炎癥細胞浸潤改變，其病理評分較 SAP 組顯著升高（P<0.05）；低劑量組腎上腺皮質層同樣存在血液灌注減少，皮質細胞變性、壞死，炎性細胞浸潤等典型改變，其病理評分與 SAP 組比較差異無統計學意義（P>0.05）；中劑量組腎上腺血液灌注顯著改善，細胞壞死、空泡化等改變顯著緩解，病理評分較 SAP 組和低劑量組顯著降低（P<0.05）；高劑量組腎上腺組織血液灌注充分，細胞壞死、空泡化改變以及炎癥細胞浸潤較 SAP 組和低劑量組顯著改善，病理評分顯著降低（P<0.05），但與中劑量組比較差異無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 1f-1j 和表 1。
2.4 各 NCST 亞組大鼠腎上腺油紅 O 染色結果
油紅 O 染色顯示各 NCST 亞組大鼠腎上腺組織中脂質含量：SO 組腎上腺皮質層內富含脂質，與 SO 組比較，SAP 組腎上腺皮質層脂質含量明顯減少；與 SAP 組比較，低劑量組腎上腺脂質含量無明顯增加，而中劑量組和高劑量組腎上腺脂質含量明顯增加（圖 1k-1o）。
3 討論
研究表明，重癥疾病如膿毒癥時可并發 RAI，RAI 時機體合成 Cor 的能力與病死率有關[6, 17]。Annetta 等[17]在研究膿毒癥模型時認為，當靜脈途徑短時間給以二十四肽促皮質素，血清中的 Cor 升高的水平<260 nmol/L 認為發生 RAI。Yu 等[18]研究發現，腎上腺作為重要的內分泌和抗炎器官，SAP 時出現 RAI 導致 Cor 分泌不足，進一步導致炎癥網絡調節失控，加重胰腺炎病情進展，但目前關于 SAP 時腎上腺合成 Cor 障礙的原因尚不十分清楚。
本研究通過牛磺膽酸鈉胰膽管逆行注射建立 SAP 模型，3 h 后血清檢測發現，AMY、ALT、AST、Ur、Cr 和 TNF-α 水平均顯著升高，胰腺出現實質出血、壞死，炎性細胞浸潤等病理改變，病理評分顯著升高；同時還發現，SAP 大鼠腎上腺出現血液灌注減少，皮質細胞空泡化、壞死、炎性細胞浸潤等病理改變，病理評分也顯著升高；此時 SAP 組大鼠血清 Cor 水平較 SO 組顯著升高。給予 CST 干預后發現，SAP 大鼠 Cor 雖有升高，但是與 SO 組相比升高幅度較低，而且與 NCST 亞組相比差異無統計學意義。以上結果表明，SAP 時存在包括 RAI 在內的多臟器功能障礙，其原因可能有：① 早期創傷、應激反應導致腎上腺皮質內脂質耗竭；② SAP 時消化酶、促炎介質入血，循環容量下降等造成腎上腺直接或間接損傷，最終導致 RAI 的發生。
筆者所在團隊前期在急性壞死性胰腺炎模型中證實， Cor 水平在建模后 1 h 達到高峰，維持至 3 h 后開始下降；腎上腺病理和結構損傷的“窗口期”可能在 SAP 的早期，早期進行干預處理可能是逆轉 SAP 相關損傷的關鍵時期[19]。因此本研究在 SAP 模型建立后 0.5 h 即給予梯度劑量胰島素皮下注射進行干預，3 h 后檢測發現低劑量組大鼠血清 AMY、ALT、AST、Ur、Cr 和 TNF-α 水平較 SAP 組有輕微下降，僅 ALT 和 TNF-α 水平差異明顯；中劑量組和高劑量組大鼠血清 AMY、ALT、AST、Ur、Cr 和 TNF-α 水平較 SAP 組有顯著下降，胰腺的病理損傷顯著改善，病理評分顯著下降，腎上腺的病理損傷和病理評分也有顯著改善，但是中劑量組和高劑量組之間的差異無統計學意義。進一步檢測發現中劑量組和高劑量組大鼠血清 Cor 水平較 SAP 組均顯著升高，CST 亞組血清 Cor 水平顯著高于非 CST 亞組，其升高幅度遠高于 SAP 組。這些結果提示，通過合適劑量外源性胰島素早期干預，不僅改善了 SAP 相關腎上腺損傷和 SAP 相關 RAI，還能夠降低（減輕）SAP 的嚴重程度和炎癥反應水平。這可能是外源性胰島素通過逆轉 SAP 相關 RAI 實現的。
Cor 為甾類激素，其主要的合成原料是膽固醇酯類，而腎上腺組織中的膽固醇酯類可以通過血液中攝取和自身合成來實現[20-22]。本研究通過油紅 O 染色發現，SAP 組大鼠腎上腺組織中脂質含量較 SO 組顯著減少，說明 SAP 大鼠腎上腺組織存在脂質消耗，這可能與 SAP 導致的應激狀態下 Cor 的合成釋放的消耗有關。胰島素是由胰島 β 細胞產生合成的一種多肽類激素，是機體能量代謝的關鍵分子，參與機體細胞脂質轉運和代謝過程[10]，直接或間接通過多種信號通路在腎上腺甾類激素合成中發揮重要作用[22-24]。筆者所在團隊前期動物實驗[25-26]發現，AP 大鼠和小鼠存在 β 細胞損傷，內源性胰島素釋放增多，但這些胰島素結構和功能可能并不完整。因此 SAP 時可能存在胰島素的相對不足，影響腎上腺獲取和合成膽固醇能力，進而影響 Cor 合成。本研究中通過外源性胰島素干預，可以使腎上腺組織中脂質含量顯著升高，CST 試驗結果也表明，外源性胰島素增加了 SAP 大鼠腎上腺脂質含量和皮質醇釋放的儲備能力。結果提示外源性胰島素可能是通過促進腎上腺組織攝取、合成膽固醇能力，促進 Cor 的合成與釋放，改善 SAP 相關 RAI，進而緩解 SAP 的炎癥反應程度。
綜上所述，SAP 早期存在腎上腺損傷和 RAI，但是這種改變在疾病早期是可以逆轉的。適量的外源性胰島素能夠改善腎上腺損傷，緩解 SAP 相關 RAI，但是其詳細機制仍需要進一步研究闡明。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：本課題由鄧文宏設計，實驗方案指導由王衛星、余佳完成，實驗過程由趙亮、梅方超、周瑜、李滿、余佳完成，數據分析由趙亮、鄧文宏完成，論文寫作由趙亮、梅方超、鄧文宏完成。
倫理聲明：本研究已通過武漢大學人民醫院倫理委員會實驗動物福利倫理的審核［批文編號：WDRM（福）第 20151114 號］。
急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是臨床上常見的急腹癥，根據病理生理特點和病情的嚴重程度可分為輕、中、重 3 型，其中重癥急性急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）易出現全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）及多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），病情兇險，進展快，嚴重危害患者的生命健康[1-3]。既往研究[4-6]發現，機體出現嚴重疾病時容易并發相對腎上腺功能不全（relative adrenal insufficiency，RAI），機體合成皮質酮（醇）的能力下降，嚴重影響疾病預后。SAP 常合并腎上腺病理損傷和功能異常，這可能是導致 SAP 相關 MODS 和 SIRS 的重要原因之一[7-8]，但 SAP 相關 RAI 的病理生理機制未能完全闡明。本團隊前期研究[9]發現，SAP 12 h 后，大鼠腎上腺皮質細胞中線粒體腫脹，內質網擴張，胞漿中脂質耗竭，提示腎上腺可能存在脂質攝取合成障礙，這可能是 SAP 相關 RAI 發生發展的重要原因。胰島素是胰島 β 細胞合成釋放的多肽類激素，不僅參與糖類代謝，還參與機體內多個組織器官的調控脂質轉運和代謝[10]。既往研究[11-12]發現，AP 時給以外源性的胰島素可以減輕患者的病情，改善患者的預后，但其詳細機制仍不清楚，尤其是外源胰島素對 SAP 相關性 RAI 是否存在作用鮮有研究。本研究擬通過建立 SAP 動物模型，給予外源性胰島素進行干預，觀察其對于 SAP 相關 RAI 的作用。
1 材料與方法
1.1 動物模型制備及實驗分組
SPF 級 SD 大鼠 80 只，體質量 180～200 g（湖南斯萊克景達公司）。根據隨機數字表法隨機分為假手術組（SO 組，n=16）、SAP 組（n=16）、胰島素低劑量干預組（低劑量組，n=16，0.05 U/100 g）、胰島素中劑量干預組（中劑量組，n=16，0.1 U/100 g）和胰島素高劑量干預組（高劑量組，n=16，0.2 U/100 g）。為了甄別是否存在相對性腎上腺功能不全，以上各組再隨機分為二十四肽促皮質素試驗（CST）亞組和非 CST（NCST）亞組，每個亞組 8 只大鼠。
異氟烷（上海雅培公司，誘導 4%～5%，維持 2%～3%，氧流量為 1.5 L/min）麻醉后逐層入腹，4.5 號頭皮針穿過十二指腸對系膜緣，經腸腔進入十二指腸乳頭逆行插入膽胰管，以 0.1 mL/min 恒速注射 5% 牛磺膽酸鈉（美國 Sigma 公司）溶液（1.0 mL/kg）造模，隨即夾閉主胰管，5 min 后見胰腺出現廣泛水腫、出血，即表明 SAP 模型制備成功[13-14]。建模后大鼠頸背部皮下多點注射無菌生理鹽水（2 mL/100 g）。建模完成后 0.5 h 按實驗方案分別給予皮下注射胰島素，CST 亞組大鼠在獲取標本前 0.5 h 給予二十四肽促皮質素（1 mg/kg）腹腔注射[15]。
1.2 檢測指標及方法
1.2.1 血清學指標
模型建立后 3 h，異氟烷麻醉大鼠，原手術切口入腹，下腔靜脈采血 3 mL，3 000 r/min 離心 15 min（r=100 mm）分離血清，?80 ℃ 保存備用。采用全自動生化儀（日本奧林巴斯公司）檢測各組的 NCST 亞組大鼠血清中淀粉酶（AMY）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、尿素（Ur）和肌酐（Cr）水平。按照生產廠商提供的說明書，使用皮質酮（Cor）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（武漢 Elabscience 公司）檢測各組的 NCST 亞組大鼠血清中腫瘤壞死因子-α （TNF-α） 水平以及各組的 NCST 亞組和 CST 亞組大鼠血清 Cor 水平。
1.2.2 胰腺、腎上組織病理學評估
血液標本采集完成后處死大鼠，取各 NCST 亞組大鼠胰頭和同側腎上腺組織于 4% 甲醛溶液中固定，石蠟包埋、切片，行 HE 染色，根據 Schmidt 等[16]的方法，對胰腺水腫、腺泡壞死、出血及脂肪壞死和炎癥浸潤在光鏡下進行病理學觀察及評分；根據 Deng 等[8]的方法，對腎上腺組織是否有血竇擴張、細胞變性、細胞壞死及炎性細胞浸潤進行病理學觀察及評分。
1.2.3 腎上腺油紅 O 染色
建模后 3 h 處死大鼠，取各 NCST 亞組大鼠腎上腺組織行冰凍包埋、切片，行油紅 O 染色，光鏡下觀察腎上腺組織油紅 O 染色情況。
1.3 統計學方法
采用 Graphpad Prism 6.0 統計軟件對數據進行分析。計量數據采用 K-S 法進行正態檢驗，均符合正態分布，采用均數±標準差（）表示，各 NCST 亞組大鼠組間比較采用單因素方差分析，CST 亞組與 NCST 亞組大鼠組間數據比較采用 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 各組大鼠血清學指標檢測結果
與 SO 組比較，SAP 組大鼠血清 AMY、AST 和 Cr 水平顯著升高（P<0.05）；與 SAP 比較，低劑量組大鼠這 3 項指標無顯著下降（P>0.05），中、高劑量組大鼠這 3 項指標均顯著下降（P<0.05）且顯著低于低劑量組（P<0.05），但中劑量組和高劑量組之間的差異無統計學意義 P>0.05）。與 SO 組比較，SAP 組大鼠血清 ALT 水平顯著升高（P<0.05）；與 SAP 組比較，低、中和高劑量組大鼠血清 ALT 水平均顯著降低（P<0.05）；中、高劑量組大鼠血清 ALT 均顯著低于低劑量組（P<0.05），但中劑量組和高劑量組之間的差異無統計學意義（P>0.05）。與 SO 組比較，SAP 組大鼠血清 Ur 水平顯著升高（P<0.05）；與 SAP 組比較，低劑量組 Ur 水平無顯著下降（P>0.05），中、高劑量組 Ur 水平均顯著降低（P<0.05）；低、中、高 3 個劑量組 Ur 水平的差異無統計學意義（P>0.05）。與 SO 組比較，SAP 組大鼠血清 TNF-α 水平顯著升高（P<0.05）；與 SAP 組比較，低、中、高劑量組 TNF-α 水平均顯著降低（P<0.05）；中劑量組的 TNF-α 水平最低，顯著低于低劑量組（P<0.05），高劑量組 TNF-α 水平與中劑量組間的差異無統計學意義（P>0.05）。與 SO 組 NCST 亞組比較，SAP 組 NCST 亞組大鼠血清 Cor 水平顯著升高（P<0.05）；與 SAP 組 NCST 亞組比較，低劑量組 NCST 亞組 Cor 水平無顯著升高（P>0.05），中、高劑量組的 NCST 亞組 Cor 水平均顯著升高（P<0.05）；中、高劑量組 NCST 亞組 Cor 水平均顯著高于低劑量組 NCST 亞組（P<0.05），但中劑量組和高劑量組 NCST 亞組之間的差異無統計學意義（P>0.05）。二十四肽促皮質素干預后（CST 亞組）結果顯示，與 NCST 亞組比較，SO 組、中劑量組和高劑量組的 CST 亞組大鼠血清 Cor 水平均顯著升高（P<0.05），而 SAP 組和低劑量組的 CST 亞組大鼠血清 Cor 水平均無顯著升高（P>0.05）。具體見表 1。
表1
各組大鼠血清學指標以及胰腺和腎上腺病理評分結果（，n=8）
2.2 各 NCST 亞組大鼠胰腺組織病理學改變
光鏡下可見，SO 組胰腺結構清晰完整，未見明顯病理學改變；SAP 組胰腺組織可見彌漫小葉間隙擴張，胰腺實質出現廣泛出血、壞死，局部可見炎性細胞浸潤，病理評分均較 SO 組升高（P<0.05）；低劑量組胰腺組織同樣存在胰腺實質出血、壞死、胰腺小葉結構破壞等典型病理改變，其病理評分與 SAP 組比較差異無統計學意義（P>0.05）；中劑量組胰腺實質出血、壞死的程度和面積顯著改善，炎性細胞浸潤顯著減少，胰腺小葉結構尚可見，其病理評分顯著低于 SAP 組和低劑量組（P<0.05）；高劑量組胰腺組織的病理改變與中劑量組相當，其病理評分顯著低于 SAP 組和低劑量組（P<0.05），但與中劑量組比較差異無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 1a-1e 和表 1。
圖1
示各 NCST 亞組大鼠胰腺和腎上腺組織的病理改變及腎上腺組織油紅 O 染色結果
a–e：示各組大鼠胰腺組織的病理改變（HE ×200，標尺長度 100 μm）；f–j：示各組大鼠腎上腺組織的病理改變（HE ×200，標尺長度 50 μm）；k–o：示各組大鼠腎上腺組織的油紅 O 染色結果（油紅 O ×400，標尺長度 25 μm）
2.3 各 NCST 亞組大鼠腎上腺組織病理學改變
光鏡下可見，SO 組腎上腺組織結構清晰、完整，血液灌注良好；SAP 組腎上腺組織血液灌注不良，部分血竇擴張改變，皮質細胞出現空泡化改變，甚至出現結構消失、壞死等改變，散在炎癥細胞浸潤改變，其病理評分較 SAP 組顯著升高（P<0.05）；低劑量組腎上腺皮質層同樣存在血液灌注減少，皮質細胞變性、壞死，炎性細胞浸潤等典型改變，其病理評分與 SAP 組比較差異無統計學意義（P>0.05）；中劑量組腎上腺血液灌注顯著改善，細胞壞死、空泡化等改變顯著緩解，病理評分較 SAP 組和低劑量組顯著降低（P<0.05）；高劑量組腎上腺組織血液灌注充分，細胞壞死、空泡化改變以及炎癥細胞浸潤較 SAP 組和低劑量組顯著改善，病理評分顯著降低（P<0.05），但與中劑量組比較差異無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 1f-1j 和表 1。
2.4 各 NCST 亞組大鼠腎上腺油紅 O 染色結果
油紅 O 染色顯示各 NCST 亞組大鼠腎上腺組織中脂質含量：SO 組腎上腺皮質層內富含脂質，與 SO 組比較，SAP 組腎上腺皮質層脂質含量明顯減少；與 SAP 組比較，低劑量組腎上腺脂質含量無明顯增加，而中劑量組和高劑量組腎上腺脂質含量明顯增加（圖 1k-1o）。
3 討論
研究表明，重癥疾病如膿毒癥時可并發 RAI，RAI 時機體合成 Cor 的能力與病死率有關[6, 17]。Annetta 等[17]在研究膿毒癥模型時認為，當靜脈途徑短時間給以二十四肽促皮質素，血清中的 Cor 升高的水平<260 nmol/L 認為發生 RAI。Yu 等[18]研究發現，腎上腺作為重要的內分泌和抗炎器官，SAP 時出現 RAI 導致 Cor 分泌不足，進一步導致炎癥網絡調節失控，加重胰腺炎病情進展，但目前關于 SAP 時腎上腺合成 Cor 障礙的原因尚不十分清楚。
本研究通過牛磺膽酸鈉胰膽管逆行注射建立 SAP 模型，3 h 后血清檢測發現，AMY、ALT、AST、Ur、Cr 和 TNF-α 水平均顯著升高，胰腺出現實質出血、壞死，炎性細胞浸潤等病理改變，病理評分顯著升高；同時還發現，SAP 大鼠腎上腺出現血液灌注減少，皮質細胞空泡化、壞死、炎性細胞浸潤等病理改變，病理評分也顯著升高；此時 SAP 組大鼠血清 Cor 水平較 SO 組顯著升高。給予 CST 干預后發現，SAP 大鼠 Cor 雖有升高，但是與 SO 組相比升高幅度較低，而且與 NCST 亞組相比差異無統計學意義。以上結果表明，SAP 時存在包括 RAI 在內的多臟器功能障礙，其原因可能有：① 早期創傷、應激反應導致腎上腺皮質內脂質耗竭；② SAP 時消化酶、促炎介質入血，循環容量下降等造成腎上腺直接或間接損傷，最終導致 RAI 的發生。
筆者所在團隊前期在急性壞死性胰腺炎模型中證實， Cor 水平在建模后 1 h 達到高峰，維持至 3 h 后開始下降；腎上腺病理和結構損傷的“窗口期”可能在 SAP 的早期，早期進行干預處理可能是逆轉 SAP 相關損傷的關鍵時期[19]。因此本研究在 SAP 模型建立后 0.5 h 即給予梯度劑量胰島素皮下注射進行干預，3 h 后檢測發現低劑量組大鼠血清 AMY、ALT、AST、Ur、Cr 和 TNF-α 水平較 SAP 組有輕微下降，僅 ALT 和 TNF-α 水平差異明顯；中劑量組和高劑量組大鼠血清 AMY、ALT、AST、Ur、Cr 和 TNF-α 水平較 SAP 組有顯著下降，胰腺的病理損傷顯著改善，病理評分顯著下降，腎上腺的病理損傷和病理評分也有顯著改善，但是中劑量組和高劑量組之間的差異無統計學意義。進一步檢測發現中劑量組和高劑量組大鼠血清 Cor 水平較 SAP 組均顯著升高，CST 亞組血清 Cor 水平顯著高于非 CST 亞組，其升高幅度遠高于 SAP 組。這些結果提示，通過合適劑量外源性胰島素早期干預，不僅改善了 SAP 相關腎上腺損傷和 SAP 相關 RAI，還能夠降低（減輕）SAP 的嚴重程度和炎癥反應水平。這可能是外源性胰島素通過逆轉 SAP 相關 RAI 實現的。
Cor 為甾類激素，其主要的合成原料是膽固醇酯類，而腎上腺組織中的膽固醇酯類可以通過血液中攝取和自身合成來實現[20-22]。本研究通過油紅 O 染色發現，SAP 組大鼠腎上腺組織中脂質含量較 SO 組顯著減少，說明 SAP 大鼠腎上腺組織存在脂質消耗，這可能與 SAP 導致的應激狀態下 Cor 的合成釋放的消耗有關。胰島素是由胰島 β 細胞產生合成的一種多肽類激素，是機體能量代謝的關鍵分子，參與機體細胞脂質轉運和代謝過程[10]，直接或間接通過多種信號通路在腎上腺甾類激素合成中發揮重要作用[22-24]。筆者所在團隊前期動物實驗[25-26]發現，AP 大鼠和小鼠存在 β 細胞損傷，內源性胰島素釋放增多，但這些胰島素結構和功能可能并不完整。因此 SAP 時可能存在胰島素的相對不足，影響腎上腺獲取和合成膽固醇能力，進而影響 Cor 合成。本研究中通過外源性胰島素干預，可以使腎上腺組織中脂質含量顯著升高，CST 試驗結果也表明，外源性胰島素增加了 SAP 大鼠腎上腺脂質含量和皮質醇釋放的儲備能力。結果提示外源性胰島素可能是通過促進腎上腺組織攝取、合成膽固醇能力，促進 Cor 的合成與釋放，改善 SAP 相關 RAI，進而緩解 SAP 的炎癥反應程度。
綜上所述，SAP 早期存在腎上腺損傷和 RAI，但是這種改變在疾病早期是可以逆轉的。適量的外源性胰島素能夠改善腎上腺損傷，緩解 SAP 相關 RAI，但是其詳細機制仍需要進一步研究闡明。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：本課題由鄧文宏設計，實驗方案指導由王衛星、余佳完成，實驗過程由趙亮、梅方超、周瑜、李滿、余佳完成，數據分析由趙亮、鄧文宏完成，論文寫作由趙亮、梅方超、鄧文宏完成。
倫理聲明：本研究已通過武漢大學人民醫院倫理委員會實驗動物福利倫理的審核［批文編號：WDRM（福）第 20151114 號］。
