引用本文： 李四橋, 常清潭, 劉海潮, 劉少朋. 環狀 RNA circ-MFN2 在胰腺癌中的表達及其臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(6): 762-767. doi: 10.7507/1007-9424.202009025 復制
胰腺癌是常見的消化系統惡性腫瘤，多起源于胰腺腺管上皮細胞，惡性程度極高，被稱為“癌中之王” [1]。截至目前，胰腺癌在外科手術、放療、化療、免疫治療等領域均取得了一定進展，使其整體療效得到一定提升[2]，但胰腺癌起病隱匿，多數患者發現時已是中晚期，已喪失了有效的治療手段[3]，且目前仍缺乏較為有效的早期診斷指標。因此，不斷尋求胰腺癌早期診治的新靶點對改善患者預后，延長患者生存期至關重要。
環狀 RNA（circRNA） [4]是一類無 5′ 和 3′ 末端的特殊類型內源性非編碼 RNA（no coding RNA，ncRNA），因其結構呈閉合環狀，故稱為 circRNA。circRNA[5]存在于多種真核生物中，其序列高度保守，表達穩定，不受 RNA 外切酶影響，參與多種信號表達通路，已成為近年來繼長鏈非編碼 RNA（long non-coding NRA，lncRNA）后的又一研究熱點。研究[6-9]表明，circRNA 富含 miRNA 結合位點，主要參與轉錄及轉錄后的調控過程，與胰腺癌、肝癌、胃癌等多種腫瘤的進展及預后密切相關。目前在胰腺癌中已發現多種 circRNA 差異表達[10-15]，如環狀低密度脂蛋白受體結構域蛋白 3（circ-LDL RAD3）、環狀 ras 同源物基因家族成員 T1（circ-RHOT1）、circ-0007534、小腦變性相關蛋白 1 反義轉錄物（ciRS-7）、環狀異亮氨酰 tRNA 合成酶重組蛋白（circ-IARS）、環狀線粒體融合蛋白 2（circular mitochondrial fusin 2，circ-MFN2）等。筆者所在課題組通過 circRNA 基因芯片發現 MFN-2 在胰腺癌中差異表達（待發表），但目前關于其在胰腺癌中作用的相關研究仍較少，僅有楊帆[16]的報道發現 circ-MFN2 在胰腺癌中高表達，且與患者臨床病理參數及預后相關。因此，本研究旨在進一步探究 circ-MFN2 在胰腺癌中的表達及其臨床意義，以期為尋求胰腺癌新的診療靶點提供一定參考。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選取 2014 年 1 月至 2018 年 12 月期間在鄭州大學附屬洛陽中心醫院肝膽外科行手術治療的 55 例胰腺癌患者作為研究對象，同時選取同期在筆者所在醫院體檢的 55 例健康者作為對照。納入標準：① 均為原發腫瘤，無其他遠處臟器轉移。② 手術可切除，且手術前后均未行新輔助化療、放療及免疫治療。③ 術后經筆者所在醫院病理科兩位主任醫師閱片診斷為胰腺癌。④ 患者可耐受外科手術。⑤ 患者依從性良好，可接受全程隨訪。排除標準：① 繼發腫瘤或合并遠處臟器轉移。② 不可手術切除，或手術前后行新輔助化療、放療或免疫治療。③ 患者依從性差，無法保證隨訪者。本研究通過了筆者所在醫院的倫理委員會批準，并征得納入研究者的知情同意。
1.2 標本收集
① 組織標本收集：收集 55 例胰腺癌患者手術切除的癌組織以及相應的癌旁組織（距癌灶邊緣>3 cm），經 10% 甲醛固定、石蠟包埋后制作連續切片（4 μm 厚）。② 于手術前采集入組的 55 例胰腺癌患者的血液標本，同時采集對照組 55 例健康體檢者的血液標本。所有研究對象均使用 EDTA 抗凝紫色采血管抽取靜脈血 10 mL，即刻置入 4 ℃ 冰箱冷藏 30 min，在室溫 25 ℃ 下用離心機（3 000 r/min，離心半徑為 15 mm）離心 20 min，留取上層血清并置入–80 ℃ 冰箱保存備用。
1.3 實驗材料及試劑
Trizol RNA 提取試劑盒、qRT-PCR 試劑盒（貨號：KL-131042-25）及逆轉錄試劑盒（貨號：KL-TERT-Hu）購自上海康朗生物科技有限公司；qPCR 引物（circ-MFN2 上游引物：5′-CCAACATTACAGACCGGTGG-3′，下游引物：5′-CTCGAAGTTGGAAAGTGGAA-3′；β-actin 上游引物：5′-TACCTCCCAAGTCCTGTATGAG-3′，下游引物：5′-TGAGCAGCATCAAACTGTGTAG-3′）和 DEPC 液購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；紫外線分光光度計及 Bio-Rad CFX96 PCR 儀購自上海譜元儀器有限公司。
1.4 總 RNA 提取
參照 RNA 提取試劑盒說明書進行：在相應組織及血清中分別加入 1 mL 的 TRIzol 試劑作用 10 min，再加入 200 μL 氯仿，振蕩 15 s，室溫 25 ℃ 下靜置 10 min，在 4 ℃ 下以 12 000 r/min 的轉速離心 15 min（離心半徑為 60 mm）留取上清液，加入等體積異丙醇，混勻后同等條件再次離心 15 min，收集下層沉淀，用 75% 乙醇洗滌并晾干，加入 DEPC 液溶解后采用紫外線分光光度計測量總 RNA 濃度及 260 nm 和 280 nm 處的吸光度值（A260、A280）。設 A260/A280 在 1.8～2.0 間為合格樣品。
1.5 circ-MFN2 miRNA 表達檢測
采用實時熒光定量 PCR 法（qRT-PCR）。將提取的特定 miRNA 按照逆轉錄試劑盒反轉錄為 cDNA。設 β-actin 為內參照，按 qRT-PCR 試劑盒說明書進行 PCR 反應，Bio-Rad CFX96 PCR 儀測定 circ-MFN2 及 β-actin 的 miRNA 表達情況。反應條件為: 95 ℃ 預變性 30 s，進入以下循環：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，檢測，共重復 40 個循環，然后再 95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s，0.5 ℃ 5 s，最終進行檢測。采用公式目的基因相對表達量（RQ）=2–△△CT 法計算 circ-MFN2 miRNA 相對表達量，其中 ΔΔCT=（實驗組目的基因 CT–實驗組內參基因 CT）–（對照組目的基因 CT–對照組內參基因 CT）。
1.6 隨訪
入組病例均定期隨訪，即術后前 3 個月 1 次/月，術后 3～6 個月 1 次/2 個月，此后 1 次/3 個月；隨訪方式主要采用電話隨訪、門診隨訪、定期來院復查隨訪、上門隨訪、微信隨訪等。隨訪內容主要為記錄患者治療效果、出院后病情變化及恢復情況、腫瘤有無復發及復發時間、目前有無新發癥狀等，同時指導患者復診時間、注意事項等。末次隨訪時間為 2020 年 6 月 30 日。至隨訪截止日，入組病例中，生存 19 例，死亡 32 例，失訪 4 例。
1.7 分析指標及其方法
① 檢測胰腺癌患者癌組織及血清中 circ-MFN2 miRNA 的表達，并分別與癌旁組織及健康對照組進行比較；② 分析胰腺癌組織中 circ-MFN2 miRNA 的表達與胰腺癌患者臨床病理特征及預后間的相關性；③ 計算 circ-MFN2 miRNA 表達診斷胰腺癌的敏感度、特異度和診斷準確率，繪制 ROC 曲線分析其作為胰腺癌早期診斷生物標志物的效能；④ COX 多因素回歸分析篩選胰腺癌預后的獨立危險因素。
1.8 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計學軟件進行統計分析。計量資料符合正態分布，用均數±標準差（
±s）表示，組間比較采用 LSD-t 檢驗。計數資料以例（%）表示，組間相關性比較采用配對或成組 χ2 檢驗或連續性校正的χ2 檢驗。生存分析采用 Kaplan-Meier 法及 log-rank 檢驗。COX 回歸分析篩選影響胰腺癌預后的危險因素。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 胰腺癌組織及血清中 circ-MFN2 miRNA 表達檢測結果
胰腺癌組織及其癌旁組織病理切片見圖 1a 和 1b。qRT-PCR 法檢測結果顯示：circ-MFN2 miRNA 在胰腺癌組織中的相對表達量為 11.90±0.40，明顯高于癌旁組織中的 1.48±0.24（P<0.05），見圖 1c；circ-MFN2 miRNA 在胰腺癌患者血清中的相對表達量為 9.57±0.41，明顯高于對照組血清中的 1.06±0.16（P<0.05），見圖 1d。
圖1
示胰腺癌及其癌旁組織的病理切片以及 qRT-PCR 法檢測 circ-MFN2 miRNA 表達結果
a：胰腺癌組織（HE ×400）；b：癌旁組織（HE ×400）；c：circ-MFN2 miRNA 在胰腺癌組織及癌旁組織中的表達結果；d：circ-MFN2 miRNA 在胰腺癌患者及對照組血清中的表達結果
2.2 胰腺癌組織中 circ-MFN2 miRNA 的表達與其臨床病理特征的關系
依據癌組織比癌旁組織中 circ-MFN2 miRNA 相對表達量的中位數（為 7.0344），將 55 例患者分為高表達組（相對表達量≥7.03，n=48）及低表達組（相對表達量<7.03，n=7）。其結果顯示：circ-MFN2 miRNA 在胰腺癌組織中的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、病理學類型和腫瘤部位無相關性（均 P>0.05），但與 TNM 分期[17]、CA19-9 水平、腫瘤分化程度及淋巴結轉移顯著相關（均 P<0.05）。見表 1。
表1
circ-MFN2 miRNA 的表達與胰腺癌患者臨床病理特征的相關性分析結果［例（%） ］
2.3 circ-MFN2 miRNA 表達與胰腺癌患者預后的相關性分析結果
Kaplan-Meier 生存分析顯示，circ-MFN2 miRNA 高表達患者的中位生存時間為 9.1 個月，低表達患者中位生存時間為 22.3 個月，其差異有統計學意義（P<0.05），見圖 2a。
圖2
示 circ-MFN2 miRNA 不同表達狀態胰腺癌患者的生存曲線以及血清 circ-MFN2 miRNA 表達與 CA19-9 水平的相關性
a：circ-MFN2 miRNA 不同表達狀態胰腺癌患者的生存曲線；b–d：血清 circ-MFN2 miRNA 不同表達狀態與 CA19-9 水平的相關性
2.4 血清 circ-MFN2 miRNA 表達與 CA19-9 水平的相關性分析結果
進一步分析血清 circ-MFN2 miRNA 表達與 CA19-9 水平的相關性發現：胰腺癌患者血清 circ-MFN2 miRNA 表達與 CA19-9 的水平呈正相關關系（r=0.846，P=0.000）。其中，circ-MFN2 miRNA 高表達組相關性為（r=0.916，P=0.000），低表達組相關性為（r=0.783，P=0.000），見圖 2b-2d。
2.5 血清 circ-MFN2 miRNA 表達診斷胰腺癌的效能
依據診斷試驗臨床效能評價方法[19]確定血清 circ-MFN2 miRNA 相對表達量的臨界值為 4.11，CA19-9 的臨界值為 37 U/mL。根據上述臨界值計算 circ-MFN2 miRNA 表達診斷胰腺癌的敏感度、特異度和準確率分別為 72.7%、70.9% 及 83.6%，均明顯高于 CA19-9 的 54.5%、50.9% 和 52.7%（均 P<0.05）。ROC 曲線分析結果顯示，circ-MFN2 miRNA 曲線下面積為 0.861 ［95%CI 為（0.775，1.157）］，而 CA19-9 的曲線下面積為 0.619 ［95%CI 為（0.509，0.728）］，兩者間的差異具有統計學意義（P<0.05），見圖 3。
圖3
示 circ-MFN2 miRNA（a）及 CA19-9 （b）的ROC 曲線
2.6 影響胰腺癌患者預后的單因素及多因素分析結果
Kaplan-Meier 法單因素分析結果顯示，circ-MFN2 miRNA 表達、CA19-9 水平、腫瘤 TNM 分期、分化程度及淋巴結轉移是影響胰腺癌患者預后的因素（均 P<0.05），見表 2。Cox 多因素分析結果顯示，circ-MFN2 miRNA 表達及淋巴結轉移是影響胰腺癌患者預后的獨立危險因素（均 P<0.05），見表 3。
表2
影響胰腺癌患者預后的單因素分析（n=55）
表3
影響胰腺癌患者預后的多因素分析（n=55）
3 討論
胰腺癌發病隱匿，且由于缺乏敏感度和特異度較高的診斷指標，因此早期診斷困難[20]，多數患者確診時已是中晚期，喪失了諸如外科手術等有效的治療手段，導致治療效果仍較差[21]。因此胰腺癌的早期診斷對其治療及預后意義重大。此外，胰腺癌化療耐藥仍是目前治療中突出的問題，不斷尋求新的分子靶點亦具有十分重要的意義。
circRNA 長度在 200～2 000 bp 之間，與傳統的線性 RNA（linerRNA）不同，circRNA 可在信使 RNA（messenger RNA，mRNA）前體的加工過程中形成閉合環狀結構[22-23]。研究[24-27]表明，circRNA 可與靶基因 mRNA 3′ 端的非編碼堿基結合，降解 mRNA，進而誘導目的基因沉默，影響目的蛋白的表達。此外，circRNA 還可作為 RNA 結合蛋白（RNA-binding protein，RBP）的海綿，發揮海綿作用，與 RBP 結合形成 RNA-蛋白復合物（RNA protein complex，RPC）參與基因剪切、轉錄、翻譯等重要過程，最終影響并調控腫瘤的發生與發展進程。
目前已發現多種 circRNA 與胰腺癌關系密切，作為其中之一，circ-MFN2 的研究較少。本研究通過檢測胰腺癌患者癌組織及血清 circ-MFN2 mRNA 表達發現，circ-MFN2 mRNA 在胰腺癌組織中的相對表達水平明顯高于癌旁組織，且在胰腺癌患者血清中的相對表達水平也明顯高于對照組血清，證實了 circ-MFN2 mRNA 在胰腺癌中呈高表達狀態。Chi-Square 檢驗發現 circ-MFN2 mRNA 的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、病理學類型和腫瘤部位均無相關性，但與 CA19-9 水平、TNM 分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移具有相關性；進一步行 Kaplan-Meier 分析發現，circ-MFN2 mRNA 高表達患者的中位生存時間較低表達患者明顯縮短，且通過 COX 多因素回歸分析發現，circ-MFN2 mRNA 表達是胰腺癌患者預后的獨立危險因素。以上研究結果提示：circ-MFN2 mRNA 不僅在胰腺癌組織中高表達，且參與了胰腺癌的發展進程，與胰腺癌患者的病理特征及臨床預后密切相關，circ-MFN2 mRNA 高表達多提示預后不良，這與楊帆[16]的研究結果一致。此外，本研究發現 circ-MFN2 mRNA 的表達與傳統胰腺癌腫瘤標志物 CA19-9 的表達呈正相關性。通過繪制 ROC 曲線，并與 CA19-9 對比發現，circ-MFN2 mRNA 診斷胰腺癌的效能高于 CA19-9。鑒于其較高的檢測效能，且與胰腺癌進展關系密切，其有望成為預測胰腺癌預后的新型分子標志物及潛在的分子治療靶點的可能。但 circ-MFN2 在胰腺癌中具體的作用機制，例如靶向 miRNA 之間的功能關系等尚未完全清楚，本課題組后續將從信號通路、分子機制等方面更加深入地研究 circ-MFN2 與胰腺癌的關系。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：李四橋，負責本課題的實驗設計、實驗操作、標本取材及制作、數據統計等；常清潭、劉海潮、劉少朋協助完成相關實驗及數據收集和整理。
倫理聲明：本研究已通過鄭州大學附屬洛陽中心醫院倫理審核批準（批文編號：2014-1-7）。
胰腺癌是常見的消化系統惡性腫瘤，多起源于胰腺腺管上皮細胞，惡性程度極高，被稱為“癌中之王” [1]。截至目前，胰腺癌在外科手術、放療、化療、免疫治療等領域均取得了一定進展，使其整體療效得到一定提升[2]，但胰腺癌起病隱匿，多數患者發現時已是中晚期，已喪失了有效的治療手段[3]，且目前仍缺乏較為有效的早期診斷指標。因此，不斷尋求胰腺癌早期診治的新靶點對改善患者預后，延長患者生存期至關重要。
環狀 RNA（circRNA） [4]是一類無 5′ 和 3′ 末端的特殊類型內源性非編碼 RNA（no coding RNA，ncRNA），因其結構呈閉合環狀，故稱為 circRNA。circRNA[5]存在于多種真核生物中，其序列高度保守，表達穩定，不受 RNA 外切酶影響，參與多種信號表達通路，已成為近年來繼長鏈非編碼 RNA（long non-coding NRA，lncRNA）后的又一研究熱點。研究[6-9]表明，circRNA 富含 miRNA 結合位點，主要參與轉錄及轉錄后的調控過程，與胰腺癌、肝癌、胃癌等多種腫瘤的進展及預后密切相關。目前在胰腺癌中已發現多種 circRNA 差異表達[10-15]，如環狀低密度脂蛋白受體結構域蛋白 3（circ-LDL RAD3）、環狀 ras 同源物基因家族成員 T1（circ-RHOT1）、circ-0007534、小腦變性相關蛋白 1 反義轉錄物（ciRS-7）、環狀異亮氨酰 tRNA 合成酶重組蛋白（circ-IARS）、環狀線粒體融合蛋白 2（circular mitochondrial fusin 2，circ-MFN2）等。筆者所在課題組通過 circRNA 基因芯片發現 MFN-2 在胰腺癌中差異表達（待發表），但目前關于其在胰腺癌中作用的相關研究仍較少，僅有楊帆[16]的報道發現 circ-MFN2 在胰腺癌中高表達，且與患者臨床病理參數及預后相關。因此，本研究旨在進一步探究 circ-MFN2 在胰腺癌中的表達及其臨床意義，以期為尋求胰腺癌新的診療靶點提供一定參考。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選取 2014 年 1 月至 2018 年 12 月期間在鄭州大學附屬洛陽中心醫院肝膽外科行手術治療的 55 例胰腺癌患者作為研究對象，同時選取同期在筆者所在醫院體檢的 55 例健康者作為對照。納入標準：① 均為原發腫瘤，無其他遠處臟器轉移。② 手術可切除，且手術前后均未行新輔助化療、放療及免疫治療。③ 術后經筆者所在醫院病理科兩位主任醫師閱片診斷為胰腺癌。④ 患者可耐受外科手術。⑤ 患者依從性良好，可接受全程隨訪。排除標準：① 繼發腫瘤或合并遠處臟器轉移。② 不可手術切除，或手術前后行新輔助化療、放療或免疫治療。③ 患者依從性差，無法保證隨訪者。本研究通過了筆者所在醫院的倫理委員會批準，并征得納入研究者的知情同意。
1.2 標本收集
① 組織標本收集：收集 55 例胰腺癌患者手術切除的癌組織以及相應的癌旁組織（距癌灶邊緣>3 cm），經 10% 甲醛固定、石蠟包埋后制作連續切片（4 μm 厚）。② 于手術前采集入組的 55 例胰腺癌患者的血液標本，同時采集對照組 55 例健康體檢者的血液標本。所有研究對象均使用 EDTA 抗凝紫色采血管抽取靜脈血 10 mL，即刻置入 4 ℃ 冰箱冷藏 30 min，在室溫 25 ℃ 下用離心機（3 000 r/min，離心半徑為 15 mm）離心 20 min，留取上層血清并置入–80 ℃ 冰箱保存備用。
1.3 實驗材料及試劑
Trizol RNA 提取試劑盒、qRT-PCR 試劑盒（貨號：KL-131042-25）及逆轉錄試劑盒（貨號：KL-TERT-Hu）購自上海康朗生物科技有限公司；qPCR 引物（circ-MFN2 上游引物：5′-CCAACATTACAGACCGGTGG-3′，下游引物：5′-CTCGAAGTTGGAAAGTGGAA-3′；β-actin 上游引物：5′-TACCTCCCAAGTCCTGTATGAG-3′，下游引物：5′-TGAGCAGCATCAAACTGTGTAG-3′）和 DEPC 液購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；紫外線分光光度計及 Bio-Rad CFX96 PCR 儀購自上海譜元儀器有限公司。
1.4 總 RNA 提取
參照 RNA 提取試劑盒說明書進行：在相應組織及血清中分別加入 1 mL 的 TRIzol 試劑作用 10 min，再加入 200 μL 氯仿，振蕩 15 s，室溫 25 ℃ 下靜置 10 min，在 4 ℃ 下以 12 000 r/min 的轉速離心 15 min（離心半徑為 60 mm）留取上清液，加入等體積異丙醇，混勻后同等條件再次離心 15 min，收集下層沉淀，用 75% 乙醇洗滌并晾干，加入 DEPC 液溶解后采用紫外線分光光度計測量總 RNA 濃度及 260 nm 和 280 nm 處的吸光度值（A260、A280）。設 A260/A280 在 1.8～2.0 間為合格樣品。
1.5 circ-MFN2 miRNA 表達檢測
采用實時熒光定量 PCR 法（qRT-PCR）。將提取的特定 miRNA 按照逆轉錄試劑盒反轉錄為 cDNA。設 β-actin 為內參照，按 qRT-PCR 試劑盒說明書進行 PCR 反應，Bio-Rad CFX96 PCR 儀測定 circ-MFN2 及 β-actin 的 miRNA 表達情況。反應條件為: 95 ℃ 預變性 30 s，進入以下循環：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，檢測，共重復 40 個循環，然后再 95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s，0.5 ℃ 5 s，最終進行檢測。采用公式目的基因相對表達量（RQ）=2–△△CT 法計算 circ-MFN2 miRNA 相對表達量，其中 ΔΔCT=（實驗組目的基因 CT–實驗組內參基因 CT）–（對照組目的基因 CT–對照組內參基因 CT）。
1.6 隨訪
入組病例均定期隨訪，即術后前 3 個月 1 次/月，術后 3～6 個月 1 次/2 個月，此后 1 次/3 個月；隨訪方式主要采用電話隨訪、門診隨訪、定期來院復查隨訪、上門隨訪、微信隨訪等。隨訪內容主要為記錄患者治療效果、出院后病情變化及恢復情況、腫瘤有無復發及復發時間、目前有無新發癥狀等，同時指導患者復診時間、注意事項等。末次隨訪時間為 2020 年 6 月 30 日。至隨訪截止日，入組病例中，生存 19 例，死亡 32 例，失訪 4 例。
1.7 分析指標及其方法
① 檢測胰腺癌患者癌組織及血清中 circ-MFN2 miRNA 的表達，并分別與癌旁組織及健康對照組進行比較；② 分析胰腺癌組織中 circ-MFN2 miRNA 的表達與胰腺癌患者臨床病理特征及預后間的相關性；③ 計算 circ-MFN2 miRNA 表達診斷胰腺癌的敏感度、特異度和診斷準確率，繪制 ROC 曲線分析其作為胰腺癌早期診斷生物標志物的效能；④ COX 多因素回歸分析篩選胰腺癌預后的獨立危險因素。
1.8 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計學軟件進行統計分析。計量資料符合正態分布，用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用 LSD-t 檢驗。計數資料以例（%）表示，組間相關性比較采用配對或成組 χ2 檢驗或連續性校正的χ2 檢驗。生存分析采用 Kaplan-Meier 法及 log-rank 檢驗。COX 回歸分析篩選影響胰腺癌預后的危險因素。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 胰腺癌組織及血清中 circ-MFN2 miRNA 表達檢測結果
胰腺癌組織及其癌旁組織病理切片見圖 1a 和 1b。qRT-PCR 法檢測結果顯示：circ-MFN2 miRNA 在胰腺癌組織中的相對表達量為 11.90±0.40，明顯高于癌旁組織中的 1.48±0.24（P<0.05），見圖 1c；circ-MFN2 miRNA 在胰腺癌患者血清中的相對表達量為 9.57±0.41，明顯高于對照組血清中的 1.06±0.16（P<0.05），見圖 1d。
圖1
示胰腺癌及其癌旁組織的病理切片以及 qRT-PCR 法檢測 circ-MFN2 miRNA 表達結果
a：胰腺癌組織（HE ×400）；b：癌旁組織（HE ×400）；c：circ-MFN2 miRNA 在胰腺癌組織及癌旁組織中的表達結果；d：circ-MFN2 miRNA 在胰腺癌患者及對照組血清中的表達結果
2.2 胰腺癌組織中 circ-MFN2 miRNA 的表達與其臨床病理特征的關系
依據癌組織比癌旁組織中 circ-MFN2 miRNA 相對表達量的中位數（為 7.0344），將 55 例患者分為高表達組（相對表達量≥7.03，n=48）及低表達組（相對表達量<7.03，n=7）。其結果顯示：circ-MFN2 miRNA 在胰腺癌組織中的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、病理學類型和腫瘤部位無相關性（均 P>0.05），但與 TNM 分期[17]、CA19-9 水平、腫瘤分化程度及淋巴結轉移顯著相關（均 P<0.05）。見表 1。
表1
circ-MFN2 miRNA 的表達與胰腺癌患者臨床病理特征的相關性分析結果［例（%） ］
2.3 circ-MFN2 miRNA 表達與胰腺癌患者預后的相關性分析結果
Kaplan-Meier 生存分析顯示，circ-MFN2 miRNA 高表達患者的中位生存時間為 9.1 個月，低表達患者中位生存時間為 22.3 個月，其差異有統計學意義（P<0.05），見圖 2a。
圖2
示 circ-MFN2 miRNA 不同表達狀態胰腺癌患者的生存曲線以及血清 circ-MFN2 miRNA 表達與 CA19-9 水平的相關性
a：circ-MFN2 miRNA 不同表達狀態胰腺癌患者的生存曲線；b–d：血清 circ-MFN2 miRNA 不同表達狀態與 CA19-9 水平的相關性
2.4 血清 circ-MFN2 miRNA 表達與 CA19-9 水平的相關性分析結果
進一步分析血清 circ-MFN2 miRNA 表達與 CA19-9 水平的相關性發現：胰腺癌患者血清 circ-MFN2 miRNA 表達與 CA19-9 的水平呈正相關關系（r=0.846，P=0.000）。其中，circ-MFN2 miRNA 高表達組相關性為（r=0.916，P=0.000），低表達組相關性為（r=0.783，P=0.000），見圖 2b-2d。
2.5 血清 circ-MFN2 miRNA 表達診斷胰腺癌的效能
依據診斷試驗臨床效能評價方法[19]確定血清 circ-MFN2 miRNA 相對表達量的臨界值為 4.11，CA19-9 的臨界值為 37 U/mL。根據上述臨界值計算 circ-MFN2 miRNA 表達診斷胰腺癌的敏感度、特異度和準確率分別為 72.7%、70.9% 及 83.6%，均明顯高于 CA19-9 的 54.5%、50.9% 和 52.7%（均 P<0.05）。ROC 曲線分析結果顯示，circ-MFN2 miRNA 曲線下面積為 0.861 ［95%CI 為（0.775，1.157）］，而 CA19-9 的曲線下面積為 0.619 ［95%CI 為（0.509，0.728）］，兩者間的差異具有統計學意義（P<0.05），見圖 3。
圖3
示 circ-MFN2 miRNA（a）及 CA19-9 （b）的ROC 曲線
2.6 影響胰腺癌患者預后的單因素及多因素分析結果
Kaplan-Meier 法單因素分析結果顯示，circ-MFN2 miRNA 表達、CA19-9 水平、腫瘤 TNM 分期、分化程度及淋巴結轉移是影響胰腺癌患者預后的因素（均 P<0.05），見表 2。Cox 多因素分析結果顯示，circ-MFN2 miRNA 表達及淋巴結轉移是影響胰腺癌患者預后的獨立危險因素（均 P<0.05），見表 3。
表2
影響胰腺癌患者預后的單因素分析（n=55）
表3
影響胰腺癌患者預后的多因素分析（n=55）
3 討論
胰腺癌發病隱匿，且由于缺乏敏感度和特異度較高的診斷指標，因此早期診斷困難[20]，多數患者確診時已是中晚期，喪失了諸如外科手術等有效的治療手段，導致治療效果仍較差[21]。因此胰腺癌的早期診斷對其治療及預后意義重大。此外，胰腺癌化療耐藥仍是目前治療中突出的問題，不斷尋求新的分子靶點亦具有十分重要的意義。
circRNA 長度在 200～2 000 bp 之間，與傳統的線性 RNA（linerRNA）不同，circRNA 可在信使 RNA（messenger RNA，mRNA）前體的加工過程中形成閉合環狀結構[22-23]。研究[24-27]表明，circRNA 可與靶基因 mRNA 3′ 端的非編碼堿基結合，降解 mRNA，進而誘導目的基因沉默，影響目的蛋白的表達。此外，circRNA 還可作為 RNA 結合蛋白（RNA-binding protein，RBP）的海綿，發揮海綿作用，與 RBP 結合形成 RNA-蛋白復合物（RNA protein complex，RPC）參與基因剪切、轉錄、翻譯等重要過程，最終影響并調控腫瘤的發生與發展進程。
目前已發現多種 circRNA 與胰腺癌關系密切，作為其中之一，circ-MFN2 的研究較少。本研究通過檢測胰腺癌患者癌組織及血清 circ-MFN2 mRNA 表達發現，circ-MFN2 mRNA 在胰腺癌組織中的相對表達水平明顯高于癌旁組織，且在胰腺癌患者血清中的相對表達水平也明顯高于對照組血清，證實了 circ-MFN2 mRNA 在胰腺癌中呈高表達狀態。Chi-Square 檢驗發現 circ-MFN2 mRNA 的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、病理學類型和腫瘤部位均無相關性，但與 CA19-9 水平、TNM 分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移具有相關性；進一步行 Kaplan-Meier 分析發現，circ-MFN2 mRNA 高表達患者的中位生存時間較低表達患者明顯縮短，且通過 COX 多因素回歸分析發現，circ-MFN2 mRNA 表達是胰腺癌患者預后的獨立危險因素。以上研究結果提示：circ-MFN2 mRNA 不僅在胰腺癌組織中高表達，且參與了胰腺癌的發展進程，與胰腺癌患者的病理特征及臨床預后密切相關，circ-MFN2 mRNA 高表達多提示預后不良，這與楊帆[16]的研究結果一致。此外，本研究發現 circ-MFN2 mRNA 的表達與傳統胰腺癌腫瘤標志物 CA19-9 的表達呈正相關性。通過繪制 ROC 曲線，并與 CA19-9 對比發現，circ-MFN2 mRNA 診斷胰腺癌的效能高于 CA19-9。鑒于其較高的檢測效能，且與胰腺癌進展關系密切，其有望成為預測胰腺癌預后的新型分子標志物及潛在的分子治療靶點的可能。但 circ-MFN2 在胰腺癌中具體的作用機制，例如靶向 miRNA 之間的功能關系等尚未完全清楚，本課題組后續將從信號通路、分子機制等方面更加深入地研究 circ-MFN2 與胰腺癌的關系。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：李四橋，負責本課題的實驗設計、實驗操作、標本取材及制作、數據統計等；常清潭、劉海潮、劉少朋協助完成相關實驗及數據收集和整理。
倫理聲明：本研究已通過鄭州大學附屬洛陽中心醫院倫理審核批準（批文編號：2014-1-7）。
