引用本文： 楊婕, 賀育華, 蔣理立. 基于高通量測序技術分析加速康復外科管理流程對結直腸癌患者腸道菌群的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(12): 1501-1505. doi: 10.7507/1007-9424.202006057 復制
隨著微生態學的發展，腸道菌群與結直腸癌的關系受到關注[1-2]。研究[3-6]表明，結直腸癌的發生與腸道菌群失調有關，且手術創傷可破壞正常腸道形態，加之抗感染、禁食、禁飲等圍術期處理措施進一步加重了腸道菌群結構的紊亂和腸屏障損傷，患者易出現內毒素血癥、感染性腹瀉等并發癥，嚴重影響到臨床治療的效果和預后。加速康復外科（ERAS）流程管理旨在優化圍術期流程管理以減少手術患者的身心創傷應激，促進患者快速康復[7]。然而關于 ERAS 模式下對結直腸癌患者圍術期腸道微生態結構的影響卻鮮有報道；此外，相較于傳統的管理模式，ERAS 是否更有利于術后腸道菌群結構的平衡和重建成為亟待證實和探索的問題。基于此，本研究擬引入高通量測序技術，通過全面分析腸道微生物的多樣性及菌群結構，對上述問題進行探索。
1 對象與方法
1.1 研究對象
患者納入標準：① 采用便利抽樣方法納入 2018 年 8 月至 2019 年 12 月期間四川大學華西醫院胃腸外科的結直腸癌患者為研究對象；② 年齡 18～74 歲；③ 經術前腸鏡病理活檢診斷為結直腸癌；④ 腹腔和盆腔 B 超或 CT 及胸片檢查提示無遠處轉移；⑤ 無手術禁忌證；⑥ 患者知情同意，自愿參與本研究。排除標準：① 既往有結直腸手術史；② 近 1 個月內使用益生菌、微生態活菌制劑、抗生素、二甲雙胍、質子泵抑制劑、黃連素、導瀉劑；③ 術前接受過放化療治療；④ 合并有糖尿病（含 1 型及 2 型）、肥胖、痛風等慢性代謝性疾病；⑤ 術前伴有腸道炎癥、腸穿孔、腸梗阻及嚴重全身性疾病。采用預先設計好的 Excel 隨機函數“RAND（）”將研究對象隨機分為 ERAS 組或傳統治療組（傳統組）。
1.2 圍術期管理方法
圍術期管理在 ERAS 組按 ERAS 管理流程，在傳統組按傳統流程，具體見表 1。
表1
ERAS 組與傳統組圍術期管理措施
1.3 高通量測序
1.3.1 糞便標本采集
于入院 24 h 內、術后第 1 次自然排便時分別采集研究對象的新鮮糞便標本 3 g，要求避免尿液、灰塵等污染，用已滅菌糞便收集管盛裝，置于–80 ℃ 冰箱冷凍保存，干冰運送至上海歐易生物科技有限公司進行高通量測序。
1.3.2 DNA 提取、PCR 擴增與建庫
運用 DNA 抽提試劑盒對糞便標本的基因組 DNA 進行抽提，對 16 Sr DNA V3～V4 區進行擴增。PCR 產物用電泳檢測，然后用磁珠純化，純化后作為第 2 輪 PCR 模板并行第 2 輪 PCR 擴增，再次使電泳檢測，然后用磁珠純化，純化后對 PCR 產物進行 Qubit 定量。根據 PCR 產物濃度進行等量混樣并上機測序。
1.3.3 數據處理及操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）
使用 Illumina MiSeq 測序生成原始雙端序列 raw data，使用 Trimmomatic 軟件（version 0.35）對 raw data 序列進行掃描，得到合格的雙端 raw data。用 Flash 軟件（version 1.2.11）對合格的雙端 raw data 進行拼接并得到完整雙端測序序列 paired end。用 Qiime 中的 split_libraries（version 1.8.0）軟件去除 paired end 序列中單堿基重復大于 8、含 N 堿基及長度小于 200 bp 的序列后得到 clean tags 序列，再用 UCHIME 軟件（version 2.4.2）去除 clean tags 中的嵌合體，對質控得到的優質序列 valid tags 用 Vsearch 軟件（version 2.4.2）按照 97% 的相似度進行 OTU 分類，得到用于 OTU 劃分的 valid tags。采用 RDP classifier Naive Bayesian 分類算法，以每個 OTU 中豐度最大的序列作為該 OTU 的代表序列，通過與數據庫進行比對注釋，得到 OTU 的注釋信息。
1.3.4 生物信息學分析
① alpha 多樣性分析反映生物環境內物種的多樣性程度，包括 Shannon 指數和 Simpson 指數[8]，數值越大代表物種多樣性越豐富。通過 R 軟件（V3.1.0）繪制盒形圖。2 組手術前、后 Shannon 指數和 Simpson 指數比較用秩和檢驗。檢驗水準ɑ=0.05。② beta 多樣性分析，主要用于比較不同分組樣本的差異。用 Qiime 軟件，通過主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PcoA）可視化觀察個體或群體間的差異。每個點代表 1 個樣本，相同顏色代表相同分組。③ 群落結構分布，基于 OTU 分類結果，用 Qiime 軟件與數據庫 greengene 比對進行物種注釋，分別獲得樣品在門水平和屬水平的相對豐度，用 R 包中的 barplot 獲得柱狀圖。
2 結果
2.1 納入患者的基本情況
本研究共納入 60 例結直腸癌患者，年齡 18～74 歲；傳統組 30 例，ERAS 組 27 例（3 例患者在術后拒絕標本采集臨時退出本研究），2 組患者的基本情況比較差異無統計學意義（P>0.05），見表 2。
表2
傳統組和 ERAS 組患者的一般資料及臨床資料比較
2.2 標本 OTU 結果
質控后的 clean tags 數據量 38 044～41 991，valid tags 數據量 26 117～39 341，valid tags 平均長度 404.43～437.52 bp，各樣本 OTU 數量為 329～2 192。
2.3 ERAS 組與傳統組手術前后生物信息學分析結果
2.3.1 alpha 多樣性
結果見圖 1a、1b。alpha 多樣性分析的 Shannon 指數和 Simpson 指數在術前 2 組間和術后 2 組間以及傳統組和 EARS 組在各自組內的術前與術后比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
圖1
示 ERAS 組與傳統組手術前后生物信息學分析結果
a：Shannon 指數；b：Simpson 指數；c：術前 PcoA 可視化圖；d：術后 PcoA 可視化圖；e：門水平下菌落豐度排序 TOP15 的柱狀圖；f：屬水平下菌落豐度排序 TOP15 的柱狀圖
2.3.2 beta 多樣性
結果見圖 1c、1d。術前傳統組和 ERAS 組的群落構成比較差異不明顯，術后傳統組和 ERAS 組的群落構成出現明顯分界。
2.3.3 群落結構分布
① 門水平下 ERAS 組與傳統組手術前后豐度排序前 15 位的物種柱狀圖見圖 1e，從圖 1e 可見，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門為優勢菌門，在同一組內與其術前豐度比較，厚壁菌門在傳統組術后下降 26.5%、ERAS 組僅下降 5.5%，擬桿菌門傳統組術后提升 21.6%、ERAS 組僅提升 4.7%，變形菌門傳統組術后提升 7.2%、ERAS 組僅提升 2.2%。② 屬水平下 ERAS 組與傳統組手術前后豐度排序前 15 位的物種柱狀圖見圖 1f，從圖 1f 可見，在同一組內與其術前豐度比較，擬桿菌屬在傳統組術后提升 17.6%、ERAS 組術后下降 1.6%，雙歧桿菌屬傳統組術后下降 1.8%、ERAS 組下降 1.3%。
3 討論
3.1 ERAS 模式對腸道菌群多樣性無明顯影響
較高的 alpha 多樣性指數往往預示著健康[9]。因此，結直腸癌患者的腸道微生物群多樣性常低于正常健康人群[10]。Cong 等[11]的研究發現，結直腸癌患者術后腸道菌群 alpha 多樣性指數明顯低于術前，考慮與抗生素的使用導致腸道菌群的多樣性降低有關[12]。在本研究中，不論是 ERAS 組還是傳統組，術后菌群多樣性均有下降趨勢，但差異并無統計學意義，其可能的原因是，ERAS 組與傳統組在圍術期均使用抗生素，其中 ERAS 組為術中預防性使用抗生素，傳統組則采用術后使用，而患者通常在術后 1～2 d 即可自解大便并進行術后采樣，此時 2 組患者抗生素的累計用量均較小，由此出現腸道菌群多樣性較術前變化不明顯的情況；術后，ERAS 組與傳統組間比較差異也無統計學意義，結果提示，相較于繁瑣的傳統術前準備方法，ERAS 這一高效的臨床運作模式并不會對腸道菌群的物種多樣性造成影響。
3.2 ERAS 模式對菌群結構的損傷較小且更有利于腸道微生態的恢復和重建
本研究中，術前傳統組與 ERAS 組的群落結構差異不明顯，而術后傳統組與 ERAS 組的群落構成出現明顯分界，結果提示，術后群落結構存在顯著差異，進一步對 2 組患者手術前后群落結構分布進行比較發現，在門水平下，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門仍然為優勢菌門，與相關研究[13]結果一致。厚壁菌門參與腸道營養物質的吸收并在抵御外來病原體侵襲方面發揮著重要作用，而擬桿菌門中擬桿菌屬是主要微生物種類，其通過分泌活化的氧自由基可降低子基因組的穩定性，從而致使細胞突變和腫瘤的發生，因此，作為條件致病菌，特別是進入到胃腸道以外的部位時可引起感染或膿腫加劇[14-15]，特別是擬桿菌屬下的脆弱擬桿菌，可合成分泌脆弱擬桿菌毒素，與結腸上皮細胞膜特異性受體結合，激活核因子?κB 和 Wnt 信號通路，導致細胞增殖、炎性介質大量釋放和 DNA 損傷[16-17]。
本研究中，傳統組術后厚壁菌門豐度較術前下降 26.5%、ERAS 組僅下降 5.5%，傳統組術后擬桿菌門豐度較術前提升 21.6%、ERAS 組僅提升 4.7%，傳統組術后擬桿菌屬豐度較術前提升 17.6%、ERAS 下降 1.6%，結果提示，盡管手術治療對腸道菌群結構造成了一定程度的損傷，但 ERAS 流程管理模式相較于傳統流程，對腸道微生態的影響更小，更有利于維持腸道生態平衡。其可能的原因是：傳統的禁飲食、機械性灌腸等舉措會削弱腸黏膜屏障功能，腸黏膜通透性增加，菌群轉移致使擬桿菌屬相對豐度增加，厚壁菌門豐度較少，厚壁菌/擬桿菌比例下降，但具體機制尚不明確，有待于進一步探索。
此外，傳統組術后雙歧桿菌屬豐度較術前下降 1.8%、ERAS 組下降 1.3%。雙歧桿菌作為腸道益生菌，通過與腸上皮細胞特異性受體結合形成一道生物屏障，該屏障可有效阻礙有害菌生長發育，維持腸道菌群結構的平衡[18]。本研究中，2 組患者術后雙歧桿菌豐度均有所下降，這與夏冰清等[4]、王家歡等[19]的研究結果相一致，考慮為手術創傷應激所致，但這也提示，單純 ERAS 管理模式并不能夠避免雙歧桿菌的減少，有必要在術后聯合使用益生菌微生態制劑，以促進腸道微生態的恢復和重建。
總之，ERAS 這一高效的臨床運作模式并不會對腸道菌群的物種多樣性造成影響，其對于腸道菌群結構有一定的損傷，但較傳統流程的損傷程度更弱，因此更有利于腸道微生態環境的重建和恢復。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：楊婕完成研究設計、實施；賀育華協助樣本的收集、數據統計分析以及文章執筆撰寫；蔣理立負責質量控制和論文審核。
倫理聲明：本研究通過了四川大學華西醫院生物醫學倫理委員會審批，批文編號：2018 年審（69 號）。
隨著微生態學的發展，腸道菌群與結直腸癌的關系受到關注[1-2]。研究[3-6]表明，結直腸癌的發生與腸道菌群失調有關，且手術創傷可破壞正常腸道形態，加之抗感染、禁食、禁飲等圍術期處理措施進一步加重了腸道菌群結構的紊亂和腸屏障損傷，患者易出現內毒素血癥、感染性腹瀉等并發癥，嚴重影響到臨床治療的效果和預后。加速康復外科（ERAS）流程管理旨在優化圍術期流程管理以減少手術患者的身心創傷應激，促進患者快速康復[7]。然而關于 ERAS 模式下對結直腸癌患者圍術期腸道微生態結構的影響卻鮮有報道；此外，相較于傳統的管理模式，ERAS 是否更有利于術后腸道菌群結構的平衡和重建成為亟待證實和探索的問題。基于此，本研究擬引入高通量測序技術，通過全面分析腸道微生物的多樣性及菌群結構，對上述問題進行探索。
1 對象與方法
1.1 研究對象
患者納入標準：① 采用便利抽樣方法納入 2018 年 8 月至 2019 年 12 月期間四川大學華西醫院胃腸外科的結直腸癌患者為研究對象；② 年齡 18～74 歲；③ 經術前腸鏡病理活檢診斷為結直腸癌；④ 腹腔和盆腔 B 超或 CT 及胸片檢查提示無遠處轉移；⑤ 無手術禁忌證；⑥ 患者知情同意，自愿參與本研究。排除標準：① 既往有結直腸手術史；② 近 1 個月內使用益生菌、微生態活菌制劑、抗生素、二甲雙胍、質子泵抑制劑、黃連素、導瀉劑；③ 術前接受過放化療治療；④ 合并有糖尿病（含 1 型及 2 型）、肥胖、痛風等慢性代謝性疾病；⑤ 術前伴有腸道炎癥、腸穿孔、腸梗阻及嚴重全身性疾病。采用預先設計好的 Excel 隨機函數“RAND（）”將研究對象隨機分為 ERAS 組或傳統治療組（傳統組）。
1.2 圍術期管理方法
圍術期管理在 ERAS 組按 ERAS 管理流程，在傳統組按傳統流程，具體見表 1。
表1
ERAS 組與傳統組圍術期管理措施
1.3 高通量測序
1.3.1 糞便標本采集
于入院 24 h 內、術后第 1 次自然排便時分別采集研究對象的新鮮糞便標本 3 g，要求避免尿液、灰塵等污染，用已滅菌糞便收集管盛裝，置于–80 ℃ 冰箱冷凍保存，干冰運送至上海歐易生物科技有限公司進行高通量測序。
1.3.2 DNA 提取、PCR 擴增與建庫
運用 DNA 抽提試劑盒對糞便標本的基因組 DNA 進行抽提，對 16 Sr DNA V3～V4 區進行擴增。PCR 產物用電泳檢測，然后用磁珠純化，純化后作為第 2 輪 PCR 模板并行第 2 輪 PCR 擴增，再次使電泳檢測，然后用磁珠純化，純化后對 PCR 產物進行 Qubit 定量。根據 PCR 產物濃度進行等量混樣并上機測序。
1.3.3 數據處理及操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）
使用 Illumina MiSeq 測序生成原始雙端序列 raw data，使用 Trimmomatic 軟件（version 0.35）對 raw data 序列進行掃描，得到合格的雙端 raw data。用 Flash 軟件（version 1.2.11）對合格的雙端 raw data 進行拼接并得到完整雙端測序序列 paired end。用 Qiime 中的 split_libraries（version 1.8.0）軟件去除 paired end 序列中單堿基重復大于 8、含 N 堿基及長度小于 200 bp 的序列后得到 clean tags 序列，再用 UCHIME 軟件（version 2.4.2）去除 clean tags 中的嵌合體，對質控得到的優質序列 valid tags 用 Vsearch 軟件（version 2.4.2）按照 97% 的相似度進行 OTU 分類，得到用于 OTU 劃分的 valid tags。采用 RDP classifier Naive Bayesian 分類算法，以每個 OTU 中豐度最大的序列作為該 OTU 的代表序列，通過與數據庫進行比對注釋，得到 OTU 的注釋信息。
1.3.4 生物信息學分析
① alpha 多樣性分析反映生物環境內物種的多樣性程度，包括 Shannon 指數和 Simpson 指數[8]，數值越大代表物種多樣性越豐富。通過 R 軟件（V3.1.0）繪制盒形圖。2 組手術前、后 Shannon 指數和 Simpson 指數比較用秩和檢驗。檢驗水準ɑ=0.05。② beta 多樣性分析，主要用于比較不同分組樣本的差異。用 Qiime 軟件，通過主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PcoA）可視化觀察個體或群體間的差異。每個點代表 1 個樣本，相同顏色代表相同分組。③ 群落結構分布，基于 OTU 分類結果，用 Qiime 軟件與數據庫 greengene 比對進行物種注釋，分別獲得樣品在門水平和屬水平的相對豐度，用 R 包中的 barplot 獲得柱狀圖。
2 結果
2.1 納入患者的基本情況
本研究共納入 60 例結直腸癌患者，年齡 18～74 歲；傳統組 30 例，ERAS 組 27 例（3 例患者在術后拒絕標本采集臨時退出本研究），2 組患者的基本情況比較差異無統計學意義（P>0.05），見表 2。
表2
傳統組和 ERAS 組患者的一般資料及臨床資料比較
2.2 標本 OTU 結果
質控后的 clean tags 數據量 38 044～41 991，valid tags 數據量 26 117～39 341，valid tags 平均長度 404.43～437.52 bp，各樣本 OTU 數量為 329～2 192。
2.3 ERAS 組與傳統組手術前后生物信息學分析結果
2.3.1 alpha 多樣性
結果見圖 1a、1b。alpha 多樣性分析的 Shannon 指數和 Simpson 指數在術前 2 組間和術后 2 組間以及傳統組和 EARS 組在各自組內的術前與術后比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
圖1
示 ERAS 組與傳統組手術前后生物信息學分析結果
a：Shannon 指數；b：Simpson 指數；c：術前 PcoA 可視化圖；d：術后 PcoA 可視化圖；e：門水平下菌落豐度排序 TOP15 的柱狀圖；f：屬水平下菌落豐度排序 TOP15 的柱狀圖
2.3.2 beta 多樣性
結果見圖 1c、1d。術前傳統組和 ERAS 組的群落構成比較差異不明顯，術后傳統組和 ERAS 組的群落構成出現明顯分界。
2.3.3 群落結構分布
① 門水平下 ERAS 組與傳統組手術前后豐度排序前 15 位的物種柱狀圖見圖 1e，從圖 1e 可見，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門為優勢菌門，在同一組內與其術前豐度比較，厚壁菌門在傳統組術后下降 26.5%、ERAS 組僅下降 5.5%，擬桿菌門傳統組術后提升 21.6%、ERAS 組僅提升 4.7%，變形菌門傳統組術后提升 7.2%、ERAS 組僅提升 2.2%。② 屬水平下 ERAS 組與傳統組手術前后豐度排序前 15 位的物種柱狀圖見圖 1f，從圖 1f 可見，在同一組內與其術前豐度比較，擬桿菌屬在傳統組術后提升 17.6%、ERAS 組術后下降 1.6%，雙歧桿菌屬傳統組術后下降 1.8%、ERAS 組下降 1.3%。
3 討論
3.1 ERAS 模式對腸道菌群多樣性無明顯影響
較高的 alpha 多樣性指數往往預示著健康[9]。因此，結直腸癌患者的腸道微生物群多樣性常低于正常健康人群[10]。Cong 等[11]的研究發現，結直腸癌患者術后腸道菌群 alpha 多樣性指數明顯低于術前，考慮與抗生素的使用導致腸道菌群的多樣性降低有關[12]。在本研究中，不論是 ERAS 組還是傳統組，術后菌群多樣性均有下降趨勢，但差異并無統計學意義，其可能的原因是，ERAS 組與傳統組在圍術期均使用抗生素，其中 ERAS 組為術中預防性使用抗生素，傳統組則采用術后使用，而患者通常在術后 1～2 d 即可自解大便并進行術后采樣，此時 2 組患者抗生素的累計用量均較小，由此出現腸道菌群多樣性較術前變化不明顯的情況；術后，ERAS 組與傳統組間比較差異也無統計學意義，結果提示，相較于繁瑣的傳統術前準備方法，ERAS 這一高效的臨床運作模式并不會對腸道菌群的物種多樣性造成影響。
3.2 ERAS 模式對菌群結構的損傷較小且更有利于腸道微生態的恢復和重建
本研究中，術前傳統組與 ERAS 組的群落結構差異不明顯，而術后傳統組與 ERAS 組的群落構成出現明顯分界，結果提示，術后群落結構存在顯著差異，進一步對 2 組患者手術前后群落結構分布進行比較發現，在門水平下，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門仍然為優勢菌門，與相關研究[13]結果一致。厚壁菌門參與腸道營養物質的吸收并在抵御外來病原體侵襲方面發揮著重要作用，而擬桿菌門中擬桿菌屬是主要微生物種類，其通過分泌活化的氧自由基可降低子基因組的穩定性，從而致使細胞突變和腫瘤的發生，因此，作為條件致病菌，特別是進入到胃腸道以外的部位時可引起感染或膿腫加劇[14-15]，特別是擬桿菌屬下的脆弱擬桿菌，可合成分泌脆弱擬桿菌毒素，與結腸上皮細胞膜特異性受體結合，激活核因子?κB 和 Wnt 信號通路，導致細胞增殖、炎性介質大量釋放和 DNA 損傷[16-17]。
本研究中，傳統組術后厚壁菌門豐度較術前下降 26.5%、ERAS 組僅下降 5.5%，傳統組術后擬桿菌門豐度較術前提升 21.6%、ERAS 組僅提升 4.7%，傳統組術后擬桿菌屬豐度較術前提升 17.6%、ERAS 下降 1.6%，結果提示，盡管手術治療對腸道菌群結構造成了一定程度的損傷，但 ERAS 流程管理模式相較于傳統流程，對腸道微生態的影響更小，更有利于維持腸道生態平衡。其可能的原因是：傳統的禁飲食、機械性灌腸等舉措會削弱腸黏膜屏障功能，腸黏膜通透性增加，菌群轉移致使擬桿菌屬相對豐度增加，厚壁菌門豐度較少，厚壁菌/擬桿菌比例下降，但具體機制尚不明確，有待于進一步探索。
此外，傳統組術后雙歧桿菌屬豐度較術前下降 1.8%、ERAS 組下降 1.3%。雙歧桿菌作為腸道益生菌，通過與腸上皮細胞特異性受體結合形成一道生物屏障，該屏障可有效阻礙有害菌生長發育，維持腸道菌群結構的平衡[18]。本研究中，2 組患者術后雙歧桿菌豐度均有所下降，這與夏冰清等[4]、王家歡等[19]的研究結果相一致，考慮為手術創傷應激所致，但這也提示，單純 ERAS 管理模式并不能夠避免雙歧桿菌的減少，有必要在術后聯合使用益生菌微生態制劑，以促進腸道微生態的恢復和重建。
總之，ERAS 這一高效的臨床運作模式并不會對腸道菌群的物種多樣性造成影響，其對于腸道菌群結構有一定的損傷，但較傳統流程的損傷程度更弱，因此更有利于腸道微生態環境的重建和恢復。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：楊婕完成研究設計、實施；賀育華協助樣本的收集、數據統計分析以及文章執筆撰寫；蔣理立負責質量控制和論文審核。
倫理聲明：本研究通過了四川大學華西醫院生物醫學倫理委員會審批，批文編號：2018 年審（69 號）。
