引用本文： 陳雄飛, 丁立爽, 孔德帥, 趙秀雷, 廖麗麗, 張耀敏, 李鳳山, 劉汝海. FXYD6 蛋白在肝細胞癌中的表達及其臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(3): 316-321. doi: 10.7507/1007-9424.202006023 復制
肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高、進展快且預后差，在全球發病率位居第 6 位，死亡率位居第4 位[1]。我國 HCC 患者的 5 年生存率為 14.1%，有20%～30% 的患者有手術切除機會，術后 5 年復發率為 60%～70%，是影響患者生存的重要因素[2]。因此，HCC 的早期診治、早期預測復發風險和降低術后轉移復發率是提高總體生存率的關鍵[3]，而微血管侵犯在 HCC 的發生中具有普遍性，與 HCC 的早期復發相關[4-5]，加強對 HCC 的發生和微血管侵犯相關機制的研究尤為重要，尋找與此相關的治療靶點迫在眉睫。FXYD6（FXYD domain-containing ion transport regulator 6）蛋白是離子通道相關的單跨膜蛋白，為鈉鉀泵的重要調節因子[6]，在腦組織中高表達，在神經元的發育和功能維持中發揮重要作用[7-8]。FXYD6 蛋白也是一種腫瘤相關蛋白，在多種腫瘤組織中高表達[9-15]，FXYD6 蛋白可促進 HCC 細胞[16]和骨肉瘤細胞的增殖與轉移[17-18]。本研究擬通過研究 FXYD6 蛋白在 HCC 組織及其癌旁組織中的表達情況，來分析 FXYD6 蛋白表達與 HCC 患者臨床病理學特征及預后的關系，以評價 FXYD6 蛋白作為 HCC 診斷和病情監測標志物的價值。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
回顧性收集滄州市中心醫院 2012 年 3 月至 2018 年 1 月期間的臨床資料和病理學資料相對完整的根治性切除患者的 HCC 蠟塊 80 例，另有部分 HCC 配對的癌旁肝組織蠟塊 40 例。HCC 旁肝組織經病理學檢查證實無癌殘留。HCC 患者的納入標準：所有患者術前和術后復發前未行化療、放療、介入治療、消融治療或生物治療，術后病理學檢查證實為原發性 HCC。排除標準：合并明顯的腎、心和肺疾病；合并其他腫瘤或合并自身免疫性疾病；二次肝臟手術或術前接受過放化療、射頻治療、介入治療或生物治療的患者。80 例患者中，男 67 例，女 13 例；年齡 30～73 歲，平均 54 歲。收集指標包括性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤最大徑、腫瘤數目、包膜完整性、微血管侵犯、病理分期、AFP 水平和肝炎病毒感染，HCC 病理分期采用第8 版美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）HCC 分期[19]，HCC 病理分級采用 Edmondson-Stein 方法[20]。本研究得到滄州市中心醫院倫理委員會的批準（2016-007-01），受試者在受試前知情、同意并簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 免疫組織化學鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC）方法檢測 FXYD6 蛋白在 HCC 組織及其癌旁組織中的表達
組織蠟塊行 4 μm 連續切片，常規脫蠟、水化和檸檬酸抗原修復，以過氧化氫溶液消除內源性過氧化物酶的活性，再以山羊血清封閉，滴加 1∶200 稀釋的鼠抗人 FXYD6 單克隆抗體（前期制備[21]），4 ℃ 過夜，PBS 液沖洗；以生物素標記的羊抗小鼠 IgG（武漢博士德生物工程有限公司）孵育后再以 PBS 液沖洗；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液（武漢博士德生物工程有限公司），PBS 液沖洗；以 3, 3-二氨基聯苯胺（DAB，武漢博士德生物工程有限公司）顯色，蘇木精復染，逐級脫水，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察 FXYD6 蛋白的表達情況，以 PBS 液代替 FYXD6 單克隆抗體作為陰性對照，以正常腦組織切片作為陽性對照。
1.2.2 結果判定標準
FXYD6 蛋白主要定位于細胞漿，陽性著色為細胞漿出現黃色或粽黃色顆粒。陽性細胞計數由筆者所在醫院 2 位病理醫師判定（若有差異，則共同再次閱片，商討決定），采用如下標準[14]：于 400 倍鏡下隨機計數 5 個視野，每個視野至少計數 100 個細胞，陽性細胞百分比=（陽性細胞數/總細胞數）×100%。陽性細胞百分比計分：≤5% 計 0 分，6%～25% 計 1 分，26%～50% 計 2 分，51%～75% 計 3 分，>75% 計 4 分。著色程度計分：不著色計 0 分，黃色計 1 分，棕色計 2 分。陽性細胞數評分與著色程度評分的乘積為最終評分結果，其中 0～4 分為陰性表達，5 分及以上為陽性表達。
1.3 隨訪
對 80 例 HCC 患者采用電話或復查方式進行隨訪，隨訪截止時間為 2020 年 5 月 20 日。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 17.0（Chicago，IL，USA）統計軟件對數據進行分析，計數資料分析采用成組 χ 2 或 Fisher 確切概率法；HCC 早期復發的影響因素分析采用非條件二分類 logistic 全變量回歸模型，生存曲線繪制采用 Kaplan-Meier 法，單因素生存曲線差異比較采用 log-rank 檢驗，多因素分析采用 Cox 風險比例向前逐步回歸模型。檢驗水準為 α=0.05。
2 結果
2.1 FXYD6 蛋白在 HCC 組織及其癌旁組織中的表達
FXYD6 蛋白主要表達于細胞漿，細胞核基本不表達，在癌旁組織中低表達，而在 HCC 組織中高表達（圖 1）。FXYD6 蛋白在 HCC 組織中的表達陽性率 ［77.5%（62/80）］ 高于癌旁組織 ［40.0%（16/40）］，差異有統計學意義（χ 2=16.484，P<0.001）。
圖1
示 FXYD6 蛋白在 HCC 組織及其癌旁組織中的表達
a：FXYD6 蛋白在 HCC 癌旁組織中低表達（SABC ×100）；b：FXYD6 蛋白在低分化 HCC 組織中高表達（SABC ×100）；c：圖 b 矩形區域放大，FXYD6 蛋白在 HCC 細胞漿中表達，在細胞核中不表達（SABC ×400）；d：FXYD6 蛋白在侵犯微血管的 HCC 中高表達，其中紅色虛線區域為 HCC 細胞團，黑色虛線區域為微血管內的 HCC（SABC ×100）
2.2 FXYD6 蛋白在 HCC 組織中的表達與患者臨床病理學特征的關系
FXYD6 蛋白在 HCC 組織中的表達與其臨床病理學特征的關系見表 1。由表 1 可見，FXYD6 蛋白的表達與 HCC 患者的性別、年齡、分化程度、腫瘤最大徑、腫瘤數目、術前 AFP 水平和 HBC 或 HCV 感染均無關（P>0.05），而與包膜完整性、微血管侵犯和 TNM 分期有關（P<0.05），FXYD6 蛋白表達在腫瘤包膜不完整 HCC 組織中的表達陽性率高于包膜完整者，在有微血管侵犯 HCC 組織中的表達陽性率高于無微血管侵犯者，在 TNM Ⅲ期 HCC 組織中的表達陽性率高于Ⅰ+Ⅱ期者。
表1
HCC 組織中FXYD6 蛋白的表達、早期復發及預后與患者臨床病理學特征的關系
2.3 FXYD6 蛋白表達與 HCC 患者術后早期復發的關系
本組 80 例均記錄術后 1 年內的復發情況。根治性切除術后 1 年內有 36 例腫瘤復發（45.0%），其中 FXYD6 蛋白表達陽性的患者術后 1 年復發率高于 FXYD6 蛋白表達陰性的患者 ［53.2%（33/62）比16.7%（3/18），χ 2=7.533，P=0.006］。腫瘤早期復發也與腫瘤分化程度、腫瘤最大徑、腫瘤數目、包膜完整性、微血管侵犯、TNM 分期和 FXYD6 蛋白表達相關（P<0.05），而與性別、年齡、術前 AFP 水平和HBV 或 HCV 病毒感染均無關（P>0.05），詳見表 1。
然而應用二分類 logistic 全變量回歸模型分析發現，陽性表達 FXYD6 蛋白不是 HCC 患者早期復發的危險因素（P=0.422），而與早期復發相關的危險因素為低腫瘤分化程度（P=0.021）、多個腫瘤（P=0.004）、腫瘤包膜不完整（P=0.026）和微血管侵犯（P<0.001），詳見表 2。
表2
HCC 患者腫瘤早期復發的非條件二分類 logistic 回歸模型分析結果
2.4 FXYD6 蛋白表達與 HCC 患者總生存期的關系
FXYD6 蛋白陽性組患者的 1、3 和 5 年生存率分別為 83.9%、24.1% 和 8.1%，FXYD6 蛋白陰性組的 1、3 和 5 年生存率分別為 100%、55.6% 和 11.1%。FXYD6 蛋白陰性組患者的生存情況較優，2 組的生存曲線比較差異具有統計學意義（χ 2=4.094，P=0.043），見圖 2。然而應用 Cox 比例風險向前逐步回歸模型分析 HCC 患者生存預后的影響因素，結果發現：高表達 FXYD6 蛋白不是 HCC 患者生存預后的危險因素（P=0.754），HCC 患者的生存預后與分化程度（P=0.037）、微血管侵犯（P=0.011）和 TNM 分期（P<0.001）相關，即組織分化低、微血管侵犯和 TNM 分期晚是 HCC 患者生存預后的不良預后因素，見表 3。
圖2
示不同 FXYD6 蛋白表達 HCC 患者的生存曲線
表3
Cox 比例風險向前逐步回歸模型分析結果
3 討論
HCC 的病因包括乙型或丙型肝炎病毒感染、酒精性肝病、非酒精性肝病、非酒精性脂肪肝和多種基因代謝性疾病[2]。在我國，HBV 病毒感染是導致肝細胞癌變的最主要原因[22]，絕大部分患者感染 HBV 病毒后，肝內結締組織異常增生引起纖維化，纖維化過程長期持續導致肝硬化，最終發展為 HCC [23]。HCC 起病隱匿，男性發病率顯著高于女性，死亡率高，根治性切除和肝移植是目前最為有效的治療方法，但根治性切除術后的 5 年復發率高達 70%，已成為 HCC 術后提高生存率的主要障礙[24]。微血管侵犯是 HCC 的侵襲特征之一，是 HCC 肝內或肝外轉移的危險因素，微血管侵犯在 HCC 早期極易發生，與術后復發息息相關，是影響患者預后的重要因素之一[25-26]。因此，尋找與 HCC 微血管侵犯相關的蛋白，抑制 HCC 微血管侵犯可為降低 HCC 的肝內轉移及復發率、為改善 HCC 患者的預后提供新思路。
FXYD6 蛋白為小分子單跨膜蛋白，通過調節鈉-鉀泵，維持鈉和鉀離子的跨膜濃度梯度。FXYD6 蛋白在神經元細胞中高表達，與神經元細胞的發育和突觸信號轉導相關，下調 FXYD6 蛋白的表達后，神經元網絡的形成明顯受到抑制[7]。FXYD6 蛋白也是腫瘤相關蛋白，與多種腫瘤相關，FXYD6 蛋白在鼻咽癌和胰腺癌組織中的表達量較相應正常組織增高，與腫瘤淋巴轉移相關[9-10]。FXYD6 蛋白在膽管癌組織中高表達，下調膽管癌 QBC939 細胞中 FXYD6 蛋白的表達后，腫瘤細胞的增殖受到抑制[11-12]。FXYD6 蛋白在骨肉瘤細胞中高表達，是 microRNA-372-3p 和 microRNA-137 結合作用的靶點，可促進骨肉瘤細胞的增殖與轉移[14-15]。Lu 等[27]應用 DNA 微陣列分析發現：高表達 FXYD6 蛋白的結直腸癌同步肝轉移患者對 FOLFOX4 化療方案敏感。FXYD6 蛋白在多種 HCC 細胞系中表達，FXYD6 蛋白在體外通過上調鈉鉀泵的α1 亞基，激活其下游的 Src-ERK 信號轉導通路，從而促進 HCC 細胞的增殖與轉移[15]。本研究發現，FXYD6 蛋白在 HCC 組織中的表達較癌旁組織上調，提示 FXYD6 蛋白在 HCC 癌變中起重要作用。
微血管侵犯系指在顯微鏡下血管腔內出現癌細胞團，多見于癌旁肝組織內的門靜脈小分支（包含腫瘤包膜內血管）[28]。HCC 是高度富血管化的實性腫瘤，HCC 術后，殘留肝臟再生釋放的生長因子會激活休眠微小轉移病灶的血管再生，導致 HCC 術后復發。微血管侵犯伴隨于 HCC 的發生與進展過程，與 HCC 術后的早期復發相關[4-5]，是 HCC 患者的一個不良預后因素。本研究結果顯示：HCC 組織中 FXYD6 蛋白的表達與 HCC 的包膜完整性、微血管侵犯和 TNM 分期相關。FXYD6 蛋白是鈉鉀泵α1 亞基的重要調節因子[6]，鈉鉀泵α亞基的信號轉導通路中的 Src 可激活表皮生長因子受體[29]，而表皮生長因子和表皮生長因子受體與 HCC 的 TNM 分期密切相關[30]，此外表皮生長因子可促進腫瘤的微血管形成[31]。據此筆者推測，FXYD6 蛋白通過調節鈉鉀泵，激活表皮生長因子受體，促進 HCC 的微血管生成，發生微血管侵犯引起腫瘤肝內轉移，進而導致 HCC 的早期復發。本研究單因素分析結果表明，陽性表達 FXYD6 蛋白組的早期復發率高于陰性表達組，然而多因素 logistic 回歸分析未發現 FXYD6 蛋白表達是 HCC 早期復發的危險因素；單因素生存分析結果表明，FXYD6 蛋白陰性組較陽性組患者的生存情況較優，然而多因素 Cox 比例風險向前逐步回歸模型發現，FXYD6 蛋白表達也不是 HCC 患者的生存預后因素。這可能與本研究中樣本量偏少有關，還需要多個臨床中心大樣本量的進一步研究。
綜上所述，FXYD6 蛋白在 HCC 組織中高表達，與 HCC 的包膜完整性、微血管侵犯和 TNM 分期相關，FXYD6 蛋白可能參與 HCC 的癌變和腫瘤進展，可能是 HCC 患者的一個不良預后因素和潛在的治療靶點，這為 HCC 的診斷和抗 HCC 復發治療提供了新思路。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：本課題由陳雄飛和丁立爽設計，研究過程由陳雄飛、丁立爽、孔德帥和趙秀雷操作完成，HCC 患者隨訪由陳雄飛和丁立爽完成，數據統計分析由廖麗麗、張耀敏和李鳳山完成，論文寫作由陳雄飛、孔德帥和劉汝海完成。
倫理聲明：本研究已通過滄州市中心醫院的倫理審核批準（批文編號：2016-007-01）。
志謝：感謝滄州市中心醫院病理科田亮和郭忠建在試驗過程中給予的幫助。
肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高、進展快且預后差，在全球發病率位居第 6 位，死亡率位居第4 位[1]。我國 HCC 患者的 5 年生存率為 14.1%，有20%～30% 的患者有手術切除機會，術后 5 年復發率為 60%～70%，是影響患者生存的重要因素[2]。因此，HCC 的早期診治、早期預測復發風險和降低術后轉移復發率是提高總體生存率的關鍵[3]，而微血管侵犯在 HCC 的發生中具有普遍性，與 HCC 的早期復發相關[4-5]，加強對 HCC 的發生和微血管侵犯相關機制的研究尤為重要，尋找與此相關的治療靶點迫在眉睫。FXYD6（FXYD domain-containing ion transport regulator 6）蛋白是離子通道相關的單跨膜蛋白，為鈉鉀泵的重要調節因子[6]，在腦組織中高表達，在神經元的發育和功能維持中發揮重要作用[7-8]。FXYD6 蛋白也是一種腫瘤相關蛋白，在多種腫瘤組織中高表達[9-15]，FXYD6 蛋白可促進 HCC 細胞[16]和骨肉瘤細胞的增殖與轉移[17-18]。本研究擬通過研究 FXYD6 蛋白在 HCC 組織及其癌旁組織中的表達情況，來分析 FXYD6 蛋白表達與 HCC 患者臨床病理學特征及預后的關系，以評價 FXYD6 蛋白作為 HCC 診斷和病情監測標志物的價值。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
回顧性收集滄州市中心醫院 2012 年 3 月至 2018 年 1 月期間的臨床資料和病理學資料相對完整的根治性切除患者的 HCC 蠟塊 80 例，另有部分 HCC 配對的癌旁肝組織蠟塊 40 例。HCC 旁肝組織經病理學檢查證實無癌殘留。HCC 患者的納入標準：所有患者術前和術后復發前未行化療、放療、介入治療、消融治療或生物治療，術后病理學檢查證實為原發性 HCC。排除標準：合并明顯的腎、心和肺疾病；合并其他腫瘤或合并自身免疫性疾病；二次肝臟手術或術前接受過放化療、射頻治療、介入治療或生物治療的患者。80 例患者中，男 67 例，女 13 例；年齡 30～73 歲，平均 54 歲。收集指標包括性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤最大徑、腫瘤數目、包膜完整性、微血管侵犯、病理分期、AFP 水平和肝炎病毒感染，HCC 病理分期采用第8 版美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）HCC 分期[19]，HCC 病理分級采用 Edmondson-Stein 方法[20]。本研究得到滄州市中心醫院倫理委員會的批準（2016-007-01），受試者在受試前知情、同意并簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 免疫組織化學鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC）方法檢測 FXYD6 蛋白在 HCC 組織及其癌旁組織中的表達
組織蠟塊行 4 μm 連續切片，常規脫蠟、水化和檸檬酸抗原修復，以過氧化氫溶液消除內源性過氧化物酶的活性，再以山羊血清封閉，滴加 1∶200 稀釋的鼠抗人 FXYD6 單克隆抗體（前期制備[21]），4 ℃ 過夜，PBS 液沖洗；以生物素標記的羊抗小鼠 IgG（武漢博士德生物工程有限公司）孵育后再以 PBS 液沖洗；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液（武漢博士德生物工程有限公司），PBS 液沖洗；以 3, 3-二氨基聯苯胺（DAB，武漢博士德生物工程有限公司）顯色，蘇木精復染，逐級脫水，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察 FXYD6 蛋白的表達情況，以 PBS 液代替 FYXD6 單克隆抗體作為陰性對照，以正常腦組織切片作為陽性對照。
1.2.2 結果判定標準
FXYD6 蛋白主要定位于細胞漿，陽性著色為細胞漿出現黃色或粽黃色顆粒。陽性細胞計數由筆者所在醫院 2 位病理醫師判定（若有差異，則共同再次閱片，商討決定），采用如下標準[14]：于 400 倍鏡下隨機計數 5 個視野，每個視野至少計數 100 個細胞，陽性細胞百分比=（陽性細胞數/總細胞數）×100%。陽性細胞百分比計分：≤5% 計 0 分，6%～25% 計 1 分，26%～50% 計 2 分，51%～75% 計 3 分，>75% 計 4 分。著色程度計分：不著色計 0 分，黃色計 1 分，棕色計 2 分。陽性細胞數評分與著色程度評分的乘積為最終評分結果，其中 0～4 分為陰性表達，5 分及以上為陽性表達。
1.3 隨訪
對 80 例 HCC 患者采用電話或復查方式進行隨訪，隨訪截止時間為 2020 年 5 月 20 日。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 17.0（Chicago，IL，USA）統計軟件對數據進行分析，計數資料分析采用成組 χ 2 或 Fisher 確切概率法；HCC 早期復發的影響因素分析采用非條件二分類 logistic 全變量回歸模型，生存曲線繪制采用 Kaplan-Meier 法，單因素生存曲線差異比較采用 log-rank 檢驗，多因素分析采用 Cox 風險比例向前逐步回歸模型。檢驗水準為 α=0.05。
2 結果
2.1 FXYD6 蛋白在 HCC 組織及其癌旁組織中的表達
FXYD6 蛋白主要表達于細胞漿，細胞核基本不表達，在癌旁組織中低表達，而在 HCC 組織中高表達（圖 1）。FXYD6 蛋白在 HCC 組織中的表達陽性率 ［77.5%（62/80）］ 高于癌旁組織 ［40.0%（16/40）］，差異有統計學意義（χ 2=16.484，P<0.001）。
圖1
示 FXYD6 蛋白在 HCC 組織及其癌旁組織中的表達
a：FXYD6 蛋白在 HCC 癌旁組織中低表達（SABC ×100）；b：FXYD6 蛋白在低分化 HCC 組織中高表達（SABC ×100）；c：圖 b 矩形區域放大，FXYD6 蛋白在 HCC 細胞漿中表達，在細胞核中不表達（SABC ×400）；d：FXYD6 蛋白在侵犯微血管的 HCC 中高表達，其中紅色虛線區域為 HCC 細胞團，黑色虛線區域為微血管內的 HCC（SABC ×100）
2.2 FXYD6 蛋白在 HCC 組織中的表達與患者臨床病理學特征的關系
FXYD6 蛋白在 HCC 組織中的表達與其臨床病理學特征的關系見表 1。由表 1 可見，FXYD6 蛋白的表達與 HCC 患者的性別、年齡、分化程度、腫瘤最大徑、腫瘤數目、術前 AFP 水平和 HBC 或 HCV 感染均無關（P>0.05），而與包膜完整性、微血管侵犯和 TNM 分期有關（P<0.05），FXYD6 蛋白表達在腫瘤包膜不完整 HCC 組織中的表達陽性率高于包膜完整者，在有微血管侵犯 HCC 組織中的表達陽性率高于無微血管侵犯者，在 TNM Ⅲ期 HCC 組織中的表達陽性率高于Ⅰ+Ⅱ期者。
表1
HCC 組織中FXYD6 蛋白的表達、早期復發及預后與患者臨床病理學特征的關系
2.3 FXYD6 蛋白表達與 HCC 患者術后早期復發的關系
本組 80 例均記錄術后 1 年內的復發情況。根治性切除術后 1 年內有 36 例腫瘤復發（45.0%），其中 FXYD6 蛋白表達陽性的患者術后 1 年復發率高于 FXYD6 蛋白表達陰性的患者 ［53.2%（33/62）比16.7%（3/18），χ 2=7.533，P=0.006］。腫瘤早期復發也與腫瘤分化程度、腫瘤最大徑、腫瘤數目、包膜完整性、微血管侵犯、TNM 分期和 FXYD6 蛋白表達相關（P<0.05），而與性別、年齡、術前 AFP 水平和HBV 或 HCV 病毒感染均無關（P>0.05），詳見表 1。
然而應用二分類 logistic 全變量回歸模型分析發現，陽性表達 FXYD6 蛋白不是 HCC 患者早期復發的危險因素（P=0.422），而與早期復發相關的危險因素為低腫瘤分化程度（P=0.021）、多個腫瘤（P=0.004）、腫瘤包膜不完整（P=0.026）和微血管侵犯（P<0.001），詳見表 2。
表2
HCC 患者腫瘤早期復發的非條件二分類 logistic 回歸模型分析結果
2.4 FXYD6 蛋白表達與 HCC 患者總生存期的關系
FXYD6 蛋白陽性組患者的 1、3 和 5 年生存率分別為 83.9%、24.1% 和 8.1%，FXYD6 蛋白陰性組的 1、3 和 5 年生存率分別為 100%、55.6% 和 11.1%。FXYD6 蛋白陰性組患者的生存情況較優，2 組的生存曲線比較差異具有統計學意義（χ 2=4.094，P=0.043），見圖 2。然而應用 Cox 比例風險向前逐步回歸模型分析 HCC 患者生存預后的影響因素，結果發現：高表達 FXYD6 蛋白不是 HCC 患者生存預后的危險因素（P=0.754），HCC 患者的生存預后與分化程度（P=0.037）、微血管侵犯（P=0.011）和 TNM 分期（P<0.001）相關，即組織分化低、微血管侵犯和 TNM 分期晚是 HCC 患者生存預后的不良預后因素，見表 3。
圖2
示不同 FXYD6 蛋白表達 HCC 患者的生存曲線
表3
Cox 比例風險向前逐步回歸模型分析結果
3 討論
HCC 的病因包括乙型或丙型肝炎病毒感染、酒精性肝病、非酒精性肝病、非酒精性脂肪肝和多種基因代謝性疾病[2]。在我國，HBV 病毒感染是導致肝細胞癌變的最主要原因[22]，絕大部分患者感染 HBV 病毒后，肝內結締組織異常增生引起纖維化，纖維化過程長期持續導致肝硬化，最終發展為 HCC [23]。HCC 起病隱匿，男性發病率顯著高于女性，死亡率高，根治性切除和肝移植是目前最為有效的治療方法，但根治性切除術后的 5 年復發率高達 70%，已成為 HCC 術后提高生存率的主要障礙[24]。微血管侵犯是 HCC 的侵襲特征之一，是 HCC 肝內或肝外轉移的危險因素，微血管侵犯在 HCC 早期極易發生，與術后復發息息相關，是影響患者預后的重要因素之一[25-26]。因此，尋找與 HCC 微血管侵犯相關的蛋白，抑制 HCC 微血管侵犯可為降低 HCC 的肝內轉移及復發率、為改善 HCC 患者的預后提供新思路。
FXYD6 蛋白為小分子單跨膜蛋白，通過調節鈉-鉀泵，維持鈉和鉀離子的跨膜濃度梯度。FXYD6 蛋白在神經元細胞中高表達，與神經元細胞的發育和突觸信號轉導相關，下調 FXYD6 蛋白的表達后，神經元網絡的形成明顯受到抑制[7]。FXYD6 蛋白也是腫瘤相關蛋白，與多種腫瘤相關，FXYD6 蛋白在鼻咽癌和胰腺癌組織中的表達量較相應正常組織增高，與腫瘤淋巴轉移相關[9-10]。FXYD6 蛋白在膽管癌組織中高表達，下調膽管癌 QBC939 細胞中 FXYD6 蛋白的表達后，腫瘤細胞的增殖受到抑制[11-12]。FXYD6 蛋白在骨肉瘤細胞中高表達，是 microRNA-372-3p 和 microRNA-137 結合作用的靶點，可促進骨肉瘤細胞的增殖與轉移[14-15]。Lu 等[27]應用 DNA 微陣列分析發現：高表達 FXYD6 蛋白的結直腸癌同步肝轉移患者對 FOLFOX4 化療方案敏感。FXYD6 蛋白在多種 HCC 細胞系中表達，FXYD6 蛋白在體外通過上調鈉鉀泵的α1 亞基，激活其下游的 Src-ERK 信號轉導通路，從而促進 HCC 細胞的增殖與轉移[15]。本研究發現，FXYD6 蛋白在 HCC 組織中的表達較癌旁組織上調，提示 FXYD6 蛋白在 HCC 癌變中起重要作用。
微血管侵犯系指在顯微鏡下血管腔內出現癌細胞團，多見于癌旁肝組織內的門靜脈小分支（包含腫瘤包膜內血管）[28]。HCC 是高度富血管化的實性腫瘤，HCC 術后，殘留肝臟再生釋放的生長因子會激活休眠微小轉移病灶的血管再生，導致 HCC 術后復發。微血管侵犯伴隨于 HCC 的發生與進展過程，與 HCC 術后的早期復發相關[4-5]，是 HCC 患者的一個不良預后因素。本研究結果顯示：HCC 組織中 FXYD6 蛋白的表達與 HCC 的包膜完整性、微血管侵犯和 TNM 分期相關。FXYD6 蛋白是鈉鉀泵α1 亞基的重要調節因子[6]，鈉鉀泵α亞基的信號轉導通路中的 Src 可激活表皮生長因子受體[29]，而表皮生長因子和表皮生長因子受體與 HCC 的 TNM 分期密切相關[30]，此外表皮生長因子可促進腫瘤的微血管形成[31]。據此筆者推測，FXYD6 蛋白通過調節鈉鉀泵，激活表皮生長因子受體，促進 HCC 的微血管生成，發生微血管侵犯引起腫瘤肝內轉移，進而導致 HCC 的早期復發。本研究單因素分析結果表明，陽性表達 FXYD6 蛋白組的早期復發率高于陰性表達組，然而多因素 logistic 回歸分析未發現 FXYD6 蛋白表達是 HCC 早期復發的危險因素；單因素生存分析結果表明，FXYD6 蛋白陰性組較陽性組患者的生存情況較優，然而多因素 Cox 比例風險向前逐步回歸模型發現，FXYD6 蛋白表達也不是 HCC 患者的生存預后因素。這可能與本研究中樣本量偏少有關，還需要多個臨床中心大樣本量的進一步研究。
綜上所述，FXYD6 蛋白在 HCC 組織中高表達，與 HCC 的包膜完整性、微血管侵犯和 TNM 分期相關，FXYD6 蛋白可能參與 HCC 的癌變和腫瘤進展，可能是 HCC 患者的一個不良預后因素和潛在的治療靶點，這為 HCC 的診斷和抗 HCC 復發治療提供了新思路。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：本課題由陳雄飛和丁立爽設計，研究過程由陳雄飛、丁立爽、孔德帥和趙秀雷操作完成，HCC 患者隨訪由陳雄飛和丁立爽完成，數據統計分析由廖麗麗、張耀敏和李鳳山完成，論文寫作由陳雄飛、孔德帥和劉汝海完成。
倫理聲明：本研究已通過滄州市中心醫院的倫理審核批準（批文編號：2016-007-01）。
志謝：感謝滄州市中心醫院病理科田亮和郭忠建在試驗過程中給予的幫助。
