引用本文： 肖國, 姜淮蕪, 徐亮, 明銳, 馬波. CRYAB 在胃癌組織中的表達及化療藥物對CRYAB mRNA表達的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(2): 212-218. doi: 10.7507/1007-9424.202005025 復制
胃癌（gastric cancer）是危害我國乃至全球的公共衛生問題，在 2018 年新發 100 多萬例胃癌，并有 78.3 萬例死亡，使其成為全球第五常見的惡性腫瘤并高居腫瘤死亡率的第 3 位[1]，處于亞洲的中國也是全球胃癌高發地之一[2]。由于胃癌在早期時通常沒有明顯和特異的征兆，諸多患者就診時已處于疾病晚期，預后不佳[3]。在過去的 20 年里，胃癌領域中創新了許多診斷與治療方法，并取得了重大成就，早期胃癌的 5 年生存率甚至可達到 95% 以上[4]，但晚期胃癌患者的預后仍然很差[5]，術后復發和轉移是臨床面臨的主要挑戰。因此深入了解胃癌的進展過程對優化臨床診療至關重要，由此迸發出了諸多新的研究熱點，αB-晶體蛋白（alpha B-crystallin，CRYAB）就是其中之一。研究[6]證實，CRYAB 可能在許多惡性腫瘤的發生和發展過程中發揮重要作用。CRYAB 又稱 HspB5 蛋白，最早發現于眼球晶狀體，其與多種惡性腫瘤的發生和發展相關，例如消化系統的喉鱗癌、食管癌、胃癌、肝癌和結直腸癌，以及其他系統的卵巢癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、骨肉瘤、膠質母細胞瘤等腫瘤有著密切的相關性。它是熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）家族中最重要的成員之一[7]。HSPs 是一組高度保守的肽類蛋白質，主要屬于胞內蛋白并存在于多種類型細胞中，可作為分子伴侶參與蛋白質的合成、折疊、積聚、裝配、運輸和降解[8]，而 CRYAB 蛋白正是通過調控細胞周期、分化、凋亡、炎癥、氧化應激等細胞通路[9]，從而起著抗細胞凋亡[10]、穩定細胞骨架蛋白和骨架網絡[11-12]、免疫系統激活[13]等功能。并且有研究[14-15]表明，CRYAB 蛋白與腫瘤化療藥物耐藥密切相關，對熱應激、氧化應激等誘導的細胞死亡具有保護作用，由此可直接影響化療效果。胃癌的綜合治療中，術前新輔助化療和術后化療的療效已得到確切證實，但化療后的療效卻不盡相同，為探究所采用的奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶等藥物作用于患者后是否對胃癌組織中 CRYAB 蛋白的表達水平有影響、從而導致療效不同，本研究探索了 CRYAB 蛋白在胃癌組織中的表達，以明確 CRYAB 蛋白表達與胃癌患者臨床病理學特征的相關性，旨在為優化胃癌的診療提供方向及依據。
1 資料及方法
1.1 研究對象
回顧性收集西南醫科大學附屬第一醫院及四川綿陽四〇四醫院 2018 年 4 月至 2020 年 3 月期間的行根治性手術切除的 76 例胃癌患者的癌組織及相應的癌旁組織（癌旁組織距離癌組織以遠 5 cm，術后病理未查見癌細胞）。納入標準：① 年齡≤75 歲，術前胃鏡病理學檢查確診胃癌，根據病變部位行胃癌根治術，術后病理學檢查示有完整切緣，且切緣陰性；② 未進行術前、術中化療，術前放療，免疫治療等抗腫瘤治療措施；③ 均經術后病理確診為原發胃癌，并明確了病理學類型；④ 病例資料完整；⑤ 有完整的腫瘤組織和陰性切緣組織的石蠟標本。排除標準：① 早期胃癌行內鏡治療患者 ［內鏡下黏膜切除術（EMR）或內鏡黏膜下剝離術（ESD）］；② 胃癌術后復發或殘胃再發癌患者。收集患者的臨床病理學特征相關數據，包括年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑、TNM 分期、Borrmann 分型、分化程度、淋巴結轉移、浸潤深度以及病理 Lauren 分類。76 例胃癌患者的臨床病理學特征見表 1。
表1
CRYAB 蛋白在胃癌組織中的表達及其與患者臨床學病理特征的關系
此外，前瞻性收集 2018 年 11 月至 2020 年 3 月期間西南醫科大學附屬第一醫院收治的 21 例新輔助化療后行胃癌根治術的患者以及 26 例未行新輔助化療患者的胃癌組織標本。納入標準：① 同上述胃癌納入標準的第 1–3 項；② 所有病例臨床分期為 Ⅱ～Ⅲ 期；③ 無重大基礎疾病，能耐受手術及術后臨床治療。排除標準：① 同上述胃癌排除標準的第 1–2 項；② 晚期出現淋巴結轉移患者。新輔助化療患者為術前接受 5-氟尿嘧啶（劑量為 500 mg/m2，連用 4 d）+奧沙利鉑（劑量為 130 mg/m2，給藥 1 次）化療方案，3 周為 1 個療程，總共化療 2～3 次，停 3～4 周后行胃癌根治術。本研究所有臨床數據及資料經患者同意用于科學研究并簽署知情同意書。
1.2 主要實驗試劑和設備
1.2.1 主要實驗試劑
重組 Anti-Alpha B-Crystallin 抗體（成都萬道生物科技發展有限公司，克隆號 EPR2752）、TRIzol（美國 Invitrogen 公司，15596-026）、氯仿（中國南京化學試劑有限公司）、異丙醇（中國南京化學試劑有限公司）、70% 乙醇（中國江蘇凱基生物技術股份有限公司，KGDN6）、0.1% DEPC Water（中國江蘇凱基生物技術股份有限公司，KGDN4500）、cDNA 第一鏈合成試劑盒（日本 TaKaRa 公司，RR036B）和 One Step TB GreenTM PrimeScriptTM RT-PCR Kit Ⅱ （SYBR Green，日本 TaKaRa 公司，RR086B）。
1.2.2 主要設備
立式壓力鍋（YXQ-LS-50，中國上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）、電熱鼓風干燥箱（101AS-3，中國上海圣欣科學儀器有限公司）、分析天平（BL310/BL21S，德國 Sartorius 公司）、超凈工作臺（SW-CJ-1FD，中國蘇州凈化設備有限公司）、臺式低速離心機（80-2，中國上海醫療器械股份有限公司醫療設備廠）、通風櫥（單柜，中國蘇州凈化設備有限公司）、渦旋振蕩器（XW-80A，中國海門其林貝爾儀器制造有限公司）、高速冷凍離心機（ST16R，美國 Thermo Sorvall 公司）、紫外光度儀（UV-2450，日本 SHIMADZU 公司）、普通梯度 PCR 儀（Veriti 96 well Thermal cycler，美國 ABI 公司）、熒光定量 PCR 循環儀（Step one plus Real time-PCR system，美國 ABI 公司）、移液器（10、200 和 1000 μL，德國 Eppendorf 公司）、自動組織脫水機（ASP200S，Leica Biosystems Nussloch GmbH 公司）、生物組織包埋機（YB-6，湖北泰維科技實業有限公司）、新飛冰箱（BCD-208D，北新飛電器集團有限公司）、可微調移液器（10～200 μL，P4808，深圳市愛納多電子商務有限公司）、生物組織攤烤片機（YT-7FB 型，湖北省孝感亞光醫用電子技術有限公司）、電熱恒溫培養箱（DH5000AB，蘇州威爾實驗用品有限公司）、切片機（Thermo，北京吉特普倫生物技術有限公司）和研究級光學顯微鏡（OLYMPUS BX-43，北京泰克匯光科技有限公司）。
1.3 應用免疫組織化學 SP 法檢測 CRYAB 蛋白在胃癌組織中的表達
胃癌組織和癌旁組織行免疫組織化學 SP 法染色以檢測 CRYAB 蛋白的表達水平。SP 法主要具體操作步驟：石蠟切片 4 μm，脫蠟至水；蒸餾水洗，PBS 浸泡 5 min；抗原修復采用高壓抗原修復法，即將切片放入抗原修復液中再置于高壓鍋中，待噴氣后計時 5 min 取出切片冷卻到室溫，PBS 洗3 次，每次 2 min；使用 3% 的雙氧水室溫孵育10 min 以消除內源性過氧化物酶活性；PBS 沖洗后滴加一抗 1∶100 稀釋，4 ℃ 下孵育過夜，再次 PBS 沖洗后滴加二抗，37 ℃ 孵育 25 min，PBS 沖洗后進行 DAB 顯色；最后使用蒸餾水充分沖洗、復染、脫水、透明和封片。
結果判定標準[16]：以細胞胞漿中呈現為棕黃色染色視為 CRYAB 蛋白表達陽性。免疫染色由兩名病理醫師同時根據陽性細胞的百分比和染色強度進行評分，評分有分歧時進行討論，討論結果不一致由第 3 名病理醫師進行評定。陽性細胞的百分比分為 4 類：0～10%，1 分；11%～50%，2 分；51%～80%，3 分；81%～100%，4 分。染色強度評分如下：無色，陰性，0 分；淡黃色，弱陽性，1 分；棕黃色，中陽性，2 分；棕褐色，強陽性，3 分。以陽性細胞百分比得分與染色強度對應得分的乘積作為最終染色分數。采用兩級評分系統對 CRYAB 蛋白表達染色程度進行量化：總分<4 分為低表達，總分≥4 分為高表達。
1.4 應用實時熒光定量 PCR（real-time-PCR，qPCR）方法檢測 CRYAB mRNA 在胃癌組織中的表達
胃癌組織樣本收集后置于–78 ℃ 冷藏柜中超低溫保存。qPCR 步驟：首先提取胃癌組織標本的 RNA，提取后進行 RNA 濃度和純度的測定，即取5 μL RNA 樣品到 495 μL 1×TE Buffer 中，測定樣品在 260 nm 和 280 nm 處的吸光度值（A 值），RNA 的濃度＝A260×稀釋倍數×0.04 μg/μL（比色皿光徑為1 cm），本實驗A260/280=1.9，表明 RNA 濃度以及純度達標。然后采用逆轉錄試劑盒進行 cDNA 的第一鏈合成。設計合成的 PCR 引物，CRYAB 引物正向為 5′-CGCCTCTTTGACCAGTTCTTC-3′，反向為5′-AAGGTAGAAGGGACTCAGGGA-3′，擴增片段長度為 84 bp。采用 GAPDH 為內參照，引物正向為 5′-CAAATTCCATGGCACCGTCA-3′，反向為5′-AGCATCGCCCCACTTGATTT-3′，擴增片段長度為 109 bp。在完成 qPCR 預實驗后進行 qPCR 正式實驗以測定 CRYAB mRNA 的表達水平，正式實驗循環過程中擴增條件為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s；循環 40 次。qPCR 實時熒光實驗結果采用 2–ΔΔCT 方法計算。
1.5 統計學方法
所有數據結果經過 Excel 整理，采用 SPSS 17.0 統計軟件進行統計處理。計數資料采用成組或配對設計的 χ2 檢驗，計量資料采用兩獨立樣本比較的 t 檢驗（本研究數據符合正態分布及方差齊性條件）。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 CRYAB 蛋白在胃癌組織及其癌旁組織中的表達結果
免疫組織化學染色（圖 1a 和圖 1b）結果顯示，CRYAB 蛋白的染色部位主要是細胞胞漿，呈現為棕黃色或棕褐色，即 CRYAB 蛋白的表達主要是位于細胞胞漿中。76 例胃癌組織中，CRYAB 蛋白高表達 51 例（67.1%），癌旁組織高表達 32 例（42.1%），CRYAB 蛋白在胃癌組織中的高表達率高于癌旁組織（χ2=9.581，P=0.002）。
圖1
示 CRYAB 蛋白在胃癌組織及其癌旁組織中的表達（SP ×400），以及新輔助化療組和未行新輔助化療組胃癌組織中 CRYAB mRNA 的表達水平
a：胃癌組織中 CRYAB 蛋白呈陽性表達；b：癌旁組織中 CRYAB 蛋白呈陰性表達；c：新輔助化療組和未行新輔助化療組胃癌組織中 CRYAB mRNA 的表達水平
2.2 胃癌組織中 CRYAB 蛋白的表達與胃癌患者臨床病理學特征的關系
CRYAB 蛋白在胃癌組織中的高表達與患者年齡、性別、腫瘤部位及腫瘤直徑均無關（P>0.05），而與腫瘤 Borrmann 分型、TNM 分期、分化程度、淋巴結轉移、浸潤深度和 Lauren 分類均有關（P<0.05），Borrmann 分型Ⅲ+Ⅳ型者的高表達率高于 Ⅰ+Ⅱ 型者，TNM Ⅲ+Ⅳ 期者的高表達率高于 Ⅰ+Ⅱ 期者，低+未分化者的高表達率高于高+中分化者，有淋巴結轉移者的高表達率高于無淋巴結轉移者，浸潤深度為漿膜層+胃全層者的高表達率高于黏膜層+固有肌層者，Lauren 分類為彌漫型者的高表達率較高，腸型的高表達率較低。具體見表 1。
2.3 新輔助化療組和未行新輔助化療組胃癌組織中 CRYAB mRNA 的表達水平比較
對 21 例新輔助化療后的胃癌癌組織及 26 例未行新輔助化療患者的胃癌組織的 CRYAB mRNA 表達水平進行檢測的結果見圖 1c。新輔助化療組的 CRYAB mRNA 的表達水平為 1.24±0.22，高于未行新輔助化療組的 0.78±0.16，差異具有統計學意義（t=8.37，P<0.001）。
3 討論
在 1989 年，Iwaki 等[17]發表了第 1 篇關于 CRYAB 蛋白在病理狀態下于非晶體組織中異常表達的文章，隨后關于 CRYAB 蛋白的研究逐漸深入，自 2000 年開始，對其部分作用機制已有了一些基礎的理解，特別是在白內障、心肌病[18-19]等方面有了一些重大進展。隨后 2 年，關于 CRYAB 蛋白與腫瘤的相關性被提出，最早研究的腫瘤有我們熟知的卵巢癌[20]、間變性甲狀腺癌[21]、膠質母細胞瘤[22]、乳腺癌[23]等。有研究[18]證明，CRYAB 蛋白是一種有效的負調控因子，可以抑制免疫系統和中樞神經系統（CNS）中的多種炎癥通路，并且提示 CRYAB 蛋白具有抗凋亡作用。此外研究[19]發現，CRYAB 蛋白可作為血管內皮生長因子 A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）的伴侶蛋白，在血管生成中發揮重要作用，并證明了其在腫瘤侵襲和轉移方面所存在的促進作用及有著作為治療靶點的潛力。有研究[24]發現，M2 巨噬細胞通過上調 CRYAB 基因表達并激活細胞外調節蛋白激酶 1/2/原癌基因 Fra-1/slug 蛋白（ERK1/2/Fra-1/slug）信號通路，通過上皮細胞-間充質轉化（EMT）促進肺癌的惡性進展；而且也有研究[25]表明，CRYAB 蛋白與結直腸癌不良預后也相關，其通過 ERK 信號通路促進 EMT 進程。它是一個潛在的腫瘤生物標志物并且關系到結直腸癌（CRC）的診斷和預后。EMT 指的是上皮細胞在一些因素的作用下，失去極性及細胞間緊密連接和黏附連接，獲得了浸潤性和游走遷移能力，變成具備間質細胞形態和特性的細胞學改變。EMT 是諸多腫瘤進展的重要路徑之一，眾所周知胃癌也與 EMT 有著不可分割的聯系，由此可以推測，CRYAB 蛋白可能通過 EMT 促進胃癌的發生發展。以上結果都提示 CRYAB 蛋白與胃癌的發生發展關系密切。而這些推斷都與本研究結果相同，本研究結果表明，CRYAB 蛋白在胃癌組織中的高表達率高于癌旁組織（P=0.002）。
通過對 CRYAB 蛋白機制的研究，發現 CRYAB 蛋白最重要的作用是其抗凋亡多肽在各種條件下對細胞凋亡產生影響，但它不僅僅是在腫瘤的發生中有著積極作用。研究[26-27]表明，CRYAB 蛋白在腫瘤發展中也是十分重要的，它直接關系到腫瘤的轉移和復發，這涉及到患者的術后生存時間。為了進一步探索 CRYAB 蛋白與胃癌的相關性，本研究探索了 CRYAB 蛋白在胃癌組織中的表達與患者臨床病理學特征的關系，結果發現，CRYAB 蛋白在胃癌組織中的高表達與患者年齡、性別、腫瘤直徑和腫瘤部位均無關（P>0.05），而與腫瘤 TNM 分期、分化程度、浸潤深度、Borrmann 分型及淋巴結轉移有關（P<0.05）。同時本研究通過病理 Lauren 分類的組間分析發現，CRYAB 蛋白在胃癌腸型中的高表達率與彌漫型的差異存在統計學意義（P<0.05），而混合型與彌漫型的 CRYAB 蛋白的高表達率比較差異無統計學意義（P>0.05），也就是說，CRYAB 蛋白的高表達與胃癌病理組織學分級密切相關，可能對胃癌的進展起到至關重要的作用。本研究除了我們熟知并且常用來統計的分類外，在新加入的 Borrmann 分型和病理 Lauren 分類這兩項中也有了新的發現。就 Borrmann 分型來講，其分級越高，越能體現胃癌組織的腫瘤界限的不確定性，更具有侵襲性，并且分化程度通常較低，與術后腫瘤復發轉移密切相關，本研究結果側面也印證了這一點。從對病理 Lauren 分類的分析來看，腸型腺癌與彌漫型（低分化癌）中 CRYAB 蛋白的表達情況存在差異，通常腸型腺癌的惡性程度較后者較低，預后也較好。加上諸多的研究[26-28]證實，CRYAB 蛋白可作為多種腫瘤預后的獨立因素，可作為評估患者預后的指標，由此可以推斷出，CRYAB 與胃癌的預后也是相關的，這都與本研究推斷一致。因而檢測 CRYAB 蛋白在胃癌組織中的表達情況可以對臨床治療起到一定的指導作用。
有學者[14]在人類惡性黑色素瘤細胞株中進行順鉑、依托泊苷、福莫司汀及三者衍生物的耐藥性實驗，研究發現，富含半胱氨酸蛋白 61（cysteine rich 61，CYR61）、腺苷高半胱氨酸酶 1（Adenosylhomocysteinase1，AHCYL1）、膜棕櫚酰化蛋白 1（membrane-palmitoylated protein，MPP1）以及幾個與凋亡相關的基因，尤其是 CRYAB 基因，在耐藥實驗中均體現出表達差異，展示出其顯著的對抗 DNA 損傷藥物的耐藥性。Kase 等[15]研究發現，CRYAB 蛋白在化療后視網膜母細胞瘤中高表達，能減少抗癌藥物產生的凋亡信號，從而保護腫瘤細胞。也有研究[29]發現，在卵巢癌中順鉑誘導的細胞凋亡程度由于 CRYAB 蛋白表達的上調而明顯下降。研究[30]證實，miR-491 通過靶向 CRYAB 蛋白可抑制骨肉瘤肺轉移和化療耐藥，過表達 miR-491 可通過作用于 CRYAB 蛋白而抑制骨肉瘤細胞的肺轉移，而增強順鉑誘導的腫瘤生長抑制和凋亡。以上這些研究都證實了 CRYAB 蛋白在細胞保護方面及抗凋亡方面中的作用。本研究針對 21 例新輔助化療后行胃癌根治術患者的癌組織以及 26 例未行新輔助化療患者的癌組織標本，采用 qPCR 法檢測 CRYAB mRNA 的表達水平，結果發現，化療后癌組織中 CRYAB mRNA 的表達水平明顯高于未行化療患者，二者比較差異有統計學意義（P<0.001）。這與前人的研究[14-15, 29-30]結果相一致，即化療后 CRYAB 蛋白在惡性腫瘤中的表達將會上調。可以看出，使用化療藥物后，腫瘤細胞可能會通過多種不同的途徑激發其自我保護功能，降低凋亡信號對自身的影響，上調 CRYAB 蛋白的表達，有助于腫瘤細胞的自我保護，一定程度上減少細胞的凋亡，由此推論，化療藥物耐藥的原因之一也正是因為不同患者 CRYAB mRNA 的表達水平有所不同導致的，CRYAB mRNA 通過多途徑對化療效果起到不同程度的影響。有研究[31]指出，CRYAB 蛋白可保護機體免受異常折疊蛋白或氧化炎癥環境的毒害，體現了 CRYAB 蛋白具有保護細胞的作用，同時其在癌細胞中表達時具有致瘤性。目前一些新興策略提出，可刺激蛋白的有益表達或者改變其在病理情況下所起到的作用，從而達到臨床治療的效果。例如，可通過模擬合成特定的組成 CRYAB 蛋白的低聚化合物來達到對 CRYAB 蛋白表達進行調節的目的，并且在不久的將來實現藥物的臨床試驗，最終用于臨床治療。也有研究[32]對宮頸癌相關轉錄組數據進行 meta 分析，將基因表達譜與基因組級生物分子網絡相結合，在 RNA（mRNA 和 miRNA）、蛋白（受體、轉錄因子等）、代謝物水平等方面揭示了宮頸癌中 CRYAB 蛋白是新的候選生物標志物和潛在的治療靶點。所以，研制 CRYAB 基因位點靶向抑制藥物，并與化療藥物合用，能實現更優化有效的胃癌化療用藥策略，可能對改善化療藥物的耐藥、提高術前及術后化療療效有巨大幫助。
綜上，本研究在蛋白及基因層面探索了 CRYAB 蛋白在胃癌組織中的表達情況，發現胃癌的發生發展與 CRYAB 蛋白的高水平表達密切相關，同時推測化療耐藥的原因之一可能與使用化療藥物后腫瘤細胞中 CRYAB mRNA 表達上調相關，從而保護腫瘤細胞，體現出其抗凋亡特性，但需要更大的樣本量來降低偏倚以及對實際化療效果進行評價，從而證實這一觀點。但可以指出的是，CRYAB 蛋白不論是在胃癌的診斷、臨床治療等方面具有重要意義和廣闊的應用前景，同時在評估患者預后及提供個體化隨診方案方面也有著指導作用。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：肖國，實驗設計、資料采集、各項實驗的具體實施和論文編撰；姜淮蕪，主持科研施行、實驗指導和科研質量控制；徐亮，實驗指導和協助臨床資料采集；明銳，協助實施實驗和資料采集；馬波，協助實施實驗。
倫理聲明：本研究已通過西南醫科大學附屬第一醫院（批文編號：KY2020185）和四川綿陽四〇四醫院的倫理審核批準（批文編號：005）。
志謝：非常感謝伏陽燕老師和陳俐巧老師對實驗的指導和對具體實驗操作的協助，感謝許婷婷老師的指導和對切片觀察的協助。
胃癌（gastric cancer）是危害我國乃至全球的公共衛生問題，在 2018 年新發 100 多萬例胃癌，并有 78.3 萬例死亡，使其成為全球第五常見的惡性腫瘤并高居腫瘤死亡率的第 3 位[1]，處于亞洲的中國也是全球胃癌高發地之一[2]。由于胃癌在早期時通常沒有明顯和特異的征兆，諸多患者就診時已處于疾病晚期，預后不佳[3]。在過去的 20 年里，胃癌領域中創新了許多診斷與治療方法，并取得了重大成就，早期胃癌的 5 年生存率甚至可達到 95% 以上[4]，但晚期胃癌患者的預后仍然很差[5]，術后復發和轉移是臨床面臨的主要挑戰。因此深入了解胃癌的進展過程對優化臨床診療至關重要，由此迸發出了諸多新的研究熱點，αB-晶體蛋白（alpha B-crystallin，CRYAB）就是其中之一。研究[6]證實，CRYAB 可能在許多惡性腫瘤的發生和發展過程中發揮重要作用。CRYAB 又稱 HspB5 蛋白，最早發現于眼球晶狀體，其與多種惡性腫瘤的發生和發展相關，例如消化系統的喉鱗癌、食管癌、胃癌、肝癌和結直腸癌，以及其他系統的卵巢癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、骨肉瘤、膠質母細胞瘤等腫瘤有著密切的相關性。它是熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）家族中最重要的成員之一[7]。HSPs 是一組高度保守的肽類蛋白質，主要屬于胞內蛋白并存在于多種類型細胞中，可作為分子伴侶參與蛋白質的合成、折疊、積聚、裝配、運輸和降解[8]，而 CRYAB 蛋白正是通過調控細胞周期、分化、凋亡、炎癥、氧化應激等細胞通路[9]，從而起著抗細胞凋亡[10]、穩定細胞骨架蛋白和骨架網絡[11-12]、免疫系統激活[13]等功能。并且有研究[14-15]表明，CRYAB 蛋白與腫瘤化療藥物耐藥密切相關，對熱應激、氧化應激等誘導的細胞死亡具有保護作用，由此可直接影響化療效果。胃癌的綜合治療中，術前新輔助化療和術后化療的療效已得到確切證實，但化療后的療效卻不盡相同，為探究所采用的奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶等藥物作用于患者后是否對胃癌組織中 CRYAB 蛋白的表達水平有影響、從而導致療效不同，本研究探索了 CRYAB 蛋白在胃癌組織中的表達，以明確 CRYAB 蛋白表達與胃癌患者臨床病理學特征的相關性，旨在為優化胃癌的診療提供方向及依據。
1 資料及方法
1.1 研究對象
回顧性收集西南醫科大學附屬第一醫院及四川綿陽四〇四醫院 2018 年 4 月至 2020 年 3 月期間的行根治性手術切除的 76 例胃癌患者的癌組織及相應的癌旁組織（癌旁組織距離癌組織以遠 5 cm，術后病理未查見癌細胞）。納入標準：① 年齡≤75 歲，術前胃鏡病理學檢查確診胃癌，根據病變部位行胃癌根治術，術后病理學檢查示有完整切緣，且切緣陰性；② 未進行術前、術中化療，術前放療，免疫治療等抗腫瘤治療措施；③ 均經術后病理確診為原發胃癌，并明確了病理學類型；④ 病例資料完整；⑤ 有完整的腫瘤組織和陰性切緣組織的石蠟標本。排除標準：① 早期胃癌行內鏡治療患者 ［內鏡下黏膜切除術（EMR）或內鏡黏膜下剝離術（ESD）］；② 胃癌術后復發或殘胃再發癌患者。收集患者的臨床病理學特征相關數據，包括年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑、TNM 分期、Borrmann 分型、分化程度、淋巴結轉移、浸潤深度以及病理 Lauren 分類。76 例胃癌患者的臨床病理學特征見表 1。
表1
CRYAB 蛋白在胃癌組織中的表達及其與患者臨床學病理特征的關系
此外，前瞻性收集 2018 年 11 月至 2020 年 3 月期間西南醫科大學附屬第一醫院收治的 21 例新輔助化療后行胃癌根治術的患者以及 26 例未行新輔助化療患者的胃癌組織標本。納入標準：① 同上述胃癌納入標準的第 1–3 項；② 所有病例臨床分期為 Ⅱ～Ⅲ 期；③ 無重大基礎疾病，能耐受手術及術后臨床治療。排除標準：① 同上述胃癌排除標準的第 1–2 項；② 晚期出現淋巴結轉移患者。新輔助化療患者為術前接受 5-氟尿嘧啶（劑量為 500 mg/m2，連用 4 d）+奧沙利鉑（劑量為 130 mg/m2，給藥 1 次）化療方案，3 周為 1 個療程，總共化療 2～3 次，停 3～4 周后行胃癌根治術。本研究所有臨床數據及資料經患者同意用于科學研究并簽署知情同意書。
1.2 主要實驗試劑和設備
1.2.1 主要實驗試劑
重組 Anti-Alpha B-Crystallin 抗體（成都萬道生物科技發展有限公司，克隆號 EPR2752）、TRIzol（美國 Invitrogen 公司，15596-026）、氯仿（中國南京化學試劑有限公司）、異丙醇（中國南京化學試劑有限公司）、70% 乙醇（中國江蘇凱基生物技術股份有限公司，KGDN6）、0.1% DEPC Water（中國江蘇凱基生物技術股份有限公司，KGDN4500）、cDNA 第一鏈合成試劑盒（日本 TaKaRa 公司，RR036B）和 One Step TB GreenTM PrimeScriptTM RT-PCR Kit Ⅱ （SYBR Green，日本 TaKaRa 公司，RR086B）。
1.2.2 主要設備
立式壓力鍋（YXQ-LS-50，中國上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）、電熱鼓風干燥箱（101AS-3，中國上海圣欣科學儀器有限公司）、分析天平（BL310/BL21S，德國 Sartorius 公司）、超凈工作臺（SW-CJ-1FD，中國蘇州凈化設備有限公司）、臺式低速離心機（80-2，中國上海醫療器械股份有限公司醫療設備廠）、通風櫥（單柜，中國蘇州凈化設備有限公司）、渦旋振蕩器（XW-80A，中國海門其林貝爾儀器制造有限公司）、高速冷凍離心機（ST16R，美國 Thermo Sorvall 公司）、紫外光度儀（UV-2450，日本 SHIMADZU 公司）、普通梯度 PCR 儀（Veriti 96 well Thermal cycler，美國 ABI 公司）、熒光定量 PCR 循環儀（Step one plus Real time-PCR system，美國 ABI 公司）、移液器（10、200 和 1000 μL，德國 Eppendorf 公司）、自動組織脫水機（ASP200S，Leica Biosystems Nussloch GmbH 公司）、生物組織包埋機（YB-6，湖北泰維科技實業有限公司）、新飛冰箱（BCD-208D，北新飛電器集團有限公司）、可微調移液器（10～200 μL，P4808，深圳市愛納多電子商務有限公司）、生物組織攤烤片機（YT-7FB 型，湖北省孝感亞光醫用電子技術有限公司）、電熱恒溫培養箱（DH5000AB，蘇州威爾實驗用品有限公司）、切片機（Thermo，北京吉特普倫生物技術有限公司）和研究級光學顯微鏡（OLYMPUS BX-43，北京泰克匯光科技有限公司）。
1.3 應用免疫組織化學 SP 法檢測 CRYAB 蛋白在胃癌組織中的表達
胃癌組織和癌旁組織行免疫組織化學 SP 法染色以檢測 CRYAB 蛋白的表達水平。SP 法主要具體操作步驟：石蠟切片 4 μm，脫蠟至水；蒸餾水洗，PBS 浸泡 5 min；抗原修復采用高壓抗原修復法，即將切片放入抗原修復液中再置于高壓鍋中，待噴氣后計時 5 min 取出切片冷卻到室溫，PBS 洗3 次，每次 2 min；使用 3% 的雙氧水室溫孵育10 min 以消除內源性過氧化物酶活性；PBS 沖洗后滴加一抗 1∶100 稀釋，4 ℃ 下孵育過夜，再次 PBS 沖洗后滴加二抗，37 ℃ 孵育 25 min，PBS 沖洗后進行 DAB 顯色；最后使用蒸餾水充分沖洗、復染、脫水、透明和封片。
結果判定標準[16]：以細胞胞漿中呈現為棕黃色染色視為 CRYAB 蛋白表達陽性。免疫染色由兩名病理醫師同時根據陽性細胞的百分比和染色強度進行評分，評分有分歧時進行討論，討論結果不一致由第 3 名病理醫師進行評定。陽性細胞的百分比分為 4 類：0～10%，1 分；11%～50%，2 分；51%～80%，3 分；81%～100%，4 分。染色強度評分如下：無色，陰性，0 分；淡黃色，弱陽性，1 分；棕黃色，中陽性，2 分；棕褐色，強陽性，3 分。以陽性細胞百分比得分與染色強度對應得分的乘積作為最終染色分數。采用兩級評分系統對 CRYAB 蛋白表達染色程度進行量化：總分<4 分為低表達，總分≥4 分為高表達。
1.4 應用實時熒光定量 PCR（real-time-PCR，qPCR）方法檢測 CRYAB mRNA 在胃癌組織中的表達
胃癌組織樣本收集后置于–78 ℃ 冷藏柜中超低溫保存。qPCR 步驟：首先提取胃癌組織標本的 RNA，提取后進行 RNA 濃度和純度的測定，即取5 μL RNA 樣品到 495 μL 1×TE Buffer 中，測定樣品在 260 nm 和 280 nm 處的吸光度值（A 值），RNA 的濃度＝A260×稀釋倍數×0.04 μg/μL（比色皿光徑為1 cm），本實驗A260/280=1.9，表明 RNA 濃度以及純度達標。然后采用逆轉錄試劑盒進行 cDNA 的第一鏈合成。設計合成的 PCR 引物，CRYAB 引物正向為 5′-CGCCTCTTTGACCAGTTCTTC-3′，反向為5′-AAGGTAGAAGGGACTCAGGGA-3′，擴增片段長度為 84 bp。采用 GAPDH 為內參照，引物正向為 5′-CAAATTCCATGGCACCGTCA-3′，反向為5′-AGCATCGCCCCACTTGATTT-3′，擴增片段長度為 109 bp。在完成 qPCR 預實驗后進行 qPCR 正式實驗以測定 CRYAB mRNA 的表達水平，正式實驗循環過程中擴增條件為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s；循環 40 次。qPCR 實時熒光實驗結果采用 2–ΔΔCT 方法計算。
1.5 統計學方法
所有數據結果經過 Excel 整理，采用 SPSS 17.0 統計軟件進行統計處理。計數資料采用成組或配對設計的 χ2 檢驗，計量資料采用兩獨立樣本比較的 t 檢驗（本研究數據符合正態分布及方差齊性條件）。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 CRYAB 蛋白在胃癌組織及其癌旁組織中的表達結果
免疫組織化學染色（圖 1a 和圖 1b）結果顯示，CRYAB 蛋白的染色部位主要是細胞胞漿，呈現為棕黃色或棕褐色，即 CRYAB 蛋白的表達主要是位于細胞胞漿中。76 例胃癌組織中，CRYAB 蛋白高表達 51 例（67.1%），癌旁組織高表達 32 例（42.1%），CRYAB 蛋白在胃癌組織中的高表達率高于癌旁組織（χ2=9.581，P=0.002）。
圖1
示 CRYAB 蛋白在胃癌組織及其癌旁組織中的表達（SP ×400），以及新輔助化療組和未行新輔助化療組胃癌組織中 CRYAB mRNA 的表達水平
a：胃癌組織中 CRYAB 蛋白呈陽性表達；b：癌旁組織中 CRYAB 蛋白呈陰性表達；c：新輔助化療組和未行新輔助化療組胃癌組織中 CRYAB mRNA 的表達水平
2.2 胃癌組織中 CRYAB 蛋白的表達與胃癌患者臨床病理學特征的關系
CRYAB 蛋白在胃癌組織中的高表達與患者年齡、性別、腫瘤部位及腫瘤直徑均無關（P>0.05），而與腫瘤 Borrmann 分型、TNM 分期、分化程度、淋巴結轉移、浸潤深度和 Lauren 分類均有關（P<0.05），Borrmann 分型Ⅲ+Ⅳ型者的高表達率高于 Ⅰ+Ⅱ 型者，TNM Ⅲ+Ⅳ 期者的高表達率高于 Ⅰ+Ⅱ 期者，低+未分化者的高表達率高于高+中分化者，有淋巴結轉移者的高表達率高于無淋巴結轉移者，浸潤深度為漿膜層+胃全層者的高表達率高于黏膜層+固有肌層者，Lauren 分類為彌漫型者的高表達率較高，腸型的高表達率較低。具體見表 1。
2.3 新輔助化療組和未行新輔助化療組胃癌組織中 CRYAB mRNA 的表達水平比較
對 21 例新輔助化療后的胃癌癌組織及 26 例未行新輔助化療患者的胃癌組織的 CRYAB mRNA 表達水平進行檢測的結果見圖 1c。新輔助化療組的 CRYAB mRNA 的表達水平為 1.24±0.22，高于未行新輔助化療組的 0.78±0.16，差異具有統計學意義（t=8.37，P<0.001）。
3 討論
在 1989 年，Iwaki 等[17]發表了第 1 篇關于 CRYAB 蛋白在病理狀態下于非晶體組織中異常表達的文章，隨后關于 CRYAB 蛋白的研究逐漸深入，自 2000 年開始，對其部分作用機制已有了一些基礎的理解，特別是在白內障、心肌病[18-19]等方面有了一些重大進展。隨后 2 年，關于 CRYAB 蛋白與腫瘤的相關性被提出，最早研究的腫瘤有我們熟知的卵巢癌[20]、間變性甲狀腺癌[21]、膠質母細胞瘤[22]、乳腺癌[23]等。有研究[18]證明，CRYAB 蛋白是一種有效的負調控因子，可以抑制免疫系統和中樞神經系統（CNS）中的多種炎癥通路，并且提示 CRYAB 蛋白具有抗凋亡作用。此外研究[19]發現，CRYAB 蛋白可作為血管內皮生長因子 A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）的伴侶蛋白，在血管生成中發揮重要作用，并證明了其在腫瘤侵襲和轉移方面所存在的促進作用及有著作為治療靶點的潛力。有研究[24]發現，M2 巨噬細胞通過上調 CRYAB 基因表達并激活細胞外調節蛋白激酶 1/2/原癌基因 Fra-1/slug 蛋白（ERK1/2/Fra-1/slug）信號通路，通過上皮細胞-間充質轉化（EMT）促進肺癌的惡性進展；而且也有研究[25]表明，CRYAB 蛋白與結直腸癌不良預后也相關，其通過 ERK 信號通路促進 EMT 進程。它是一個潛在的腫瘤生物標志物并且關系到結直腸癌（CRC）的診斷和預后。EMT 指的是上皮細胞在一些因素的作用下，失去極性及細胞間緊密連接和黏附連接，獲得了浸潤性和游走遷移能力，變成具備間質細胞形態和特性的細胞學改變。EMT 是諸多腫瘤進展的重要路徑之一，眾所周知胃癌也與 EMT 有著不可分割的聯系，由此可以推測，CRYAB 蛋白可能通過 EMT 促進胃癌的發生發展。以上結果都提示 CRYAB 蛋白與胃癌的發生發展關系密切。而這些推斷都與本研究結果相同，本研究結果表明，CRYAB 蛋白在胃癌組織中的高表達率高于癌旁組織（P=0.002）。
通過對 CRYAB 蛋白機制的研究，發現 CRYAB 蛋白最重要的作用是其抗凋亡多肽在各種條件下對細胞凋亡產生影響，但它不僅僅是在腫瘤的發生中有著積極作用。研究[26-27]表明，CRYAB 蛋白在腫瘤發展中也是十分重要的，它直接關系到腫瘤的轉移和復發，這涉及到患者的術后生存時間。為了進一步探索 CRYAB 蛋白與胃癌的相關性，本研究探索了 CRYAB 蛋白在胃癌組織中的表達與患者臨床病理學特征的關系，結果發現，CRYAB 蛋白在胃癌組織中的高表達與患者年齡、性別、腫瘤直徑和腫瘤部位均無關（P>0.05），而與腫瘤 TNM 分期、分化程度、浸潤深度、Borrmann 分型及淋巴結轉移有關（P<0.05）。同時本研究通過病理 Lauren 分類的組間分析發現，CRYAB 蛋白在胃癌腸型中的高表達率與彌漫型的差異存在統計學意義（P<0.05），而混合型與彌漫型的 CRYAB 蛋白的高表達率比較差異無統計學意義（P>0.05），也就是說，CRYAB 蛋白的高表達與胃癌病理組織學分級密切相關，可能對胃癌的進展起到至關重要的作用。本研究除了我們熟知并且常用來統計的分類外，在新加入的 Borrmann 分型和病理 Lauren 分類這兩項中也有了新的發現。就 Borrmann 分型來講，其分級越高，越能體現胃癌組織的腫瘤界限的不確定性，更具有侵襲性，并且分化程度通常較低，與術后腫瘤復發轉移密切相關，本研究結果側面也印證了這一點。從對病理 Lauren 分類的分析來看，腸型腺癌與彌漫型（低分化癌）中 CRYAB 蛋白的表達情況存在差異，通常腸型腺癌的惡性程度較后者較低，預后也較好。加上諸多的研究[26-28]證實，CRYAB 蛋白可作為多種腫瘤預后的獨立因素，可作為評估患者預后的指標，由此可以推斷出，CRYAB 與胃癌的預后也是相關的，這都與本研究推斷一致。因而檢測 CRYAB 蛋白在胃癌組織中的表達情況可以對臨床治療起到一定的指導作用。
有學者[14]在人類惡性黑色素瘤細胞株中進行順鉑、依托泊苷、福莫司汀及三者衍生物的耐藥性實驗，研究發現，富含半胱氨酸蛋白 61（cysteine rich 61，CYR61）、腺苷高半胱氨酸酶 1（Adenosylhomocysteinase1，AHCYL1）、膜棕櫚酰化蛋白 1（membrane-palmitoylated protein，MPP1）以及幾個與凋亡相關的基因，尤其是 CRYAB 基因，在耐藥實驗中均體現出表達差異，展示出其顯著的對抗 DNA 損傷藥物的耐藥性。Kase 等[15]研究發現，CRYAB 蛋白在化療后視網膜母細胞瘤中高表達，能減少抗癌藥物產生的凋亡信號，從而保護腫瘤細胞。也有研究[29]發現，在卵巢癌中順鉑誘導的細胞凋亡程度由于 CRYAB 蛋白表達的上調而明顯下降。研究[30]證實，miR-491 通過靶向 CRYAB 蛋白可抑制骨肉瘤肺轉移和化療耐藥，過表達 miR-491 可通過作用于 CRYAB 蛋白而抑制骨肉瘤細胞的肺轉移，而增強順鉑誘導的腫瘤生長抑制和凋亡。以上這些研究都證實了 CRYAB 蛋白在細胞保護方面及抗凋亡方面中的作用。本研究針對 21 例新輔助化療后行胃癌根治術患者的癌組織以及 26 例未行新輔助化療患者的癌組織標本，采用 qPCR 法檢測 CRYAB mRNA 的表達水平，結果發現，化療后癌組織中 CRYAB mRNA 的表達水平明顯高于未行化療患者，二者比較差異有統計學意義（P<0.001）。這與前人的研究[14-15, 29-30]結果相一致，即化療后 CRYAB 蛋白在惡性腫瘤中的表達將會上調。可以看出，使用化療藥物后，腫瘤細胞可能會通過多種不同的途徑激發其自我保護功能，降低凋亡信號對自身的影響，上調 CRYAB 蛋白的表達，有助于腫瘤細胞的自我保護，一定程度上減少細胞的凋亡，由此推論，化療藥物耐藥的原因之一也正是因為不同患者 CRYAB mRNA 的表達水平有所不同導致的，CRYAB mRNA 通過多途徑對化療效果起到不同程度的影響。有研究[31]指出，CRYAB 蛋白可保護機體免受異常折疊蛋白或氧化炎癥環境的毒害，體現了 CRYAB 蛋白具有保護細胞的作用，同時其在癌細胞中表達時具有致瘤性。目前一些新興策略提出，可刺激蛋白的有益表達或者改變其在病理情況下所起到的作用，從而達到臨床治療的效果。例如，可通過模擬合成特定的組成 CRYAB 蛋白的低聚化合物來達到對 CRYAB 蛋白表達進行調節的目的，并且在不久的將來實現藥物的臨床試驗，最終用于臨床治療。也有研究[32]對宮頸癌相關轉錄組數據進行 meta 分析，將基因表達譜與基因組級生物分子網絡相結合，在 RNA（mRNA 和 miRNA）、蛋白（受體、轉錄因子等）、代謝物水平等方面揭示了宮頸癌中 CRYAB 蛋白是新的候選生物標志物和潛在的治療靶點。所以，研制 CRYAB 基因位點靶向抑制藥物，并與化療藥物合用，能實現更優化有效的胃癌化療用藥策略，可能對改善化療藥物的耐藥、提高術前及術后化療療效有巨大幫助。
綜上，本研究在蛋白及基因層面探索了 CRYAB 蛋白在胃癌組織中的表達情況，發現胃癌的發生發展與 CRYAB 蛋白的高水平表達密切相關，同時推測化療耐藥的原因之一可能與使用化療藥物后腫瘤細胞中 CRYAB mRNA 表達上調相關，從而保護腫瘤細胞，體現出其抗凋亡特性，但需要更大的樣本量來降低偏倚以及對實際化療效果進行評價，從而證實這一觀點。但可以指出的是，CRYAB 蛋白不論是在胃癌的診斷、臨床治療等方面具有重要意義和廣闊的應用前景，同時在評估患者預后及提供個體化隨診方案方面也有著指導作用。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：肖國，實驗設計、資料采集、各項實驗的具體實施和論文編撰；姜淮蕪，主持科研施行、實驗指導和科研質量控制；徐亮，實驗指導和協助臨床資料采集；明銳，協助實施實驗和資料采集；馬波，協助實施實驗。
倫理聲明：本研究已通過西南醫科大學附屬第一醫院（批文編號：KY2020185）和四川綿陽四〇四醫院的倫理審核批準（批文編號：005）。
志謝：非常感謝伏陽燕老師和陳俐巧老師對實驗的指導和對具體實驗操作的協助，感謝許婷婷老師的指導和對切片觀察的協助。
