引用本文： 孫生安, 白明輝, 韓保衛, 王云帥. Hsa-miR-29c 在胃癌中的表達及其臨床意義研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(2): 200-207. doi: 10.7507/1007-9424.202005012 復制
胃癌（gastric cancer）是消化系統的常見惡性腫瘤。據報道，我國胃癌患者的發病率和死亡率分別居惡性腫瘤的第 3 位和第 2 位[1]。胃癌的治療強調多學科和多手段綜合治療。其中，藥物化療是其不可或缺的重要方法，但化療耐藥仍是目前影響治療效果的重要原因[2]。因此，尋求新的分子靶點尤為重要。微小 RNA（microRNA，miRNA）是內源性非編碼小 RNA，可與靶 mRNA 特異性結合而參與細胞增殖、分化、凋亡等重要過程[3]。目前諸多研究[4-6]已證實，miRNA 與胃癌的發生發展及預后密切相關，如 miR-135a 可調控胃癌細胞遷移及增殖，miR-20a 可促進胃癌細胞增殖等。此外，miRNA 也可作為胃癌的診斷標志物。作為家族成員之一，Hsa-miR-29c 目前研究較少，僅在食管癌[7]、膽囊癌[8]等中有報道其可能作為一種抑癌基因影響著腫瘤的發展進程。基于此，本研究擬初步探討 Hsa-miR-29c 在胃癌中的作用及其與患者預后的關系，以期為尋求胃癌治療的新靶點提供參考。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑和設備
1.1.1 細胞株
人胃癌細胞株 MKN28 及 MKN45 購自上海慧穎生物科技有限公司。
1.1.2 組織樣本
70 例胃癌組織及其癌旁組織（距癌灶邊緣>3 cm）標本來源于 2015 年 1 月至 2019 年 1 月期間在鄭州大學附屬洛陽中心醫院胃腸外科行手術治療的胃癌患者。患者年齡 35～70 歲，中位年齡為 52 歲。納入標準：① 均為原發腫瘤，無遠處其他臟器轉移；② 術后標本經筆者所在醫院病理科兩位醫師共同閱片確診為胃癌；③ TNM 分期[9]為 0～Ⅲ 期；④ 依從性好，可進行規律隨訪者；⑤ 術前或術后未進行藥物化療。排除標準：① 術前合并其他臟器轉移；② 術前或術后行輔助放療或化療治療；③ 術前一般情況差，無法耐受全麻手術；④ 無法手術切除者。本研究已征得筆者所在醫院醫學倫理委員會的批準及患者知情同意。
1.1.3 主要實驗試劑及材料
RPMI-1640 培養基、胰蛋白酶、RIPA 裂解液、qRT-PCR 引物、qRT-PCR 試劑盒、RNA 提取試劑盒（TRIzol）及逆轉錄試劑盒（M-MLV）均購自賽默飛世爾科技有限公司；胎牛血清購自流帆生物科技有限公司；Hsa-miR-29c 過表達慢病毒載體 GV358 和空載慢病毒載體 pLenti6.2/V5-DEST 購自瑞楚生物科技有限公司；Hsa-miR-29c 購自漢恒生物科技（上海）有限公司；CCK-8 試劑盒購自上海經科化學科技有限公司；兔抗人 Hsa-miR-29c 多克隆抗體、兔抗人細胞外基質蛋白 1（ECM1）單克隆抗體、兔抗人Ⅰ型膠原（ColⅠ）單克隆抗體、兔抗人平滑肌肌動蛋白（α-SMA）單克隆抗體、兔抗人基質金屬蛋白酶 2（MMP-2）單克隆抗體、兔抗人金屬蛋白酶組織抑制物 1（TIMP-1）單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體及辣根過氧化物酶耦聯山羊抗兔 IgG 二抗購自 Abcam 中國（艾博抗貿易有限公司）；紫外線分光光度計（UV752）和 Bio-Rad CFX96 PCR 儀購自浙江賽德儀器設備有限公司。
1.2 方法
各部分細胞實驗均重復檢測 5 次。
1.2.1 細胞培養、傳代及 Hsa-miR-29c 轉染
分別將 MKN28 細胞及 MKN45 細胞置入 RPMI-1640 培養基（含 10% 胎牛血清）中，并放入 37 ℃、濕度為 97% 的恒溫培養箱中培養，每 72 小時更換 1 次培養液，待細胞匯合度達到 80% 時進行細胞傳代。Hsa-miR-29c 轉染：分別取處于對數生長期的 MKN28 細胞及 MKN45 細胞接種于 6 孔板中（細胞密度為 5×105/孔），置于 37 ℃ 恒溫培養箱中培養 24 h。待細胞匯合度達 30%～50% 時，取 Hsa-miR-29c 過表達慢病毒載體（轉染組）及空載慢病毒（陰性對照組），按轉染復數（MOI）=10 轉染 MKN28 細胞及 MKN45 細胞 24 h，棄去毒液，重新更換新鮮培養基，72 h 后再用含嘌呤霉素（2 μg/mL）的培養基培養 5 d，期間 2 d 更換 1 次培養液，篩選出穩定表達的細胞株以備后續研究。采用 qRT-PCR 法驗證 Hsa-miR-29c 基因的轉染效果。
1.2.2 細胞總 RNA 提取及細胞轉染效率測定
分別取處于對數期的 MKN28 細胞及 MKN45 細胞加入 1 mL 的 TRIzol 試劑，作用 10 min 后再加入2 000 μL 氯仿，振蕩 15 min 后在室溫下靜置 10 min，4 ℃ 下離心（離心半徑 6.9 cm，4 500 r/min）20 min 后取上層清液，等體積加入異丙醇，均勻混合后同等條件下再次離心，棄去上層清液，收集下層沉淀，用 75% 乙醇 1 mL 洗滌沉淀后晾干，再加入焦碳酸二乙酯（DEPC）液溶解至適宜濃度。最后用紫外線分光光度計測定總 RNA 濃度、A260 和A280 值（A 為吸光度），并設A260/A280 在 1.8～2.0 間為合格樣品。參照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄合成 cDNA，–20 ℃ 保存，設 β-actin 為內參（引物序列見表 1）。擴增條件：50 ℃ 120 s，94 ℃ 60 s，72 ℃ 120 s，37 ℃ 60 s，共 35 個循環，擴增片段長度為 300 bp。再參照 qRT-PCR 試劑盒說明書進行 PCR 反應。采用 Bio-Rad CFX96 PCR 儀測定 Hsa-miR-29c 及β-actin 的 miRNA 表達情況。最后使用 2–△△CT 法計算相對表達量 ［ΔΔCT=（CT轉染組目的基因–CT轉染組內參基因）–（CT陰性對照組目的基因–CT陰性對照組內參基因）］。
表1
實時免疫熒光的引物序列
1.2.3 組織總 RNA 提取及 qRT-PCR 法
將胃癌組織及癌旁組織在液氮下研磨成粉末狀，參考 RNA 提取試劑盒分別提取組織總 RNA，測定濃度，以瓊脂凝膠電泳檢測 RNA 的完整性。之后的 qRT-PCR 操作同 1.2.2。
1.2.4 CCK-8 法及平板克隆實驗
取對數生長期細胞分別接種于 96 板孔中（細胞密度為 5×104/mL），37 ℃ 恒溫培養箱培養 24 h，每孔加入 100 μL 含 10% CCK-8 的 DMEM 培養基，再培養 48 h，以酶標儀于不同時間點分別檢測 450 mm 波長處每孔的 A 值，繪制生長曲線。細胞增殖抑制率（%）=［（陰性 對照組 A 值–轉染組 A 值）/陰性對照組 A值］ ×100%。
平板克隆實驗：取對數生長期細胞分別接種于 96 板孔中（細胞密度為 5×104/mL），37 ℃ 恒溫培養箱培養 14 d，顯微鏡下觀察細胞克隆情況，待每孔含 50 個以上細胞時終止培養，采用 PBS 液清洗后以甲醛固定 15 min，0.1% 結晶紫染色后風干。顯微鏡下隨機選取 5 個視野計數（取均值），以 Image J 軟件計算細胞克隆數。
1.2.5 免疫組織化學法
標本經 10% 甲醛固定、石蠟包埋后制作厚度為 4 μm 的連續切片（每個標本各 5 張），二甲苯脫蠟后固定，EDTA 修復液修復后使用 PBS 液沖洗 3 次，加入濃度為 30 mol/L 的過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育后用羊血清封閉 20 min。加入兔抗人 Hsa-miR-29c 多克隆一抗抗體（1∶500），對照組加入 PBS 液；使用 PBS 液沖洗 3 次后放入 4 ℃ 冰箱過夜。之后加入羊抗兔 IgG 二抗，37℃ 烘烤 30 min，PBS 液再次沖洗 3 次，二氨基聯苯胺（DAB）顯色 15 min，清水沖洗后以蘇木精復染，中性樹膠封片固定并行鏡下觀察。每張切片分別選取 5 個視野（取均值），觀察其染色廣度及染色強度。染色廣度計分標準：0 分，0～10%；1 分，11%～25%；2 分，26%～50%；3 分，51%～75%；4 分，76%～100%。染色強度計分：0 分，無色；1 分，淡黃色；2 分，棕黃色；3 分，黃褐色。以染色廣度與染色強度得分相乘計算最終表達結果[10]：0～4 分，陰性表達；5～12 分，陽性表達。
1.2.6 Western blot 法
取對數生長期的 MKN28 細胞及 MKN45 細胞制成單細胞懸液（細胞密度為 5×104/mL），接種于 24 孔板中，37 ℃ 室溫培養 48 h。RIPA 細胞裂解液裂解細胞后分別提取總蛋白，以考馬斯亮藍法（Bradford 法）測定蛋白濃度，調整濃度后每孔加入 4 μg 樣品上樣，行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）并轉印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，以 4% 牛血清白蛋白液（BSA 液）封閉 2 h，PBS 漂洗后脫脂，再分別加入兔抗人 ECM1 單克隆一抗、兔抗人 Col Ⅰ單克隆一抗、兔抗人 α-SMA 單克隆一抗、兔抗人 MMP-2 單克隆一抗、兔抗人 TIMP-1單克隆一抗及 GAPDH 一抗（1∶2 000），4 ℃ 孵育過夜，之后以 TBST 溶液沖洗 3 次（15 min/次），再加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG 二抗（1∶2 000），37 ℃ 孵育 1 h，再次以 TBST 溶液洗滌 3 次（15 min/次），ECL 試劑盒顯影后，底片在暗室下以掃描儀透掃，膠片晾干保存后用 Image J 軟件對結果進行灰度半定量分析[11]。
1.3 隨訪
所選病例均進行定期隨訪，隨訪方法主要有電話隨訪、門診隨訪、定期來院復查隨訪、上門隨訪、微信隨訪、依托醫院信息化隨訪平臺等方式。隨訪內容主要為患者治療效果、病情變化、恢復情況、腫瘤有無復發及復發時間，以及目前有無新發癥狀、有無藥物不良反應等，并同時指導患者用藥、復診時間等。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 21.0 軟件對數據進行分析。定量資料采用成組 t 檢驗或單因素方差分析進行比較；計數資料以例表示，組間比較采用配對或成組 χ 2 檢驗。采用 Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，生存曲線比較采用 log-rank 檢驗，采用 Cox 比例風險回歸模型篩選預后的危險因素。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 qRT-PCR 法檢測 Hsa-miR-29c 的轉染情況
qRT-PCR 結果表明，本研究成功構建了穩定表達 Hsa-miR-29c 的 MKN28 細胞及 MKN45 細胞，MKN28 細胞及 MKN45 細胞中，轉染組細胞內 Hsa-miR-29c 的表達水平均高于同類型細胞的陰性對照組（P<0.05），見圖 1a。
圖1
示 MKN28 細胞及 MKN45 細胞的轉染效果，轉染組和陰性對照組細胞的增殖抑制率、克隆能力以及細胞外基質信號通路相關蛋白的半定量結果和電泳結果
a：轉染后 MKN28 細胞及 MKN45 細胞內 Hsa-miR-29c 的表達水平均高于對應細胞的陰性對照組；b 和 c：轉染組和陰性對照組的 MKN28 細胞（b）和 MKN45 細胞（c）的增殖抑制率結果；d–g：陰性對照組 MKN28 細胞（d）、轉染組 MKN28 細胞（e）、陰性對照組 MKN45 細胞（f）和轉染組 MKN45 細胞（g）克隆實驗結果；h：轉染組和陰性對照組 MKN28 細胞和 MKN45 細胞的細胞克隆數；i 和 j：MKN28 細胞（i）和 MKN45 細胞（j）的細胞外基質信號通路相關蛋白的半定量結果；k 和 l：MKN28 細胞（k）和 MKN45 細胞（l）的細胞外基質信號通路相關蛋白的電泳結果；*表示
2.2 Hsa-miR-29c 對 MKN28 細胞、MKN45 細胞增殖及克隆的影響
CCK-8 法及平板克隆實驗結果顯示，與同種類型細胞的陰性對照組比較，轉染組 MKN28、MKN45 細胞的增殖抑制率較高，細胞克隆數較低，差異均有統計學意義（P<0.05），見圖 1b–1h。
2.3 細胞中細胞外基質信號通路相關蛋白的表達結果
Western blot 法結果顯示，轉染組 MKN28 細胞中 Col Ⅰ和 TIMP-1 的相對表達水平均高于陰性對照組，而 ECM1、α-SMA 和 MMP-2 的相對表達水平均低于陰性對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）；轉染組 MKN45 細胞中的表達情況與此相同，差異亦有統計學意義（P<0.05），見圖 1i–1l。
2.4 qRT-PCR 檢測胃癌組織及其癌旁組織中Hsa-miR-29c 的表達水平
胃癌組織中 Hsa-miR-29c 的表達水平低于癌旁組織，差異有統計學意義（t=9.583，P=0.001）。見圖 2a。
圖2
示胃癌組織及癌旁組織中 Hsa-miR-29c 的表達情況，以及 Hsa-miR-29c 陰性表達與陽性表達胃癌患者的生存曲線
a：胃癌組織中 Hsa-miR-29c 的表達低于癌旁組織，*表示
2.5 Hsa-miR-29c 表達與胃癌臨床病理學特征的相關性分析
胃癌組織中 Hsa-miR-29c 的表達與年齡、性別及病理學類型均無關（P>0.05），而與腫瘤直徑、TNM 分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移有關（P<0.05），腫瘤直徑≥4 cm、TNM 分期為 Ⅲ 期、分化程度為低分化、有淋巴結轉移者的 Hsa-miR-29c表達陽性率相應較腫瘤直徑<4 cm、TNM 分期 0～Ⅱ 期、高中分化和無淋巴結轉移者的陽性表達率較低。見表 2。
表2
Hsa-miR-29c 在胃癌組織中的表達與患者臨床病理學特征間的關系（例）
2.6 Hsa-miR-29c 表達與胃癌患者預后的相關性分析
Hsa-miR-29c 陰性表達胃癌組患者的中位生存期為 14 個月，短于陽性表達者（34 個月），差異有統計學意義（P=0.001），見圖 2b；進一步進行 Cox 比例風險回歸模型，結果顯示，Hsa-miR-29c 表達和腫瘤淋巴結轉移是胃癌預后的獨立預測因子（P<0.05），見表 3。
表3
單因素及多因素生存分析結果
3 討論
腫瘤的發生發展是遺傳、環境等多因素相互作用的結果[14]，其中，表觀遺傳改變主要是通過非編碼 miRNA、組蛋白修飾及 DNA 甲基化進行調節[15]。miRNA 是一種內源性、保守穩定的單鏈非編碼小 RNA，長度在 18～25 nt，廣泛存在于動物、植物乃至病毒等多種生物體中[16]，可通過與靶基因 3′ 端非編碼區 mRNA（3′ UTR）結合互補而抑制 mRNA 轉錄，調控多種基因及蛋白表達，在腫瘤中發揮重要作用，是研究的熱點[17]。
作為 miRNA 成員之一，miR-29 家族包括 miR-29a、miR-29b 及 miR-29c[18]。其中，Hsa-miR-29c 定位于人染色體 lq32.2，緊鄰 CD46 基因，且只有一個轉錄本，在核酸酶 Dicer 作用下，它可分為兩條成熟的 miRNA，即 Hsa-miR-29c-3p 和 Hsa-miR-29c-5p[19]。Hsa-miR-29c 最早由 Dostie 等[20]在人神經元細胞中發現，隨后的相關研究[21]顯示，Hsa-miR-29c 參與了人體內細胞分化、增殖、凋亡等多種生物學過程，調控著腫瘤的發生發展及預后。如 Liu 等[22]研究發現，Hsa-miR-29c 在鼻咽癌中的表達顯著下調，且與鼻咽癌患者的預后有關。Zhao 等[23]報道顯示，Hsa-miR-29c 在套細胞淋巴瘤中的表達水平顯著下降，可抑制周期素依賴性激酶 6（CDK6）mRNA 及其蛋白的表達，影響腫瘤進展。國外 Vidal 等[24]研究發現，Hsa-miR-29c 可抑制胃癌細胞增殖，促進其凋亡。諸多研究提示其可能是一種潛在的抑癌基因。目前國內關于 Hsa-miR-29c 在胃癌中作用機制的相關研究鮮有報道，因此本研究初步探討了其在胃癌中的表達及其可能的作用機制。
本研究通過慢病毒轉染法成功構建了穩定過表達 Hsa-miR-29c 的高分化胃癌細胞株 MKN28 及低分化胃癌細胞株 MKN45，并采用 qRT-PCR 法檢測發現，轉染組細胞內 Hsa-miR-29c 的表達量高于陰性對照組，進一步驗證了轉染效率。CCK-8 法及平板克隆實驗結果表明，轉染組 MKN28 細胞及 MKN45 細胞的增殖數及克隆形成數顯著低于同類型細胞的陰性對照組，這提示過表達 Hsa-miR-29c可抑制胃癌 MKN28 及 MKN45 細胞的增殖。為了初步探究其可能存在的作用機制，筆者隨后又進行了相關實驗。
有研究[25]表明，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是由細胞合成后分布于細胞之間或細胞表面的大分子物質，由細胞間基質和基底膜（basement membrane，BM）組成，是阻止細胞轉移的重要屏障。其主要成分包括膠原蛋白、纖維連接蛋白（fibronectin，FN）、彈性蛋白等[26]。其中膠原蛋白為基本骨架[27]，在細胞表面形成纖維網狀結構，以維持細胞穩定性。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）[28]是內源性蛋白水解酶家族成員之一，其主要作用是降解 ECM，破壞 BM，進而促進細胞侵襲及轉移，可分為 5 類。其中 MMP-2 屬于Ⅳ型膠原酶類，富有侵襲性偽足，可使細胞向周圍組織浸潤，促進癌細胞侵襲和轉移。TIMP-1 是 MMP 的特異性抑制劑，可顯著抑制 ECM 降解，進而抑制腫瘤細胞轉移[29]。ECM1 最早是從鼠成骨基質細胞系 MN7 中分離出來的一種分泌性糖蛋白[30]，可通過整合素（integrins）與細胞直接作用，激活磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱為 Akt）信號通路，進而促進腫瘤發生。α-SMA 是一種具有收縮功能的微絲蛋白[31]，參與合成多種細胞外基質成分，促進細胞的分裂、爬行運動、轉移等過程。本研究通過 Western blot 法檢測了細胞內 ECM 相關蛋白的表達情況，發現轉染后 MKN28 細胞及 MKN45 細胞內的 Col Ⅰ及 TIMP-1 蛋白的表達量均明顯升高，而 ECM1、α-SMA 和 MMP-2 蛋白的表達量均明顯降低，結合 ECM 相關蛋白的生物學特點、以及上述 CCK-8 法及平板克隆實驗結果，筆者推測，過表達 Hsa-miR-29c 抑制胃癌MKN28 及 MKN45 細胞增殖可能是通過調控 ECM 信號通路相關蛋白表達而實現的。這與國內外的研究[32-38]結果一致，提示其在胃癌中是一種抑癌基因。此外，陳點點等[39]的研究報道顯示，Hsa-miR-29c的作用機制可能與 PI3K/Akt 信號通路有關。而 ECM1 蛋白正是通過激活 PI3K/Akt 信號通路發揮作用的，因此本研究也進一步驗證了陳點點等[39]的研究結果。
隨后作者通過 qRT-PCR 法檢測發現，胃癌組織中 Hsa-miR-29c 的表達量低于癌旁組織，同時分析其與患者臨床病理學特征間的相關性后發現，Hsa-miR-29c 的表達水平與胃癌患者年齡、性別及病理學類型無關，而與腫瘤直徑、TNM 分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移有關，腫瘤直徑越大、TNM 分期越晚、腫瘤分化程度越低，或有淋巴結轉移者，Hsa-miR-29c 表達陽性率越低。進一步的 Cox 比例風險回歸模型結果顯示，Hsa-miR-29c 表達情況和腫瘤淋巴結轉移情況是胃癌預后獨立的預測因子。其中，Hsa-miR-29c 陽性表達患者的生存期長于陰性表達者（14 個月比 34 個月）。結合上述系列實驗研究，筆者分析，Hsa-miR-29c 在胃癌中是一種抑癌基因，且呈低表達水平時，對 ECM 信號通路抑制作用弱，易促進腫瘤發生，以及癌細胞增殖、侵襲和轉移，因此 Hsa-miR-29c 陰性表達患者的預后差，生存期短，同時這也提示，臨床診治中檢測 Hsa-miR-29c 的表達水平有助于判斷胃癌患者的預后。
綜上所述，本研究初步證實，Hsa-miR-29c 在胃癌中的表達下調，是一種抑癌基因，參與了胃癌的發展過程，且與患者臨床病理學特征及預后密切相關，過表達 Hsa-miR-29c 可顯著抑制胃癌細胞增殖，機制可能與 ECM 信號通路有關，有望成為胃癌新的診治靶點。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：孫生安負責本課題的實驗設計、實驗操作、標本取材及制作、數據統計等；白明輝和王云帥協助完成相關實驗及數據的收集和整理；韓保衛負責文章的校對及修改。
倫理聲明：本研究已通過鄭州大學附屬洛陽中心醫院的倫理審核批準（批文編號：2014-12-17）。
胃癌（gastric cancer）是消化系統的常見惡性腫瘤。據報道，我國胃癌患者的發病率和死亡率分別居惡性腫瘤的第 3 位和第 2 位[1]。胃癌的治療強調多學科和多手段綜合治療。其中，藥物化療是其不可或缺的重要方法，但化療耐藥仍是目前影響治療效果的重要原因[2]。因此，尋求新的分子靶點尤為重要。微小 RNA（microRNA，miRNA）是內源性非編碼小 RNA，可與靶 mRNA 特異性結合而參與細胞增殖、分化、凋亡等重要過程[3]。目前諸多研究[4-6]已證實，miRNA 與胃癌的發生發展及預后密切相關，如 miR-135a 可調控胃癌細胞遷移及增殖，miR-20a 可促進胃癌細胞增殖等。此外，miRNA 也可作為胃癌的診斷標志物。作為家族成員之一，Hsa-miR-29c 目前研究較少，僅在食管癌[7]、膽囊癌[8]等中有報道其可能作為一種抑癌基因影響著腫瘤的發展進程。基于此，本研究擬初步探討 Hsa-miR-29c 在胃癌中的作用及其與患者預后的關系，以期為尋求胃癌治療的新靶點提供參考。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑和設備
1.1.1 細胞株
人胃癌細胞株 MKN28 及 MKN45 購自上海慧穎生物科技有限公司。
1.1.2 組織樣本
70 例胃癌組織及其癌旁組織（距癌灶邊緣>3 cm）標本來源于 2015 年 1 月至 2019 年 1 月期間在鄭州大學附屬洛陽中心醫院胃腸外科行手術治療的胃癌患者。患者年齡 35～70 歲，中位年齡為 52 歲。納入標準：① 均為原發腫瘤，無遠處其他臟器轉移；② 術后標本經筆者所在醫院病理科兩位醫師共同閱片確診為胃癌；③ TNM 分期[9]為 0～Ⅲ 期；④ 依從性好，可進行規律隨訪者；⑤ 術前或術后未進行藥物化療。排除標準：① 術前合并其他臟器轉移；② 術前或術后行輔助放療或化療治療；③ 術前一般情況差，無法耐受全麻手術；④ 無法手術切除者。本研究已征得筆者所在醫院醫學倫理委員會的批準及患者知情同意。
1.1.3 主要實驗試劑及材料
RPMI-1640 培養基、胰蛋白酶、RIPA 裂解液、qRT-PCR 引物、qRT-PCR 試劑盒、RNA 提取試劑盒（TRIzol）及逆轉錄試劑盒（M-MLV）均購自賽默飛世爾科技有限公司；胎牛血清購自流帆生物科技有限公司；Hsa-miR-29c 過表達慢病毒載體 GV358 和空載慢病毒載體 pLenti6.2/V5-DEST 購自瑞楚生物科技有限公司；Hsa-miR-29c 購自漢恒生物科技（上海）有限公司；CCK-8 試劑盒購自上海經科化學科技有限公司；兔抗人 Hsa-miR-29c 多克隆抗體、兔抗人細胞外基質蛋白 1（ECM1）單克隆抗體、兔抗人Ⅰ型膠原（ColⅠ）單克隆抗體、兔抗人平滑肌肌動蛋白（α-SMA）單克隆抗體、兔抗人基質金屬蛋白酶 2（MMP-2）單克隆抗體、兔抗人金屬蛋白酶組織抑制物 1（TIMP-1）單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體及辣根過氧化物酶耦聯山羊抗兔 IgG 二抗購自 Abcam 中國（艾博抗貿易有限公司）；紫外線分光光度計（UV752）和 Bio-Rad CFX96 PCR 儀購自浙江賽德儀器設備有限公司。
1.2 方法
各部分細胞實驗均重復檢測 5 次。
1.2.1 細胞培養、傳代及 Hsa-miR-29c 轉染
分別將 MKN28 細胞及 MKN45 細胞置入 RPMI-1640 培養基（含 10% 胎牛血清）中，并放入 37 ℃、濕度為 97% 的恒溫培養箱中培養，每 72 小時更換 1 次培養液，待細胞匯合度達到 80% 時進行細胞傳代。Hsa-miR-29c 轉染：分別取處于對數生長期的 MKN28 細胞及 MKN45 細胞接種于 6 孔板中（細胞密度為 5×105/孔），置于 37 ℃ 恒溫培養箱中培養 24 h。待細胞匯合度達 30%～50% 時，取 Hsa-miR-29c 過表達慢病毒載體（轉染組）及空載慢病毒（陰性對照組），按轉染復數（MOI）=10 轉染 MKN28 細胞及 MKN45 細胞 24 h，棄去毒液，重新更換新鮮培養基，72 h 后再用含嘌呤霉素（2 μg/mL）的培養基培養 5 d，期間 2 d 更換 1 次培養液，篩選出穩定表達的細胞株以備后續研究。采用 qRT-PCR 法驗證 Hsa-miR-29c 基因的轉染效果。
1.2.2 細胞總 RNA 提取及細胞轉染效率測定
分別取處于對數期的 MKN28 細胞及 MKN45 細胞加入 1 mL 的 TRIzol 試劑，作用 10 min 后再加入2 000 μL 氯仿，振蕩 15 min 后在室溫下靜置 10 min，4 ℃ 下離心（離心半徑 6.9 cm，4 500 r/min）20 min 后取上層清液，等體積加入異丙醇，均勻混合后同等條件下再次離心，棄去上層清液，收集下層沉淀，用 75% 乙醇 1 mL 洗滌沉淀后晾干，再加入焦碳酸二乙酯（DEPC）液溶解至適宜濃度。最后用紫外線分光光度計測定總 RNA 濃度、A260 和A280 值（A 為吸光度），并設A260/A280 在 1.8～2.0 間為合格樣品。參照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄合成 cDNA，–20 ℃ 保存，設 β-actin 為內參（引物序列見表 1）。擴增條件：50 ℃ 120 s，94 ℃ 60 s，72 ℃ 120 s，37 ℃ 60 s，共 35 個循環，擴增片段長度為 300 bp。再參照 qRT-PCR 試劑盒說明書進行 PCR 反應。采用 Bio-Rad CFX96 PCR 儀測定 Hsa-miR-29c 及β-actin 的 miRNA 表達情況。最后使用 2–△△CT 法計算相對表達量 ［ΔΔCT=（CT轉染組目的基因–CT轉染組內參基因）–（CT陰性對照組目的基因–CT陰性對照組內參基因）］。
表1
實時免疫熒光的引物序列
1.2.3 組織總 RNA 提取及 qRT-PCR 法
將胃癌組織及癌旁組織在液氮下研磨成粉末狀，參考 RNA 提取試劑盒分別提取組織總 RNA，測定濃度，以瓊脂凝膠電泳檢測 RNA 的完整性。之后的 qRT-PCR 操作同 1.2.2。
1.2.4 CCK-8 法及平板克隆實驗
取對數生長期細胞分別接種于 96 板孔中（細胞密度為 5×104/mL），37 ℃ 恒溫培養箱培養 24 h，每孔加入 100 μL 含 10% CCK-8 的 DMEM 培養基，再培養 48 h，以酶標儀于不同時間點分別檢測 450 mm 波長處每孔的 A 值，繪制生長曲線。細胞增殖抑制率（%）=［（陰性 對照組 A 值–轉染組 A 值）/陰性對照組 A值］ ×100%。
平板克隆實驗：取對數生長期細胞分別接種于 96 板孔中（細胞密度為 5×104/mL），37 ℃ 恒溫培養箱培養 14 d，顯微鏡下觀察細胞克隆情況，待每孔含 50 個以上細胞時終止培養，采用 PBS 液清洗后以甲醛固定 15 min，0.1% 結晶紫染色后風干。顯微鏡下隨機選取 5 個視野計數（取均值），以 Image J 軟件計算細胞克隆數。
1.2.5 免疫組織化學法
標本經 10% 甲醛固定、石蠟包埋后制作厚度為 4 μm 的連續切片（每個標本各 5 張），二甲苯脫蠟后固定，EDTA 修復液修復后使用 PBS 液沖洗 3 次，加入濃度為 30 mol/L 的過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育后用羊血清封閉 20 min。加入兔抗人 Hsa-miR-29c 多克隆一抗抗體（1∶500），對照組加入 PBS 液；使用 PBS 液沖洗 3 次后放入 4 ℃ 冰箱過夜。之后加入羊抗兔 IgG 二抗，37℃ 烘烤 30 min，PBS 液再次沖洗 3 次，二氨基聯苯胺（DAB）顯色 15 min，清水沖洗后以蘇木精復染，中性樹膠封片固定并行鏡下觀察。每張切片分別選取 5 個視野（取均值），觀察其染色廣度及染色強度。染色廣度計分標準：0 分，0～10%；1 分，11%～25%；2 分，26%～50%；3 分，51%～75%；4 分，76%～100%。染色強度計分：0 分，無色；1 分，淡黃色；2 分，棕黃色；3 分，黃褐色。以染色廣度與染色強度得分相乘計算最終表達結果[10]：0～4 分，陰性表達；5～12 分，陽性表達。
1.2.6 Western blot 法
取對數生長期的 MKN28 細胞及 MKN45 細胞制成單細胞懸液（細胞密度為 5×104/mL），接種于 24 孔板中，37 ℃ 室溫培養 48 h。RIPA 細胞裂解液裂解細胞后分別提取總蛋白，以考馬斯亮藍法（Bradford 法）測定蛋白濃度，調整濃度后每孔加入 4 μg 樣品上樣，行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）并轉印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，以 4% 牛血清白蛋白液（BSA 液）封閉 2 h，PBS 漂洗后脫脂，再分別加入兔抗人 ECM1 單克隆一抗、兔抗人 Col Ⅰ單克隆一抗、兔抗人 α-SMA 單克隆一抗、兔抗人 MMP-2 單克隆一抗、兔抗人 TIMP-1單克隆一抗及 GAPDH 一抗（1∶2 000），4 ℃ 孵育過夜，之后以 TBST 溶液沖洗 3 次（15 min/次），再加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG 二抗（1∶2 000），37 ℃ 孵育 1 h，再次以 TBST 溶液洗滌 3 次（15 min/次），ECL 試劑盒顯影后，底片在暗室下以掃描儀透掃，膠片晾干保存后用 Image J 軟件對結果進行灰度半定量分析[11]。
1.3 隨訪
所選病例均進行定期隨訪，隨訪方法主要有電話隨訪、門診隨訪、定期來院復查隨訪、上門隨訪、微信隨訪、依托醫院信息化隨訪平臺等方式。隨訪內容主要為患者治療效果、病情變化、恢復情況、腫瘤有無復發及復發時間，以及目前有無新發癥狀、有無藥物不良反應等，并同時指導患者用藥、復診時間等。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 21.0 軟件對數據進行分析。定量資料采用成組 t 檢驗或單因素方差分析進行比較；計數資料以例表示，組間比較采用配對或成組 χ 2 檢驗。采用 Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，生存曲線比較采用 log-rank 檢驗，采用 Cox 比例風險回歸模型篩選預后的危險因素。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 qRT-PCR 法檢測 Hsa-miR-29c 的轉染情況
qRT-PCR 結果表明，本研究成功構建了穩定表達 Hsa-miR-29c 的 MKN28 細胞及 MKN45 細胞，MKN28 細胞及 MKN45 細胞中，轉染組細胞內 Hsa-miR-29c 的表達水平均高于同類型細胞的陰性對照組（P<0.05），見圖 1a。
圖1
示 MKN28 細胞及 MKN45 細胞的轉染效果，轉染組和陰性對照組細胞的增殖抑制率、克隆能力以及細胞外基質信號通路相關蛋白的半定量結果和電泳結果
a：轉染后 MKN28 細胞及 MKN45 細胞內 Hsa-miR-29c 的表達水平均高于對應細胞的陰性對照組；b 和 c：轉染組和陰性對照組的 MKN28 細胞（b）和 MKN45 細胞（c）的增殖抑制率結果；d–g：陰性對照組 MKN28 細胞（d）、轉染組 MKN28 細胞（e）、陰性對照組 MKN45 細胞（f）和轉染組 MKN45 細胞（g）克隆實驗結果；h：轉染組和陰性對照組 MKN28 細胞和 MKN45 細胞的細胞克隆數；i 和 j：MKN28 細胞（i）和 MKN45 細胞（j）的細胞外基質信號通路相關蛋白的半定量結果；k 和 l：MKN28 細胞（k）和 MKN45 細胞（l）的細胞外基質信號通路相關蛋白的電泳結果；*表示
2.2 Hsa-miR-29c 對 MKN28 細胞、MKN45 細胞增殖及克隆的影響
CCK-8 法及平板克隆實驗結果顯示，與同種類型細胞的陰性對照組比較，轉染組 MKN28、MKN45 細胞的增殖抑制率較高，細胞克隆數較低，差異均有統計學意義（P<0.05），見圖 1b–1h。
2.3 細胞中細胞外基質信號通路相關蛋白的表達結果
Western blot 法結果顯示，轉染組 MKN28 細胞中 Col Ⅰ和 TIMP-1 的相對表達水平均高于陰性對照組，而 ECM1、α-SMA 和 MMP-2 的相對表達水平均低于陰性對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）；轉染組 MKN45 細胞中的表達情況與此相同，差異亦有統計學意義（P<0.05），見圖 1i–1l。
2.4 qRT-PCR 檢測胃癌組織及其癌旁組織中Hsa-miR-29c 的表達水平
胃癌組織中 Hsa-miR-29c 的表達水平低于癌旁組織，差異有統計學意義（t=9.583，P=0.001）。見圖 2a。
圖2
示胃癌組織及癌旁組織中 Hsa-miR-29c 的表達情況，以及 Hsa-miR-29c 陰性表達與陽性表達胃癌患者的生存曲線
a：胃癌組織中 Hsa-miR-29c 的表達低于癌旁組織，*表示
2.5 Hsa-miR-29c 表達與胃癌臨床病理學特征的相關性分析
胃癌組織中 Hsa-miR-29c 的表達與年齡、性別及病理學類型均無關（P>0.05），而與腫瘤直徑、TNM 分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移有關（P<0.05），腫瘤直徑≥4 cm、TNM 分期為 Ⅲ 期、分化程度為低分化、有淋巴結轉移者的 Hsa-miR-29c表達陽性率相應較腫瘤直徑<4 cm、TNM 分期 0～Ⅱ 期、高中分化和無淋巴結轉移者的陽性表達率較低。見表 2。
表2
Hsa-miR-29c 在胃癌組織中的表達與患者臨床病理學特征間的關系（例）
2.6 Hsa-miR-29c 表達與胃癌患者預后的相關性分析
Hsa-miR-29c 陰性表達胃癌組患者的中位生存期為 14 個月，短于陽性表達者（34 個月），差異有統計學意義（P=0.001），見圖 2b；進一步進行 Cox 比例風險回歸模型，結果顯示，Hsa-miR-29c 表達和腫瘤淋巴結轉移是胃癌預后的獨立預測因子（P<0.05），見表 3。
表3
單因素及多因素生存分析結果
3 討論
腫瘤的發生發展是遺傳、環境等多因素相互作用的結果[14]，其中，表觀遺傳改變主要是通過非編碼 miRNA、組蛋白修飾及 DNA 甲基化進行調節[15]。miRNA 是一種內源性、保守穩定的單鏈非編碼小 RNA，長度在 18～25 nt，廣泛存在于動物、植物乃至病毒等多種生物體中[16]，可通過與靶基因 3′ 端非編碼區 mRNA（3′ UTR）結合互補而抑制 mRNA 轉錄，調控多種基因及蛋白表達，在腫瘤中發揮重要作用，是研究的熱點[17]。
作為 miRNA 成員之一，miR-29 家族包括 miR-29a、miR-29b 及 miR-29c[18]。其中，Hsa-miR-29c 定位于人染色體 lq32.2，緊鄰 CD46 基因，且只有一個轉錄本，在核酸酶 Dicer 作用下，它可分為兩條成熟的 miRNA，即 Hsa-miR-29c-3p 和 Hsa-miR-29c-5p[19]。Hsa-miR-29c 最早由 Dostie 等[20]在人神經元細胞中發現，隨后的相關研究[21]顯示，Hsa-miR-29c 參與了人體內細胞分化、增殖、凋亡等多種生物學過程，調控著腫瘤的發生發展及預后。如 Liu 等[22]研究發現，Hsa-miR-29c 在鼻咽癌中的表達顯著下調，且與鼻咽癌患者的預后有關。Zhao 等[23]報道顯示，Hsa-miR-29c 在套細胞淋巴瘤中的表達水平顯著下降，可抑制周期素依賴性激酶 6（CDK6）mRNA 及其蛋白的表達，影響腫瘤進展。國外 Vidal 等[24]研究發現，Hsa-miR-29c 可抑制胃癌細胞增殖，促進其凋亡。諸多研究提示其可能是一種潛在的抑癌基因。目前國內關于 Hsa-miR-29c 在胃癌中作用機制的相關研究鮮有報道，因此本研究初步探討了其在胃癌中的表達及其可能的作用機制。
本研究通過慢病毒轉染法成功構建了穩定過表達 Hsa-miR-29c 的高分化胃癌細胞株 MKN28 及低分化胃癌細胞株 MKN45，并采用 qRT-PCR 法檢測發現，轉染組細胞內 Hsa-miR-29c 的表達量高于陰性對照組，進一步驗證了轉染效率。CCK-8 法及平板克隆實驗結果表明，轉染組 MKN28 細胞及 MKN45 細胞的增殖數及克隆形成數顯著低于同類型細胞的陰性對照組，這提示過表達 Hsa-miR-29c可抑制胃癌 MKN28 及 MKN45 細胞的增殖。為了初步探究其可能存在的作用機制，筆者隨后又進行了相關實驗。
有研究[25]表明，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是由細胞合成后分布于細胞之間或細胞表面的大分子物質，由細胞間基質和基底膜（basement membrane，BM）組成，是阻止細胞轉移的重要屏障。其主要成分包括膠原蛋白、纖維連接蛋白（fibronectin，FN）、彈性蛋白等[26]。其中膠原蛋白為基本骨架[27]，在細胞表面形成纖維網狀結構，以維持細胞穩定性。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）[28]是內源性蛋白水解酶家族成員之一，其主要作用是降解 ECM，破壞 BM，進而促進細胞侵襲及轉移，可分為 5 類。其中 MMP-2 屬于Ⅳ型膠原酶類，富有侵襲性偽足，可使細胞向周圍組織浸潤，促進癌細胞侵襲和轉移。TIMP-1 是 MMP 的特異性抑制劑，可顯著抑制 ECM 降解，進而抑制腫瘤細胞轉移[29]。ECM1 最早是從鼠成骨基質細胞系 MN7 中分離出來的一種分泌性糖蛋白[30]，可通過整合素（integrins）與細胞直接作用，激活磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱為 Akt）信號通路，進而促進腫瘤發生。α-SMA 是一種具有收縮功能的微絲蛋白[31]，參與合成多種細胞外基質成分，促進細胞的分裂、爬行運動、轉移等過程。本研究通過 Western blot 法檢測了細胞內 ECM 相關蛋白的表達情況，發現轉染后 MKN28 細胞及 MKN45 細胞內的 Col Ⅰ及 TIMP-1 蛋白的表達量均明顯升高，而 ECM1、α-SMA 和 MMP-2 蛋白的表達量均明顯降低，結合 ECM 相關蛋白的生物學特點、以及上述 CCK-8 法及平板克隆實驗結果，筆者推測，過表達 Hsa-miR-29c 抑制胃癌MKN28 及 MKN45 細胞增殖可能是通過調控 ECM 信號通路相關蛋白表達而實現的。這與國內外的研究[32-38]結果一致，提示其在胃癌中是一種抑癌基因。此外，陳點點等[39]的研究報道顯示，Hsa-miR-29c的作用機制可能與 PI3K/Akt 信號通路有關。而 ECM1 蛋白正是通過激活 PI3K/Akt 信號通路發揮作用的，因此本研究也進一步驗證了陳點點等[39]的研究結果。
隨后作者通過 qRT-PCR 法檢測發現，胃癌組織中 Hsa-miR-29c 的表達量低于癌旁組織，同時分析其與患者臨床病理學特征間的相關性后發現，Hsa-miR-29c 的表達水平與胃癌患者年齡、性別及病理學類型無關，而與腫瘤直徑、TNM 分期、腫瘤分化程度及淋巴結轉移有關，腫瘤直徑越大、TNM 分期越晚、腫瘤分化程度越低，或有淋巴結轉移者，Hsa-miR-29c 表達陽性率越低。進一步的 Cox 比例風險回歸模型結果顯示，Hsa-miR-29c 表達情況和腫瘤淋巴結轉移情況是胃癌預后獨立的預測因子。其中，Hsa-miR-29c 陽性表達患者的生存期長于陰性表達者（14 個月比 34 個月）。結合上述系列實驗研究，筆者分析，Hsa-miR-29c 在胃癌中是一種抑癌基因，且呈低表達水平時，對 ECM 信號通路抑制作用弱，易促進腫瘤發生，以及癌細胞增殖、侵襲和轉移，因此 Hsa-miR-29c 陰性表達患者的預后差，生存期短，同時這也提示，臨床診治中檢測 Hsa-miR-29c 的表達水平有助于判斷胃癌患者的預后。
綜上所述，本研究初步證實，Hsa-miR-29c 在胃癌中的表達下調，是一種抑癌基因，參與了胃癌的發展過程，且與患者臨床病理學特征及預后密切相關，過表達 Hsa-miR-29c 可顯著抑制胃癌細胞增殖，機制可能與 ECM 信號通路有關，有望成為胃癌新的診治靶點。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：孫生安負責本課題的實驗設計、實驗操作、標本取材及制作、數據統計等；白明輝和王云帥協助完成相關實驗及數據的收集和整理；韓保衛負責文章的校對及修改。
倫理聲明：本研究已通過鄭州大學附屬洛陽中心醫院的倫理審核批準（批文編號：2014-12-17）。
