引用本文： 劉軍, 胡洪生, 吳紅偉, 付海峰, 魏廣民, 胡偉, 孫少華. VEGF 在門靜脈高壓患者術后門靜脈系統血栓形成過程中的表達及意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(1): 63-66. doi: 10.7507/1007-9424.202004072 復制
肝硬變是我國常見疾病，而門靜脈高壓癥與肝硬變最嚴重的并發癥有關，包括食管胃底靜脈曲張破裂出血、肝性腦病、腹水等[1]。盡管藥物和內鏡治療取得了較好的療效，但仍無法替代手術治療的作用[2]。脾切除+賁門周圍血管離斷術是治療肝硬變門靜脈高壓的常見手術方式，但其術后門靜脈系統血栓（portal vein system thrombosis，PVST）的發生率較高[3-5]。PVST 可能引起門靜脈壓力再次升高，導致靜脈曲張出血，還可能引起肝內缺血，誘發急性肝衰竭和肝性腦病，嚴重威脅患者生命。腸系膜上靜脈血栓形成還能導致小腸壞死等嚴重并發癥[6-7]。盡管國內外關于 PVST 的研究已非常多，但其機制并未完全闡明。VEGF 屬于血小板源生長因子超家族重要成員，可由血管內皮細胞等多種細胞分泌，已有研究證實，VEGF 能夠刺激內皮細胞進而促進血小板的黏附和活化[8]，而血小板的黏附聚集是激發凝血和血栓形成的關鍵性因素。本研究通過免疫組織化學方法觀察門靜脈高壓癥患者術后脾靜脈及脾臟組織中 VEGF 的表達部位及水平，同時檢測血清 VEGF 水平，初步探討 VEGF 在門靜脈高壓術后 PVST 形成過程中的作用。
1 資料與方法
1.1 研究對象
納入研究的患者為 2014 年 1 月至 2018 年 12 月期間在湖北醫藥學院附屬東風醫院就診的肝硬變門靜脈高壓患者，根據納入標準及排除標準，共有 146 例患者納入研究。
1.2 納入標準及排除標準
1.2.1 納入標準
明確診斷為肝硬變并出現食管胃底靜脈曲張、腹水、脾腫大、脾功能亢進等臨床表現而診斷為門靜脈高壓癥，行脾切除+賁門周圍血管離斷術的患者；患者或委托人知曉研究方案并自愿提供術前及術后血清標本、自愿簽署知情同意書。
1.2.2 排除標準
術前肝功能為 Child C 級；術前合并 PVST；合并肝臟惡性腫瘤或其他臟器惡性腫瘤。
1.3 研究方法
1.3.1 血清標本的采集與處理
所有納入研究患者在術前（1 周內）及術后第 7 天分別于清晨空腹采肘靜脈血 5 mL，經處理后取上清采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定 VEGF 水平。血清 VEGF 測定采用 Human VEGF-A 預包被 ELISA 試劑盒，嚴格按照產品說明書所列實驗步驟進行。具體步驟：根據實驗孔數量，確定所需的板條數目→加樣，100 μL/孔加入樣本或標準品→室溫孵育 2 h→洗板→加生物素標記的抗體→室溫孵育 2 h→洗板→加親和素-HRP→室溫孵育 20 min→洗板→加 TMB 顯色液→室溫避光孵育 15 min→加終止液終止反應→在檢測波長 450 nm 處讀取吸光度值（A 值）→計算各樣本 VEGF 水平。實驗過程中血標本采集經醫院倫理委員會審批。
1.3.2 脾靜脈及脾臟標本的采集與處理
收集手術過程中切除的脾靜脈及脾臟標本，肝硬變門靜脈高壓癥脾臟切除術中，待脾臟取出后，在脾門處取 5 mm×2 mm×1 mm 大小脾靜脈組織，在脾下極取 5 mm×5 mm×5 mm 大小脾臟組織，甲醛溶液固定。脾靜脈及脾臟標本采用免疫組織化學方法檢測 VEGF 表達部位及水平，實驗按照免疫組織化學二步法常規染色步驟進行。具體步驟：脫蠟，水化組織切片→3% 過氧化氫孵育 4 min 以阻斷內源性過氧化物酶→PBS 洗 1 次，3 min→滴加適當稀釋的一抗 VEGF 單克隆抗體（1∶100），4 ℃ 孵育 24 h→棄一抗，用 PBS 洗 3 次→滴加二抗 IgG（1∶200），置室溫下孵育 20 min→PBS 洗 3 次→二氨基聯苯胺（DAB）顯色，光鏡觀察顯色滿意后自來水沖洗 5 min 終止顯色→常規復染，脫水，封片→用 PBS 液替代一抗進行陰性對照染色。VEGF 陽性細胞為胞漿呈黃色至棕黃色。圖像分析在顯微鏡下進行，每張切片于低倍鏡下選取 5 個視野，然后在高倍鏡下計數陽性細胞數。染色結果以染色指數評估，染色指數=染色范圍評分×染色強度評分。染色范圍以染色細胞占細胞總數百分比計算：≤10% 為 0 分，11%～25% 為1 分，26%～50% 為 2 分，51%～75% 為 3 分，≥76%為 4 分；染色強度評分：陰性為 0 分，弱陽性為 1 分，陽性為 2 分，強陽性為 3 分。
1.3.3 PVST 的診斷
所有入選患者于術后第 7 天時行肝膽胰脾超聲檢查，確定是否存在 PVST，依據是否形成 PVST 分為血栓形成組和非血栓形成組。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件進行統計分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（
±s）表示，2 組間的比較采用 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
根據納入標準及排除標準，共有 146 例肝硬變門靜脈高壓患者患者納入研究。其中男 95 例，女 51 例；年齡 34～70 歲，平均 50.7 歲。手術方式為脾切除+賁門周圍血管離斷術，其中 39 例行腹腔鏡手術，73 例行開腹手術。在術后第 7 天時行腹部超聲檢查，共有 31 例患者形成 PVST，PVST 發生率為 21.2%（31/146）。將此 31 例患者納入血栓形成組，剩余 115 例患者為非血栓形成組。
2.2 2 組患者血清 VEGF 水平檢測結果
根據標準品濃度在 450 nm 處所讀得的A 值做出標準曲線，再根據標準曲線計算出各個樣本中 VEGF 水平。結果：血栓形成組和非血栓形成組術前血清 VEGF 水平雖有差異，但差異無統計學意義（P>0.05）；術后血栓形成組血清 VEGF 水平顯著高于非血栓形成組（P<0.05）。詳見表 1。
表1
2 組患者手術前后血清 VEGF 水平檢測結果（
，ng/L）
2.3 脾靜脈及脾臟組織中 VEGF 表達檢測結果
在脾靜脈中，VEGF 主要定位于脾靜脈血管內皮細胞和血管平滑肌細胞胞漿和胞核，以胞漿為主；在脾臟中，VEGF 主要在脾臟內濾泡旁血管、髓索血管和小梁血管壁的內皮細胞和血管平滑肌細胞胞漿內表達。2 組患者脾靜脈細胞胞漿均被染色為黃色到棕黃色，呈片狀或團塊狀分布，與非血栓形成組相比，血栓形成組染色更深，陽性細胞數更多，染色指數更高，差異有統計學意義（P<0.05），見圖 1a、1b 和表 2。2 組患者脾臟細胞胞漿均被染成黃色到棕黃色，呈片狀或團塊狀分布，與非血栓形成組相比，血栓形成組染色更深，陽性細胞數更多，染色指數更高，差異有統計學意義（P<0.05），見圖 1c、1d 和表 2。
圖1
示 2 組患者脾靜脈及脾臟組織中 VEGF 表達檢測結果（免疫組織化學染色 ×200）
a：血栓形成組脾靜脈壁 VEGF 表達；b：非血栓形成組脾靜脈壁 VEGF 表達；c：血栓形成組脾臟 VEGF 表達；d：非血栓形成組脾臟 VEGF 表達
表2
2 組患者脾靜脈及脾臟組織中 VEGF 指數檢測結果（
）
3 討論
眾所周知，靜脈血栓形成需要血流淤滯、內皮細胞損傷和血液高凝狀態 3 個條件[9]，其中內皮細胞損傷則是關鍵因素。正常血管壁的內皮通過釋放不同的抗凝和抗血小板因子，如一氧化氮和前列腺素 PGI2 等來防止血栓形成，當血管內皮細胞損傷后，血小板被募集到裸露的膠原蛋白表面，血小板迅速黏附并活化，黏附的血小板釋放活性物質，導致更多的血小板黏附和聚集，并促進血小板和內皮細胞的促凝活性，最終形成血栓[10]。因此血小板在血栓形成過程中發揮了關鍵作用[11]。
VEGF 屬于血小板源生長因子超家族重要成員，可由血管內皮細胞等多種細胞分泌，具有高度生物活性，主要作用于血管內皮細胞，具有增加微血管通透性，特異性地與血管內皮細胞受體結合，促進內皮細胞增殖、促血管生成等作用[12]。VEGF 已被證實與多種疾病的發生、發展有關[13]。
VEGF 與血小板關系密切，1997 年，M?hle 等[14]發現在體外凝血酶的刺激下血小板能夠釋放 VEGF，而后 O’Byrne 等[15]在腎癌患者中證實，血清 VEGF 含量與血小板計數呈正相關，并且血清 VEGF 含量高及血小板計數高的患者往往預后不良。Kim 等[16]在研究肝癌時也得到相似的結論，并發現肝癌合并有門靜脈血栓的患者，其血清 VEGF 濃度與血小板計數的比值明顯高于無門靜脈血栓的患者。
本研究發現，肝硬變門靜脈高壓癥患者行手術治療后，術后血栓形成組血清 VEGF 水平明顯高于非血栓形成組，血栓形成組脾靜脈及脾臟組織中 VEGF 表達強于非血栓形成組，表明 VEGF 可能參與了 PVST 的形成過程。分析其機制可能為：肝硬變門靜脈高壓患者行脾切除術后，失去了脾臟對衰老及功能不全的血小板的破壞及吞噬作用，常常會出現血小板數量升高[17]，脾靜脈呈一盲端，血流緩慢，局部血液呈高凝狀態下易形成血栓；手術破壞了門靜脈系統的解剖結構，損傷了門靜脈系統的血管壁，改變了門靜脈系統的血流方向，術中鉗夾、擠壓等操作造成門靜脈系統血管內膜損傷，部分內皮細胞脫離和膠原暴露會導致血小板黏附、活化[18]，血小板處于高度激活狀態，被激活的血小板會釋放大量的 VEGF[19]，而 VEGF 刺激內皮細胞進而進一步促進血小板的黏附和活化[8]，血小板的黏附聚集是激發凝血和血栓形成的關鍵因素[20]，活化的血小板與中性粒細胞和單核細胞黏附與聚集，促進血液中纖維素的形成，并募集其他血細胞形成血凝塊，導致門靜脈系統血管內血栓形成。
VEGF 除參與血栓的形成，還可能通過促進血栓機化和促進血管內膜的修復，從而在血栓的溶解與再通過程中發揮重要作用[21]。有學者[9]認為，血栓溶解過程與傷口愈合是類似的：首先是白細胞的募集，大量中性粒細胞侵入血栓內，后被單核細胞所替代，并逐漸在血栓內形成新的毛細血管，多種與血管新生相關的細胞因子起重要調節作用。VEGF 作為血管生成的基礎調控因子，在未來 VEGF 基因治療血管生成相關疾病方面有著更為廣闊的前景[22]。
重要聲明
利益沖突聲明：所有作者均無利益沖突。
作者貢獻聲明：劉軍負責實驗設計、實施實驗、數據收集與整理、統計分析及文章撰寫；胡洪生負責實驗設計、指導實驗實施、文章修改；吳紅偉、付海峰、魏廣民和胡偉負責實施實驗、標本收集、統計分析等；孫少華指導實驗設計、經費等支持。
倫理聲明：經醫院倫理委員會審批，符合倫理學要求。
肝硬變是我國常見疾病，而門靜脈高壓癥與肝硬變最嚴重的并發癥有關，包括食管胃底靜脈曲張破裂出血、肝性腦病、腹水等[1]。盡管藥物和內鏡治療取得了較好的療效，但仍無法替代手術治療的作用[2]。脾切除+賁門周圍血管離斷術是治療肝硬變門靜脈高壓的常見手術方式，但其術后門靜脈系統血栓（portal vein system thrombosis，PVST）的發生率較高[3-5]。PVST 可能引起門靜脈壓力再次升高，導致靜脈曲張出血，還可能引起肝內缺血，誘發急性肝衰竭和肝性腦病，嚴重威脅患者生命。腸系膜上靜脈血栓形成還能導致小腸壞死等嚴重并發癥[6-7]。盡管國內外關于 PVST 的研究已非常多，但其機制并未完全闡明。VEGF 屬于血小板源生長因子超家族重要成員，可由血管內皮細胞等多種細胞分泌，已有研究證實，VEGF 能夠刺激內皮細胞進而促進血小板的黏附和活化[8]，而血小板的黏附聚集是激發凝血和血栓形成的關鍵性因素。本研究通過免疫組織化學方法觀察門靜脈高壓癥患者術后脾靜脈及脾臟組織中 VEGF 的表達部位及水平，同時檢測血清 VEGF 水平，初步探討 VEGF 在門靜脈高壓術后 PVST 形成過程中的作用。
1 資料與方法
1.1 研究對象
納入研究的患者為 2014 年 1 月至 2018 年 12 月期間在湖北醫藥學院附屬東風醫院就診的肝硬變門靜脈高壓患者，根據納入標準及排除標準，共有 146 例患者納入研究。
1.2 納入標準及排除標準
1.2.1 納入標準
明確診斷為肝硬變并出現食管胃底靜脈曲張、腹水、脾腫大、脾功能亢進等臨床表現而診斷為門靜脈高壓癥，行脾切除+賁門周圍血管離斷術的患者；患者或委托人知曉研究方案并自愿提供術前及術后血清標本、自愿簽署知情同意書。
1.2.2 排除標準
術前肝功能為 Child C 級；術前合并 PVST；合并肝臟惡性腫瘤或其他臟器惡性腫瘤。
1.3 研究方法
1.3.1 血清標本的采集與處理
所有納入研究患者在術前（1 周內）及術后第 7 天分別于清晨空腹采肘靜脈血 5 mL，經處理后取上清采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定 VEGF 水平。血清 VEGF 測定采用 Human VEGF-A 預包被 ELISA 試劑盒，嚴格按照產品說明書所列實驗步驟進行。具體步驟：根據實驗孔數量，確定所需的板條數目→加樣，100 μL/孔加入樣本或標準品→室溫孵育 2 h→洗板→加生物素標記的抗體→室溫孵育 2 h→洗板→加親和素-HRP→室溫孵育 20 min→洗板→加 TMB 顯色液→室溫避光孵育 15 min→加終止液終止反應→在檢測波長 450 nm 處讀取吸光度值（A 值）→計算各樣本 VEGF 水平。實驗過程中血標本采集經醫院倫理委員會審批。
1.3.2 脾靜脈及脾臟標本的采集與處理
收集手術過程中切除的脾靜脈及脾臟標本，肝硬變門靜脈高壓癥脾臟切除術中，待脾臟取出后，在脾門處取 5 mm×2 mm×1 mm 大小脾靜脈組織，在脾下極取 5 mm×5 mm×5 mm 大小脾臟組織，甲醛溶液固定。脾靜脈及脾臟標本采用免疫組織化學方法檢測 VEGF 表達部位及水平，實驗按照免疫組織化學二步法常規染色步驟進行。具體步驟：脫蠟，水化組織切片→3% 過氧化氫孵育 4 min 以阻斷內源性過氧化物酶→PBS 洗 1 次，3 min→滴加適當稀釋的一抗 VEGF 單克隆抗體（1∶100），4 ℃ 孵育 24 h→棄一抗，用 PBS 洗 3 次→滴加二抗 IgG（1∶200），置室溫下孵育 20 min→PBS 洗 3 次→二氨基聯苯胺（DAB）顯色，光鏡觀察顯色滿意后自來水沖洗 5 min 終止顯色→常規復染，脫水，封片→用 PBS 液替代一抗進行陰性對照染色。VEGF 陽性細胞為胞漿呈黃色至棕黃色。圖像分析在顯微鏡下進行，每張切片于低倍鏡下選取 5 個視野，然后在高倍鏡下計數陽性細胞數。染色結果以染色指數評估，染色指數=染色范圍評分×染色強度評分。染色范圍以染色細胞占細胞總數百分比計算：≤10% 為 0 分，11%～25% 為1 分，26%～50% 為 2 分，51%～75% 為 3 分，≥76%為 4 分；染色強度評分：陰性為 0 分，弱陽性為 1 分，陽性為 2 分，強陽性為 3 分。
1.3.3 PVST 的診斷
所有入選患者于術后第 7 天時行肝膽胰脾超聲檢查，確定是否存在 PVST，依據是否形成 PVST 分為血栓形成組和非血栓形成組。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件進行統計分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，2 組間的比較采用 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
根據納入標準及排除標準，共有 146 例肝硬變門靜脈高壓患者患者納入研究。其中男 95 例，女 51 例；年齡 34～70 歲，平均 50.7 歲。手術方式為脾切除+賁門周圍血管離斷術，其中 39 例行腹腔鏡手術，73 例行開腹手術。在術后第 7 天時行腹部超聲檢查，共有 31 例患者形成 PVST，PVST 發生率為 21.2%（31/146）。將此 31 例患者納入血栓形成組，剩余 115 例患者為非血栓形成組。
2.2 2 組患者血清 VEGF 水平檢測結果
根據標準品濃度在 450 nm 處所讀得的A 值做出標準曲線，再根據標準曲線計算出各個樣本中 VEGF 水平。結果：血栓形成組和非血栓形成組術前血清 VEGF 水平雖有差異，但差異無統計學意義（P>0.05）；術后血栓形成組血清 VEGF 水平顯著高于非血栓形成組（P<0.05）。詳見表 1。
表1
2 組患者手術前后血清 VEGF 水平檢測結果（，ng/L）
2.3 脾靜脈及脾臟組織中 VEGF 表達檢測結果
在脾靜脈中，VEGF 主要定位于脾靜脈血管內皮細胞和血管平滑肌細胞胞漿和胞核，以胞漿為主；在脾臟中，VEGF 主要在脾臟內濾泡旁血管、髓索血管和小梁血管壁的內皮細胞和血管平滑肌細胞胞漿內表達。2 組患者脾靜脈細胞胞漿均被染色為黃色到棕黃色，呈片狀或團塊狀分布，與非血栓形成組相比，血栓形成組染色更深，陽性細胞數更多，染色指數更高，差異有統計學意義（P<0.05），見圖 1a、1b 和表 2。2 組患者脾臟細胞胞漿均被染成黃色到棕黃色，呈片狀或團塊狀分布，與非血栓形成組相比，血栓形成組染色更深，陽性細胞數更多，染色指數更高，差異有統計學意義（P<0.05），見圖 1c、1d 和表 2。
圖1
示 2 組患者脾靜脈及脾臟組織中 VEGF 表達檢測結果（免疫組織化學染色 ×200）
a：血栓形成組脾靜脈壁 VEGF 表達；b：非血栓形成組脾靜脈壁 VEGF 表達；c：血栓形成組脾臟 VEGF 表達；d：非血栓形成組脾臟 VEGF 表達
表2
2 組患者脾靜脈及脾臟組織中 VEGF 指數檢測結果（）
3 討論
眾所周知，靜脈血栓形成需要血流淤滯、內皮細胞損傷和血液高凝狀態 3 個條件[9]，其中內皮細胞損傷則是關鍵因素。正常血管壁的內皮通過釋放不同的抗凝和抗血小板因子，如一氧化氮和前列腺素 PGI2 等來防止血栓形成，當血管內皮細胞損傷后，血小板被募集到裸露的膠原蛋白表面，血小板迅速黏附并活化，黏附的血小板釋放活性物質，導致更多的血小板黏附和聚集，并促進血小板和內皮細胞的促凝活性，最終形成血栓[10]。因此血小板在血栓形成過程中發揮了關鍵作用[11]。
VEGF 屬于血小板源生長因子超家族重要成員，可由血管內皮細胞等多種細胞分泌，具有高度生物活性，主要作用于血管內皮細胞，具有增加微血管通透性，特異性地與血管內皮細胞受體結合，促進內皮細胞增殖、促血管生成等作用[12]。VEGF 已被證實與多種疾病的發生、發展有關[13]。
VEGF 與血小板關系密切，1997 年，M?hle 等[14]發現在體外凝血酶的刺激下血小板能夠釋放 VEGF，而后 O’Byrne 等[15]在腎癌患者中證實，血清 VEGF 含量與血小板計數呈正相關，并且血清 VEGF 含量高及血小板計數高的患者往往預后不良。Kim 等[16]在研究肝癌時也得到相似的結論，并發現肝癌合并有門靜脈血栓的患者，其血清 VEGF 濃度與血小板計數的比值明顯高于無門靜脈血栓的患者。
本研究發現，肝硬變門靜脈高壓癥患者行手術治療后，術后血栓形成組血清 VEGF 水平明顯高于非血栓形成組，血栓形成組脾靜脈及脾臟組織中 VEGF 表達強于非血栓形成組，表明 VEGF 可能參與了 PVST 的形成過程。分析其機制可能為：肝硬變門靜脈高壓患者行脾切除術后，失去了脾臟對衰老及功能不全的血小板的破壞及吞噬作用，常常會出現血小板數量升高[17]，脾靜脈呈一盲端，血流緩慢，局部血液呈高凝狀態下易形成血栓；手術破壞了門靜脈系統的解剖結構，損傷了門靜脈系統的血管壁，改變了門靜脈系統的血流方向，術中鉗夾、擠壓等操作造成門靜脈系統血管內膜損傷，部分內皮細胞脫離和膠原暴露會導致血小板黏附、活化[18]，血小板處于高度激活狀態，被激活的血小板會釋放大量的 VEGF[19]，而 VEGF 刺激內皮細胞進而進一步促進血小板的黏附和活化[8]，血小板的黏附聚集是激發凝血和血栓形成的關鍵因素[20]，活化的血小板與中性粒細胞和單核細胞黏附與聚集，促進血液中纖維素的形成，并募集其他血細胞形成血凝塊，導致門靜脈系統血管內血栓形成。
VEGF 除參與血栓的形成，還可能通過促進血栓機化和促進血管內膜的修復，從而在血栓的溶解與再通過程中發揮重要作用[21]。有學者[9]認為，血栓溶解過程與傷口愈合是類似的：首先是白細胞的募集，大量中性粒細胞侵入血栓內，后被單核細胞所替代，并逐漸在血栓內形成新的毛細血管，多種與血管新生相關的細胞因子起重要調節作用。VEGF 作為血管生成的基礎調控因子，在未來 VEGF 基因治療血管生成相關疾病方面有著更為廣闊的前景[22]。
重要聲明
利益沖突聲明：所有作者均無利益沖突。
作者貢獻聲明：劉軍負責實驗設計、實施實驗、數據收集與整理、統計分析及文章撰寫；胡洪生負責實驗設計、指導實驗實施、文章修改；吳紅偉、付海峰、魏廣民和胡偉負責實施實驗、標本收集、統計分析等；孫少華指導實驗設計、經費等支持。
倫理聲明：經醫院倫理委員會審批，符合倫理學要求。
