引用本文： 馬宇, 曾翠芳, 鄒秀和, 雷建勇, 鄭洵, 李志輝, 龔日祥, 朱精強, 魏濤. 甲狀腺全切及雙側中央區淋巴結清掃后創腔運用銅綠假單胞菌注射液局部噴灑對喉返神經的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(12): 1496-1500. doi: 10.7507/1007-9424.202004004 復制
甲狀腺手術中喉返神經和甲狀旁腺的安全一直是外科醫生關注的焦點，這兩種組織器官一旦出現永久性損傷，將顯著降低患者的生活質量。精細化解剖技術已經將這兩種組織器官的損傷降至極低的發生概率[1]。銅綠假單胞菌注射液（Pseudomonas aeruginosa ianjection，PAI）引起的無菌性炎癥反應能有效治療甲狀腺癌頸側區淋巴結清掃術后的乳糜漏[2]，并能有效減少術后頸側區引流量，縮短住院日，且不增加并發癥。本研究旨在探討銅綠假單胞菌注射液對暴露的喉返神經和甲狀旁腺是否造成損傷。
1 資料與方法
1.1 研究對象納入及排除標準
納入標準：甲狀腺乳頭狀癌癌灶直徑大于 1 cm，或雙葉癌，或一側腺葉癌灶合并對側腺葉結節不排除惡性病變；術前超聲或 CT 評估頸側區未發生淋巴結轉移，擬行甲狀腺全切+雙側中央區淋巴結清掃手術。排除標準：淋巴結轉移超過中央區、僅行單側中央區淋巴結清掃、曾行甲狀腺手術以及合并其他嚴重疾病者均排除。
1.2 研究對象
2016 年 3 月至 2017 年 10 月期間在四川大學華西醫院上錦醫院甲狀腺外科進行手術治療的甲狀腺乳頭狀癌患者共 223 例，其中 97 例患者淋巴結轉移超過中央區，13 例患者曾經接受過甲狀腺外科手術，根據上述納入及排除標準，有 113 例患者被納入研究，所有患者均為同一醫生手術，術中使用銅綠假單胞菌注射液局部噴灑（局部噴灑組）58 例，未使用（對照組）55 例。2 組患者的基線資料比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性（表 1）。
表1
2 組患者的基線資料比較
1.3 治療方法
2 組患者術前均行甲狀腺彩超和甲狀腺功能檢查，并經彩超引導下甲狀腺結節細針穿刺病理活檢證實為甲狀腺乳頭狀癌，頸部淋巴結彩超和頸部增強 CT 檢查均未發現頸側區存在可疑轉移淋巴結。 2 組手術方式均為甲狀腺全切及雙側中央區淋巴結清掃（因患者及家屬要求或甲狀腺癌侵出包膜），術畢局部噴灑組中央區創腔均勻噴灑銅綠假單胞菌注射液 1 mL（含菌量 1.6×109/mL，北京萬特爾生物制藥有限公司），噴灑前后應用喉返神經監測儀探測喉返神經電位信號，對照組中央區未使用任何藥物，2 組患者創腔均留置 1 根 16 號血漿引流管（南通三利器械有限公司）。術后當 24 h 引流量低于 10 mL 即拔除引流管。
1.4 觀察指標
觀察 2 組患者術中喉返神經和迷走神經電位信號以及聲音嘶啞和甲狀旁腺功能低下的發生率，比較術后 2 組的引流量，乳糜漏、術后出血、感染及發熱發生情況以及術后住院時間。
1.5 統計學方法
所有數據均采用 SPSS 20.0 軟件進行統計學處理。計數資料用百分率表示，行 χ2 檢驗；計量資料符合正態分布用均數±標準差（
±s）表示，行 t 檢驗；不符合正態分布用中位數（M）表示，采用非參數檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 2 組患者喉返神經損傷情況比較
術中使用多功能神經監測儀（美敦力）在 1 mA 刺激電流下探測喉返神經和迷走神經的電位信號。 結果：局部噴灑組與對照組術畢至關閉切口前所測得的喉返神經電位信號和迷走神經電位信號差異均無統計學意義（P>0.05）。2 組術后均未發生臨時性和永久性聲音嘶啞（表 2）。
表2
2 組患者喉返神經及甲狀旁腺損傷情況比較
2.2 2 組患者甲狀旁腺損傷情況比較
局部噴灑組和對照組均有部分患者出現暫時性甲狀旁腺功能減退，但差異無統計學意義（P>0.05）。手術當天至術后第 2 天連續每日補充 10% 葡萄糖酸鈣 20 mL 后患者均未出現低鈣癥狀。術后 1 個月復查，2 組患者中發生暫時性甲狀旁腺功能減退癥患者的血清甲狀旁腺素恢復至正常水平，不需要長期補鈣。2 組患者均未發生永久性甲狀旁腺功能減退癥（表 2）。
2.3 2 組手術情況及術后其他并發癥比較
結果見表 3。由表 3 可見，局部噴灑組術后 24 h 引流量較對照組多，差異具有統計學意義（P=0.023）。局部噴灑組術后出現 2 例乳糜漏（3.6%），對照組術后無乳糜漏發生，但差異無統計學意義（P>0.05）。2 組患者在淋巴結清掃數目、術后總引流量、發熱及切口感染發生率、術后住院時間、術后疼痛評分和甲狀旁腺功能減退方面比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
表3
2 組患者手術情況及術后其他并發癥比較
3 討論
銅綠假單胞菌注射液是微生物學專家、中國菌毛學研究創始人—牟希亞教授應用生物工程技術培育的綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株經現代生物制藥技術精制而成，是具有雙向免疫調節及殺傷腫瘤細胞作用的治療用生物藥品。滅活銅綠假單胞菌菌液中含有豐富的菌毛能刺激機體 Toll 樣受體，激活人體免疫系統，從而達到抗腫瘤的效果[3-4]。
牟希亞于 1984 年建立起銅綠假單胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株（PA-MSHA 菌株） [5]。銅綠假單胞菌注射液是通過基因重組技術，經過減毒傳代、質粒 DNA 的提取與傳遞，并經過減毒、滅活、純化等生產工藝得到的一種周身布滿菌毛的生物制劑，其菌毛是一種糖蛋白類配體，黏附作用強[6]。該菌毛的末端能夠與甘露糖特異性結合，能阻斷與腫瘤生長和轉移相關的受體與其配體的結合，從而發揮抗腫瘤生長和轉移的作用[7]。最初，該藥物被設計應用于防治惡性腫瘤的復發轉移[4,8-9 ]。后續的研究發現，PA-MSHA 菌株的菌毛能有效激活免疫細胞的 Toll 樣受體（TLR），通過 TLR 誘導抗原提呈細胞（巨噬細胞和樹突狀細胞） 分化成熟，成熟的抗原提呈細胞進一步活化自然殺傷細胞（NK 細胞）和 T 細胞，并產生大量內源性干擾素及生長因子，促進愈合[10-11]。基于銅綠假單胞菌注射液的這種生物學特性，當術后出現局部皮下或殘腔積液時，經局部皮下和殘腔周圍注射銅綠假單胞菌注射液，可使局部產生無菌性炎癥，促使皮膚與肌創面發生粘連，可明顯減少積液[12]。值得注意的是銅綠假單胞菌注射液中的銅綠假單胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株上高表達的 1 型菌毛，因黏附力特別強，會很快地黏附在組織細胞上（只需幾分鐘），菌毛黏附在組織上后通過激活組織中的免疫細胞來發揮作用。
魏濤等[13]報道運用銅綠假單胞菌注射液沿引流管逆行注射至創腔可達到治療頸清掃術后乳糜漏的目的，在該研究中銅綠假單胞菌注射液并未對相關區域神經功能造成影響，后續的研究[14-15]表明，將銅綠假單胞菌注射液噴灑于甲狀腺癌行頸側區淋巴結清掃后的創面中，在不增加并發癥的情況下可顯著減少頸側區術后引流量，縮短術后住院時間。在其他研究[16]中，也有報道將銅綠假單胞菌注射液噴灑于宮頸癌盆腔淋巴結清掃術后的創面上，結果顯示，銅綠假單胞菌注射液局部噴灑可明顯減少盆腔淋巴液。 還有報道[17]將銅綠假單胞菌注射液用于防治乳腺癌術后的皮下積液，顯示了良好的效果。 銅綠假單胞菌注射液還能明顯減少惡性胸腔積液[18]和頑固性心包積液[19]，并能治療 Whipple 術后淋巴漏[20]。
甲狀腺手術最主要的并發癥是喉返神經損傷和永久性甲狀旁腺功能減退癥，前者將造成臨時性或永久性聲音嘶啞，甚至永久性氣管造瘺，后者將造成患者需要長期補鈣，這兩種并發癥都將明顯降低患者的生活質量。以往頸側區淋巴結清掃術后乳糜漏時局部運用銅綠假單胞菌注射液被證明是安全的，運用于甲狀腺全切及中央區淋巴結清掃術后的創面似乎能得到減少引流量，加速出院的效果，但令人擔憂的是暴露的喉返神經和甲狀旁腺因藥物引發的炎癥反應而受損。在頸側區淋巴結清掃后的創腔局部運用銅綠假單胞菌注射液并沒有引起副神經、膈神經、迷走神經、臂叢神經等神經損傷的相關并發癥表現[21]，因此考慮該藥物并不引起的神經組織本身的炎癥，這為本研究觀察甲狀腺術后中央區創腔局部噴灑該藥提供了可行性支撐。
在本研究中，我們并沒有觀察到因使用銅綠假單胞菌注射液而導致喉返神經損傷和發生永久性甲狀旁腺功能減退癥的病例，提示了銅綠假單胞菌注射液局部使用的安全性。甲狀腺切除及中央區淋巴結清掃術后仍然可能發生乳糜漏，這將延長患者住院治療時間[22-24]。在本研究中，我們未發現局部噴灑組術后乳糜漏病例，較對照組低，雖然 2 組相比差異無統計學意義，但顯示出了銅綠假單胞菌注射液局部運用有可減少中央區乳糜漏的趨勢，具有成為術后快速康復措施的可能。雖然銅綠假單胞菌局部噴灑引起局部無菌性炎癥反應，伴隨低熱、疼痛，局部腫脹，但該藥所引起的發熱一般以不超過 38.5 ℃ 的低熱為主，并僅持續 1～2 d 即消退，并未增加額外的退熱處理，也不影響患者的住院時間。患者的疼痛評分并沒有因使用該藥物而出現統計學差異，沒有額外使用止痛藥物。
綜上所述，銅綠假單胞菌注射液局部噴灑于中央區淋巴結清掃術后的創面，不會增加損傷喉返神經和甲狀旁腺功能的機會，不顯著增加并發癥，還有可能減少發生中央區淋巴漏的風險。但是，由于應用時間尚短，其遠期治療效果和并發癥發生情況有待進一步觀察。
重要聲明
利益沖突聲明：無利益沖突。
作者貢獻聲明：馬宇和魏濤設計了此實驗；李志輝和朱精強審核完善了實驗方案并監督實驗質量；魏濤和龔日祥指導了實驗操作技術；馬宇完成了實驗主要操作；曾翠芳和鄒秀和收集了實驗觀察指標；雷建勇和鄭洵完成了實驗數據的統計分析。
倫理聲明：該研究通過了四川大學華西醫院生物醫學倫理審批［批文編號：2016 年審（271）號］。
甲狀腺手術中喉返神經和甲狀旁腺的安全一直是外科醫生關注的焦點，這兩種組織器官一旦出現永久性損傷，將顯著降低患者的生活質量。精細化解剖技術已經將這兩種組織器官的損傷降至極低的發生概率[1]。銅綠假單胞菌注射液（Pseudomonas aeruginosa ianjection，PAI）引起的無菌性炎癥反應能有效治療甲狀腺癌頸側區淋巴結清掃術后的乳糜漏[2]，并能有效減少術后頸側區引流量，縮短住院日，且不增加并發癥。本研究旨在探討銅綠假單胞菌注射液對暴露的喉返神經和甲狀旁腺是否造成損傷。
1 資料與方法
1.1 研究對象納入及排除標準
納入標準：甲狀腺乳頭狀癌癌灶直徑大于 1 cm，或雙葉癌，或一側腺葉癌灶合并對側腺葉結節不排除惡性病變；術前超聲或 CT 評估頸側區未發生淋巴結轉移，擬行甲狀腺全切+雙側中央區淋巴結清掃手術。排除標準：淋巴結轉移超過中央區、僅行單側中央區淋巴結清掃、曾行甲狀腺手術以及合并其他嚴重疾病者均排除。
1.2 研究對象
2016 年 3 月至 2017 年 10 月期間在四川大學華西醫院上錦醫院甲狀腺外科進行手術治療的甲狀腺乳頭狀癌患者共 223 例，其中 97 例患者淋巴結轉移超過中央區，13 例患者曾經接受過甲狀腺外科手術，根據上述納入及排除標準，有 113 例患者被納入研究，所有患者均為同一醫生手術，術中使用銅綠假單胞菌注射液局部噴灑（局部噴灑組）58 例，未使用（對照組）55 例。2 組患者的基線資料比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性（表 1）。
表1
2 組患者的基線資料比較
1.3 治療方法
2 組患者術前均行甲狀腺彩超和甲狀腺功能檢查，并經彩超引導下甲狀腺結節細針穿刺病理活檢證實為甲狀腺乳頭狀癌，頸部淋巴結彩超和頸部增強 CT 檢查均未發現頸側區存在可疑轉移淋巴結。 2 組手術方式均為甲狀腺全切及雙側中央區淋巴結清掃（因患者及家屬要求或甲狀腺癌侵出包膜），術畢局部噴灑組中央區創腔均勻噴灑銅綠假單胞菌注射液 1 mL（含菌量 1.6×109/mL，北京萬特爾生物制藥有限公司），噴灑前后應用喉返神經監測儀探測喉返神經電位信號，對照組中央區未使用任何藥物，2 組患者創腔均留置 1 根 16 號血漿引流管（南通三利器械有限公司）。術后當 24 h 引流量低于 10 mL 即拔除引流管。
1.4 觀察指標
觀察 2 組患者術中喉返神經和迷走神經電位信號以及聲音嘶啞和甲狀旁腺功能低下的發生率，比較術后 2 組的引流量，乳糜漏、術后出血、感染及發熱發生情況以及術后住院時間。
1.5 統計學方法
所有數據均采用 SPSS 20.0 軟件進行統計學處理。計數資料用百分率表示，行 χ2 檢驗；計量資料符合正態分布用均數±標準差（±s）表示，行 t 檢驗；不符合正態分布用中位數（M）表示，采用非參數檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 2 組患者喉返神經損傷情況比較
術中使用多功能神經監測儀（美敦力）在 1 mA 刺激電流下探測喉返神經和迷走神經的電位信號。 結果：局部噴灑組與對照組術畢至關閉切口前所測得的喉返神經電位信號和迷走神經電位信號差異均無統計學意義（P>0.05）。2 組術后均未發生臨時性和永久性聲音嘶啞（表 2）。
表2
2 組患者喉返神經及甲狀旁腺損傷情況比較
2.2 2 組患者甲狀旁腺損傷情況比較
局部噴灑組和對照組均有部分患者出現暫時性甲狀旁腺功能減退，但差異無統計學意義（P>0.05）。手術當天至術后第 2 天連續每日補充 10% 葡萄糖酸鈣 20 mL 后患者均未出現低鈣癥狀。術后 1 個月復查，2 組患者中發生暫時性甲狀旁腺功能減退癥患者的血清甲狀旁腺素恢復至正常水平，不需要長期補鈣。2 組患者均未發生永久性甲狀旁腺功能減退癥（表 2）。
2.3 2 組手術情況及術后其他并發癥比較
結果見表 3。由表 3 可見，局部噴灑組術后 24 h 引流量較對照組多，差異具有統計學意義（P=0.023）。局部噴灑組術后出現 2 例乳糜漏（3.6%），對照組術后無乳糜漏發生，但差異無統計學意義（P>0.05）。2 組患者在淋巴結清掃數目、術后總引流量、發熱及切口感染發生率、術后住院時間、術后疼痛評分和甲狀旁腺功能減退方面比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
表3
2 組患者手術情況及術后其他并發癥比較
3 討論
銅綠假單胞菌注射液是微生物學專家、中國菌毛學研究創始人—牟希亞教授應用生物工程技術培育的綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株經現代生物制藥技術精制而成，是具有雙向免疫調節及殺傷腫瘤細胞作用的治療用生物藥品。滅活銅綠假單胞菌菌液中含有豐富的菌毛能刺激機體 Toll 樣受體，激活人體免疫系統，從而達到抗腫瘤的效果[3-4]。
牟希亞于 1984 年建立起銅綠假單胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株（PA-MSHA 菌株） [5]。銅綠假單胞菌注射液是通過基因重組技術，經過減毒傳代、質粒 DNA 的提取與傳遞，并經過減毒、滅活、純化等生產工藝得到的一種周身布滿菌毛的生物制劑，其菌毛是一種糖蛋白類配體，黏附作用強[6]。該菌毛的末端能夠與甘露糖特異性結合，能阻斷與腫瘤生長和轉移相關的受體與其配體的結合，從而發揮抗腫瘤生長和轉移的作用[7]。最初，該藥物被設計應用于防治惡性腫瘤的復發轉移[4,8-9 ]。后續的研究發現，PA-MSHA 菌株的菌毛能有效激活免疫細胞的 Toll 樣受體（TLR），通過 TLR 誘導抗原提呈細胞（巨噬細胞和樹突狀細胞） 分化成熟，成熟的抗原提呈細胞進一步活化自然殺傷細胞（NK 細胞）和 T 細胞，并產生大量內源性干擾素及生長因子，促進愈合[10-11]。基于銅綠假單胞菌注射液的這種生物學特性，當術后出現局部皮下或殘腔積液時，經局部皮下和殘腔周圍注射銅綠假單胞菌注射液，可使局部產生無菌性炎癥，促使皮膚與肌創面發生粘連，可明顯減少積液[12]。值得注意的是銅綠假單胞菌注射液中的銅綠假單胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株上高表達的 1 型菌毛，因黏附力特別強，會很快地黏附在組織細胞上（只需幾分鐘），菌毛黏附在組織上后通過激活組織中的免疫細胞來發揮作用。
魏濤等[13]報道運用銅綠假單胞菌注射液沿引流管逆行注射至創腔可達到治療頸清掃術后乳糜漏的目的，在該研究中銅綠假單胞菌注射液并未對相關區域神經功能造成影響，后續的研究[14-15]表明，將銅綠假單胞菌注射液噴灑于甲狀腺癌行頸側區淋巴結清掃后的創面中，在不增加并發癥的情況下可顯著減少頸側區術后引流量，縮短術后住院時間。在其他研究[16]中，也有報道將銅綠假單胞菌注射液噴灑于宮頸癌盆腔淋巴結清掃術后的創面上，結果顯示，銅綠假單胞菌注射液局部噴灑可明顯減少盆腔淋巴液。 還有報道[17]將銅綠假單胞菌注射液用于防治乳腺癌術后的皮下積液，顯示了良好的效果。 銅綠假單胞菌注射液還能明顯減少惡性胸腔積液[18]和頑固性心包積液[19]，并能治療 Whipple 術后淋巴漏[20]。
甲狀腺手術最主要的并發癥是喉返神經損傷和永久性甲狀旁腺功能減退癥，前者將造成臨時性或永久性聲音嘶啞，甚至永久性氣管造瘺，后者將造成患者需要長期補鈣，這兩種并發癥都將明顯降低患者的生活質量。以往頸側區淋巴結清掃術后乳糜漏時局部運用銅綠假單胞菌注射液被證明是安全的，運用于甲狀腺全切及中央區淋巴結清掃術后的創面似乎能得到減少引流量，加速出院的效果，但令人擔憂的是暴露的喉返神經和甲狀旁腺因藥物引發的炎癥反應而受損。在頸側區淋巴結清掃后的創腔局部運用銅綠假單胞菌注射液并沒有引起副神經、膈神經、迷走神經、臂叢神經等神經損傷的相關并發癥表現[21]，因此考慮該藥物并不引起的神經組織本身的炎癥，這為本研究觀察甲狀腺術后中央區創腔局部噴灑該藥提供了可行性支撐。
在本研究中，我們并沒有觀察到因使用銅綠假單胞菌注射液而導致喉返神經損傷和發生永久性甲狀旁腺功能減退癥的病例，提示了銅綠假單胞菌注射液局部使用的安全性。甲狀腺切除及中央區淋巴結清掃術后仍然可能發生乳糜漏，這將延長患者住院治療時間[22-24]。在本研究中，我們未發現局部噴灑組術后乳糜漏病例，較對照組低，雖然 2 組相比差異無統計學意義，但顯示出了銅綠假單胞菌注射液局部運用有可減少中央區乳糜漏的趨勢，具有成為術后快速康復措施的可能。雖然銅綠假單胞菌局部噴灑引起局部無菌性炎癥反應，伴隨低熱、疼痛，局部腫脹，但該藥所引起的發熱一般以不超過 38.5 ℃ 的低熱為主，并僅持續 1～2 d 即消退，并未增加額外的退熱處理，也不影響患者的住院時間。患者的疼痛評分并沒有因使用該藥物而出現統計學差異，沒有額外使用止痛藥物。
綜上所述，銅綠假單胞菌注射液局部噴灑于中央區淋巴結清掃術后的創面，不會增加損傷喉返神經和甲狀旁腺功能的機會，不顯著增加并發癥，還有可能減少發生中央區淋巴漏的風險。但是，由于應用時間尚短，其遠期治療效果和并發癥發生情況有待進一步觀察。
重要聲明
利益沖突聲明：無利益沖突。
作者貢獻聲明：馬宇和魏濤設計了此實驗；李志輝和朱精強審核完善了實驗方案并監督實驗質量；魏濤和龔日祥指導了實驗操作技術；馬宇完成了實驗主要操作；曾翠芳和鄒秀和收集了實驗觀察指標；雷建勇和鄭洵完成了實驗數據的統計分析。
倫理聲明：該研究通過了四川大學華西醫院生物醫學倫理審批［批文編號：2016 年審（271）號］。
