引用本文： 劉少朋, 劉海潮, 白明輝. miR-451a 對人胰腺癌 BxPc3 細胞增殖和凋亡的影響及其分子機制研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(10): 1231-1235. doi: 10.7507/1007-9424.202002037 復制
胰腺癌是消化系統常見的惡性腫瘤，發病率高，進展快，預后差，5 年生存率不足 10%[1]。外科手術是胰腺癌唯一能達到根治的方法。但據統計，僅有 10%～15% 的患者具備手術治療時機[2]。對于不可手術切除的胰腺癌，藥物化療是其首選方法，但目前胰腺癌常用的化療藥物如吉西他濱、5-氟尿嘧啶等因其耐藥性原因導致整體治療效果欠佳[3-5]，因而致力于腫瘤發生分子機制的研究從未停歇。微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類短鏈非編碼 RNA，廣泛參與并調控著諸多腫瘤的發生及發展進程[6]。miR-451a 是目前研究較多的 miRNA 之一，有研究者[7-10]報道其在多種腫瘤中作為一種抑癌 miRNA，但其在胰腺癌中的作用機制報道較少。基于以上因素，本研究以人胰腺癌 BxPc3 細胞（簡稱“BxPc3 細胞”）為研究對象，進一步探討 miR-451a對 BxPc3 細胞增殖及凋亡的影響，以期為后續更多研究及尋找胰腺癌潛在的新靶點提供一定參考。
1 材料與方法
1.1 主要材料及來源
BxPc3 細胞，上海美軒生物科技有限公司；胎牛血清、磷酸化磷脂酰肌醇-3 激酶（p-PI3K）和磷酸化蛋白激酶 B（p-AKT），武漢賽維爾生物科技有限公司；Trizol RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒（M-MLV）、實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）試劑 TB Green Premix，日本 TaKaRa 公司；qRT-PCR 引物，上海生物工程股份有限公司；LipofectamineTM 3000，Invitrogen 公司；RPMI-1640 培養基及胰蛋白酶，上海恪敏生物科技有限公司；RIPA 裂解液、Annexin Ⅴ-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒、BCA 蛋白檢測試劑盒及 ECL 試劑盒，碧云天生物技術研究所；miR-451a 及 MTT 顯色劑，美國 Sigma 公司；兔抗人巨噬細胞移動抑制因子（MIF）單克隆抗體、兔抗人鈣結合蛋白 39（CAB39）多克隆抗體及 GAPDH 抗體，美國 Santa Cruz 公司；辣根過氧化物酶耦聯羊抗兔 IgG 二抗，艾美捷科技有限公司；DMEM 培養基，南京森貝伽生物有限公司；紫外線分光光度計、RNAiso Plus（Total RNA 提取試劑），賽默飛世爾科技公司；Bio-Rad CFX96 PCR 儀，上海甄明科學儀器有限公司。
1.2 細胞培養、傳代及 miR-451a 轉染
1.2.1 細胞培養及傳代
將 BxPc3 細胞置入含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培養基并放入相對濕度 95%、體溫 37 ℃ 的恒溫培養箱中進行培養，常規更換培養液，進行細胞傳代。
1.2.2 細胞轉染
將傳代 3 代的 BxPc3 細胞接種于 6 板孔上，設轉染密度 50%～70%。將稀釋成不同濃度（25、50、100 和 200 μmol/L）的 miR-451a 模擬物及脂質體 LipofectamineTM 3000 加入相應劑量的 DMEM 培養基中，充分混合均勻，室溫靜置 15 min，逐滴加入 24 板孔中孵育 6 h 后換用含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培養基，繼續恒溫培養箱中培養 48 h 用于后續實驗。實驗重復檢測5次。
1.3 qRT-PCR 法檢測轉染 miR-451a 后 BxPc3 細胞中 miR-451a mRNA 表達情況
依據 RNAiso Plus 說明書提取不同濃度 miR-451a轉染后的 BxPc3 細胞總 RNA，瓊脂凝膠電泳檢測 RNA 完整性；紫外線分光光度計測定 RNA 總濃度及光密度（OD）260 和 OD280 值。取 1 μg 總 RNA 經反轉錄合成 cDNA。設 U6 為 miRNA 內參，使用 Bio-Rad CFX96 PCR 儀測定 miR-451a 及 U6 的 mRNA表達情況。miR-451a 上游引物為 5′-TCCGATTGAGTCATTACCAT-3′，下游引物為 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，擴增片段長段為 300 bP；U6 上游引物為5′- TCCGATCGTGAAGCGTTC-3′，下游引物為 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，擴增片段長段為 300 bP。用 2－△△CT 法計算 miR-451a mRNA 相對表達量，其中 ΔΔCT=（CT實驗組目的–CT實驗組內參）–（CT對照組目的–CT對照組內參）。
1.4 MTT 法檢測轉染 miR-451a 后對 BxPc3 細胞增殖的影響
將 miR-451a 轉染后的 BxPc3 細胞及空白對照組細胞分別接種于 24 孔板上（細胞濃度為 5×104 個/mL，200 μL/孔）。棄去上清液，加入無血清的 RPMI-1640 培養液（200 μL/孔）及濃度為 5 mg/mL 的 MTT 液（20 μL/孔）繼續培養 4 h 后再次棄去上清，每孔加入 200 μL DMSO 后充分振蕩 10～20 min，待溶解結晶后分別于 24、48 及 72 h 用酶標儀測定每孔波長 570 nm 的吸光度（A570）值，計算細胞抑制率，其公式為：細胞抑制率（%）=（1–實驗組A570 值/空白對照組A570 值）×100%。
1.5 平板克隆實驗檢測轉染 miR-451a 后對 BxPc3 細胞克隆形成的影響
將 200 μmol/L 濃度 miR-451a 轉染后的 BxPc3 細胞及空白對照組細胞分別接種于 6 孔板上，在恒溫（37 ℃）培養箱中培養 14 d 后取出并用 PBS 液清洗，甲醛固定 15 min，0.1% 結晶紫染液染色 20 min，沖洗染色并風干，在倒置顯微鏡下隨機選取 5 個視野計數，取平均值并用 Image J 軟件統計克隆個數。
1.6 流式細胞儀觀察轉染 miR-451a 后對 BxPc3 細胞周期及細胞凋亡的影響
取不同濃度 miR-451a 轉染的 BxPc3 細胞（細胞濃度為 1×105 個/mL）及空白對照組細胞連續培養 48 h 后分別接種于 24 孔板上。用不含 EDTA 的胰酶溶液消化收集細胞，70%乙醇固定后過夜（4 ℃），棄去上清后分別加入 50 μg/mL 的 RNAse A 溶液重懸，室溫放置 1 h。4 ℃ 避光條件下加入 PI 染液 10 μL，室溫孵育 25 min，流式細胞儀觀察細胞周期。依據 Annexin Ⅴ-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒進行染色后上機檢測細胞凋亡。
1.7 Western blot 法檢測 MIF、CAB39、p-PI3K 和 p-AKT 蛋白的表達
將不同濃度 miR-451a 轉染后的 BxPc3 細胞制成單細胞懸液（濃度為 5×104 個/mL）并接種于 24 孔板中（200 μL/孔），室溫培養 48 h。用 RIPA 裂解液參照說明書提取總蛋白，用 BCA 法測定蛋白濃度并調整樣品蛋白濃度使其相同后取樣品，每孔加入 4 μg 上樣緩沖液，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉印至 PVDF 膜上，隨后以 5% 脫脂奶粉封閉 2 h（37 ℃）。PBS 液沖洗膜后分別加入兔抗人 MIF 單克隆抗體（1∶200）、兔抗人 CAB39 抗體一抗（1∶500）及 GAPDH 內參抗體（1∶4 000），4 ℃ 孵育過夜后用 PBS 液洗滌。再加入辣根過氧化物酶結合的羊抗兔二抗 IgG（1∶2 000），室溫（37 ℃）孵育 2 h 后用 ECL 顯影。于暗室中分別在容器中倒入顯影液及定影液，在紅光下對 X 光片曝光后迅速放入顯影液中，待出現明顯條帶后終止顯影，再立即放入定影液中 10 min 直至膠片透明，清水沖洗棄去殘留定影液，室溫晾干并拍照。用 Bandscan 5.0 軟件進行灰度分析，以目的蛋白條帶和 GAPDH 蛋白條帶的灰度值之比表示目的蛋白的相對表達水平。
1.8 統計學方法
使用 SPSS 22.0 統計學軟件對數據進行統計分析。先對計量數據進行方差齊性檢驗和正態分布檢驗，符合者以均數±標準差（
±s）表示，采用兩因素重復測量方差分析及單因素方差分析進行統計分析，組內比較采用 LSD-t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 轉染后 BxPc3 細胞中 miR-451a mRNA 表達情況
空白對照組、25、50、100、200 μmol/L 濃度組 BxPc3 細胞內 miR-451a 熒光表達的定性結果見圖 1a，半定量結果見圖 1b，結果顯示，不同濃度 miR-451a轉染后 BxPc3 細胞內 miR-451a mRNA 表達水平均較空白對照組增加（P<0.050），細胞內熒光點明顯增多，且隨著轉染濃度增加，miR-451a mRNA 表達水平亦依次增高（P<0.050）。
圖1
示空白對照組及不同濃度 miR-451a 作用后對 BxPc3 細胞增殖、分化及凋亡的影響
a、b：分別為 miR-451a mRNA 表達的定性結果（直接免疫熒光染色法 ×200）和半定量結果；c、d：分別為細胞周期分化的定性及半定量結果；e、f：分別為細胞凋亡的定性及半定量結果；g：BxPc3 細胞中 MIF、CAB39、p-PI3K 和 p-AKT 蛋白表達。1：空白對照組；2–5：分別為 25、50、100 及 200 μmol/L 濃度 miR-451a 轉染組。與空白對照組比較，*
2.2 轉染 miR-451a 后對 BxPc3 細胞增殖的影響
與空白對照組相比，轉染 miR-451a 后對 BxPc3 細胞增殖抑制率均顯著增高（P<0.050）；相同作用時間下，BxPc3 細胞增殖抑制率隨著轉染 miR-451a 濃度的增加而增高（P<0.050）；相同作用濃度下，BxPc3 細胞增殖抑制率隨著 miR-451a 轉染時間的延長而增高（P<0.001），見表 1。
表1
不同濃度 miR-451a 轉染不同時相后對 BxPc3 細胞增殖抑制率的影響（
，%，n=5）
2.3 miR-451a 對 BxPc3 細胞克隆形成的影響
BxPc3 細胞克隆數空白對照組為（299.78±13.39）個，200 μmol/L 濃度 miR-451a 轉染后的 BxPc3 細胞為（144.77±32.05）個，后者明顯少于前者（t=9.831，P<0.001）。
2.4 轉染 miR-451a 后對 BxPc3 細胞周期分化及細胞凋亡的影響
2.4.1 細胞周期分化
連續培養 48 h 后，在不同濃度 miR-451a 轉染后的 BxPc3 細胞中 G0/G1 期細胞所占百分比明顯高于空白對照組（P<0.050），而 S 期和 G2/M 期細胞在不同濃度 miR-451a 轉染后的 BxPc3 細胞中所占百分比明顯低于空白對照組（P<0.050）；隨著 miR-451a 濃度的增加，G0/G1 期、S 期和 G2/M 期細胞在不同濃度之間總體比較差異有統計學意義（
=138.29，P<0.001；FS 期=342.11，P<0.001；
=97.32，P<0.001）。見圖 1c、1d。
2.4.2 細胞凋亡
不同濃度的 miR-451a 轉染 BxPc3 細胞 48 h 后，各組 BxPc3 細胞凋亡率顯著高于空白對照組（P<0.050）；隨著 miR-451a 濃度的增加，在不同濃度之間細胞凋亡率總體比較差異有統計學意義（F=271.16，P<0.001）。見圖 1e、1f。
2.5 不同濃度 miR-451a 轉染后 BxPc3 細胞中 MIF、CAB39、p-PI3K 和 p-AKT 蛋白表達的影響
不同濃度 miR-451a 轉染后的 BxPc3 細胞中 MIF、CAB39、p-PI3K 和 p-AKT 蛋白的表達水平均明顯低于空白對照組（P<0.050），且隨著 miR-451a 濃度的增加而逐漸下降（P<0.050）。見圖 1g 及表 2。
表2
miR-451a 作用 48 h 時對 BxPc3 細胞中 MIF、CAB39、p-PI3K 和 p-AKT蛋白表達的影響（
，n=5）
3 討論
胰腺癌素有“癌中之王”之稱[11]，其起病隱匿，多數患者確診時已是局部進展期或已發生遠處轉移，喪失了手術治療時機[12-14]。藥物化療仍是胰腺癌綜合治療不可或缺的重要手段，但嚴重的耐藥問題至今仍亟待解決[15-16]，因此，尋求新的藥物治療靶點尤為重要。
miRNA 廣泛參與了多種腫瘤的發展進程[17]，其被證實是一種抑癌基因，可顯著抑制結腸癌[18]、胃癌[19]、食管癌[20]、肺癌[21]、乳腺癌[22]等腫瘤細胞增殖及侵襲。但目前國內關于 miR-451a 與胰腺癌的相關性研究報道較少，僅有常振宇等[23]的研究發現 miR-451a 可增強胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性，但其具體作用機制尚不清楚。
本研究通過脂質體轉染法構建過表達 miR-451a的 BxPc3 細胞，qRT-PCR 法檢測結果發現轉染后的 BxPc3 細胞內熒光點及 miR-451a mRNA 表達量均高于空白對照組，且轉染濃度越高，miR-451a mRNA 表達量也越高，結果提示，BxPc3 細胞均得到有效轉染，為后續實驗打下較好的基礎。MTT 法及平板克隆實驗發現，miR-451a 不僅可顯著抑制 BxPc3 細胞增殖、減少細胞克隆數，且隨著其濃度增加及作用時間延長，細胞增殖抑制效果更明顯，表現出明顯的時間及濃度依賴性。細胞周期分析結果發現，miR-451a 作用后的 BxPc3 細胞多數停滯在 G0/G1 期，細胞凋亡率高于空白對照組且呈現濃度依賴性。本研究實驗結果提示，miR-451a 可抑制 BxPc3 細胞增殖、誘導細胞凋亡并呈濃度依賴性。
有研究[24-25]發現，MIF 廣泛參與了腫瘤發生及發展進程，可促進腫瘤細胞增殖、分化，抑制細胞凋亡。CAB39 參與了腫瘤發生的重要信號通路之一的 PI3K/AKT 信號通路，可誘導下游蛋白 PI3K 及 AKT 磷酸化，進而促進細胞分化、抑制細胞凋亡。本實驗進一步通過 Western blot 法檢測發現，miR-451a 轉染組 BxPc3 細胞內 MIF、CAB39、p-PI3K 和 p-AKT 蛋白的表達水平均明顯低于空白對照組且呈濃度依賴性。結合既有研究[26]推測 miR-451a 可能是通過靶向抑制 MIF、CAB39 及其下游蛋白表達，阻斷 PI3K/AKT 信號通路，進而抑制 PI3K 及 AKT 磷酸化，導致 BxPc3 細胞周期分化停滯，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，這與 Goto 等[27]的研究結論基本一致。
本研究結果提示，miR-451a 在胰腺癌 BxPc3 細胞中發揮著抑癌基因的作用，為尋求胰腺癌治療新的潛在分子靶點提供了一定參考。本課題研究小組后續將結合臨床研究進一步探討 miR-451a 在胰腺癌診斷及治療中的潛在應用價值。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉少朋負責本課題的實驗設計、操作、數據統計等并負責文章校對及修改；劉海潮和白明輝協助完成相關實驗及數據收集和整理。
志謝：感謝蘇寶威及王小亮在實驗設計、數據收集等方面予以的大力協助。
胰腺癌是消化系統常見的惡性腫瘤，發病率高，進展快，預后差，5 年生存率不足 10%[1]。外科手術是胰腺癌唯一能達到根治的方法。但據統計，僅有 10%～15% 的患者具備手術治療時機[2]。對于不可手術切除的胰腺癌，藥物化療是其首選方法，但目前胰腺癌常用的化療藥物如吉西他濱、5-氟尿嘧啶等因其耐藥性原因導致整體治療效果欠佳[3-5]，因而致力于腫瘤發生分子機制的研究從未停歇。微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類短鏈非編碼 RNA，廣泛參與并調控著諸多腫瘤的發生及發展進程[6]。miR-451a 是目前研究較多的 miRNA 之一，有研究者[7-10]報道其在多種腫瘤中作為一種抑癌 miRNA，但其在胰腺癌中的作用機制報道較少。基于以上因素，本研究以人胰腺癌 BxPc3 細胞（簡稱“BxPc3 細胞”）為研究對象，進一步探討 miR-451a對 BxPc3 細胞增殖及凋亡的影響，以期為后續更多研究及尋找胰腺癌潛在的新靶點提供一定參考。
1 材料與方法
1.1 主要材料及來源
BxPc3 細胞，上海美軒生物科技有限公司；胎牛血清、磷酸化磷脂酰肌醇-3 激酶（p-PI3K）和磷酸化蛋白激酶 B（p-AKT），武漢賽維爾生物科技有限公司；Trizol RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒（M-MLV）、實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）試劑 TB Green Premix，日本 TaKaRa 公司；qRT-PCR 引物，上海生物工程股份有限公司；LipofectamineTM 3000，Invitrogen 公司；RPMI-1640 培養基及胰蛋白酶，上海恪敏生物科技有限公司；RIPA 裂解液、Annexin Ⅴ-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒、BCA 蛋白檢測試劑盒及 ECL 試劑盒，碧云天生物技術研究所；miR-451a 及 MTT 顯色劑，美國 Sigma 公司；兔抗人巨噬細胞移動抑制因子（MIF）單克隆抗體、兔抗人鈣結合蛋白 39（CAB39）多克隆抗體及 GAPDH 抗體，美國 Santa Cruz 公司；辣根過氧化物酶耦聯羊抗兔 IgG 二抗，艾美捷科技有限公司；DMEM 培養基，南京森貝伽生物有限公司；紫外線分光光度計、RNAiso Plus（Total RNA 提取試劑），賽默飛世爾科技公司；Bio-Rad CFX96 PCR 儀，上海甄明科學儀器有限公司。
1.2 細胞培養、傳代及 miR-451a 轉染
1.2.1 細胞培養及傳代
將 BxPc3 細胞置入含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培養基并放入相對濕度 95%、體溫 37 ℃ 的恒溫培養箱中進行培養，常規更換培養液，進行細胞傳代。
1.2.2 細胞轉染
將傳代 3 代的 BxPc3 細胞接種于 6 板孔上，設轉染密度 50%～70%。將稀釋成不同濃度（25、50、100 和 200 μmol/L）的 miR-451a 模擬物及脂質體 LipofectamineTM 3000 加入相應劑量的 DMEM 培養基中，充分混合均勻，室溫靜置 15 min，逐滴加入 24 板孔中孵育 6 h 后換用含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培養基，繼續恒溫培養箱中培養 48 h 用于后續實驗。實驗重復檢測5次。
1.3 qRT-PCR 法檢測轉染 miR-451a 后 BxPc3 細胞中 miR-451a mRNA 表達情況
依據 RNAiso Plus 說明書提取不同濃度 miR-451a轉染后的 BxPc3 細胞總 RNA，瓊脂凝膠電泳檢測 RNA 完整性；紫外線分光光度計測定 RNA 總濃度及光密度（OD）260 和 OD280 值。取 1 μg 總 RNA 經反轉錄合成 cDNA。設 U6 為 miRNA 內參，使用 Bio-Rad CFX96 PCR 儀測定 miR-451a 及 U6 的 mRNA表達情況。miR-451a 上游引物為 5′-TCCGATTGAGTCATTACCAT-3′，下游引物為 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，擴增片段長段為 300 bP；U6 上游引物為5′- TCCGATCGTGAAGCGTTC-3′，下游引物為 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，擴增片段長段為 300 bP。用 2－△△CT 法計算 miR-451a mRNA 相對表達量，其中 ΔΔCT=（CT實驗組目的–CT實驗組內參）–（CT對照組目的–CT對照組內參）。
1.4 MTT 法檢測轉染 miR-451a 后對 BxPc3 細胞增殖的影響
將 miR-451a 轉染后的 BxPc3 細胞及空白對照組細胞分別接種于 24 孔板上（細胞濃度為 5×104 個/mL，200 μL/孔）。棄去上清液，加入無血清的 RPMI-1640 培養液（200 μL/孔）及濃度為 5 mg/mL 的 MTT 液（20 μL/孔）繼續培養 4 h 后再次棄去上清，每孔加入 200 μL DMSO 后充分振蕩 10～20 min，待溶解結晶后分別于 24、48 及 72 h 用酶標儀測定每孔波長 570 nm 的吸光度（A570）值，計算細胞抑制率，其公式為：細胞抑制率（%）=（1–實驗組A570 值/空白對照組A570 值）×100%。
1.5 平板克隆實驗檢測轉染 miR-451a 后對 BxPc3 細胞克隆形成的影響
將 200 μmol/L 濃度 miR-451a 轉染后的 BxPc3 細胞及空白對照組細胞分別接種于 6 孔板上，在恒溫（37 ℃）培養箱中培養 14 d 后取出并用 PBS 液清洗，甲醛固定 15 min，0.1% 結晶紫染液染色 20 min，沖洗染色并風干，在倒置顯微鏡下隨機選取 5 個視野計數，取平均值并用 Image J 軟件統計克隆個數。
1.6 流式細胞儀觀察轉染 miR-451a 后對 BxPc3 細胞周期及細胞凋亡的影響
取不同濃度 miR-451a 轉染的 BxPc3 細胞（細胞濃度為 1×105 個/mL）及空白對照組細胞連續培養 48 h 后分別接種于 24 孔板上。用不含 EDTA 的胰酶溶液消化收集細胞，70%乙醇固定后過夜（4 ℃），棄去上清后分別加入 50 μg/mL 的 RNAse A 溶液重懸，室溫放置 1 h。4 ℃ 避光條件下加入 PI 染液 10 μL，室溫孵育 25 min，流式細胞儀觀察細胞周期。依據 Annexin Ⅴ-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒進行染色后上機檢測細胞凋亡。
1.7 Western blot 法檢測 MIF、CAB39、p-PI3K 和 p-AKT 蛋白的表達
將不同濃度 miR-451a 轉染后的 BxPc3 細胞制成單細胞懸液（濃度為 5×104 個/mL）并接種于 24 孔板中（200 μL/孔），室溫培養 48 h。用 RIPA 裂解液參照說明書提取總蛋白，用 BCA 法測定蛋白濃度并調整樣品蛋白濃度使其相同后取樣品，每孔加入 4 μg 上樣緩沖液，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉印至 PVDF 膜上，隨后以 5% 脫脂奶粉封閉 2 h（37 ℃）。PBS 液沖洗膜后分別加入兔抗人 MIF 單克隆抗體（1∶200）、兔抗人 CAB39 抗體一抗（1∶500）及 GAPDH 內參抗體（1∶4 000），4 ℃ 孵育過夜后用 PBS 液洗滌。再加入辣根過氧化物酶結合的羊抗兔二抗 IgG（1∶2 000），室溫（37 ℃）孵育 2 h 后用 ECL 顯影。于暗室中分別在容器中倒入顯影液及定影液，在紅光下對 X 光片曝光后迅速放入顯影液中，待出現明顯條帶后終止顯影，再立即放入定影液中 10 min 直至膠片透明，清水沖洗棄去殘留定影液，室溫晾干并拍照。用 Bandscan 5.0 軟件進行灰度分析，以目的蛋白條帶和 GAPDH 蛋白條帶的灰度值之比表示目的蛋白的相對表達水平。
1.8 統計學方法
使用 SPSS 22.0 統計學軟件對數據進行統計分析。先對計量數據進行方差齊性檢驗和正態分布檢驗，符合者以均數±標準差（±s）表示，采用兩因素重復測量方差分析及單因素方差分析進行統計分析，組內比較采用 LSD-t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 轉染后 BxPc3 細胞中 miR-451a mRNA 表達情況
空白對照組、25、50、100、200 μmol/L 濃度組 BxPc3 細胞內 miR-451a 熒光表達的定性結果見圖 1a，半定量結果見圖 1b，結果顯示，不同濃度 miR-451a轉染后 BxPc3 細胞內 miR-451a mRNA 表達水平均較空白對照組增加（P<0.050），細胞內熒光點明顯增多，且隨著轉染濃度增加，miR-451a mRNA 表達水平亦依次增高（P<0.050）。
圖1
示空白對照組及不同濃度 miR-451a 作用后對 BxPc3 細胞增殖、分化及凋亡的影響
a、b：分別為 miR-451a mRNA 表達的定性結果（直接免疫熒光染色法 ×200）和半定量結果；c、d：分別為細胞周期分化的定性及半定量結果；e、f：分別為細胞凋亡的定性及半定量結果；g：BxPc3 細胞中 MIF、CAB39、p-PI3K 和 p-AKT 蛋白表達。1：空白對照組；2–5：分別為 25、50、100 及 200 μmol/L 濃度 miR-451a 轉染組。與空白對照組比較，*
2.2 轉染 miR-451a 后對 BxPc3 細胞增殖的影響
與空白對照組相比，轉染 miR-451a 后對 BxPc3 細胞增殖抑制率均顯著增高（P<0.050）；相同作用時間下，BxPc3 細胞增殖抑制率隨著轉染 miR-451a 濃度的增加而增高（P<0.050）；相同作用濃度下，BxPc3 細胞增殖抑制率隨著 miR-451a 轉染時間的延長而增高（P<0.001），見表 1。
表1
不同濃度 miR-451a 轉染不同時相后對 BxPc3 細胞增殖抑制率的影響（，%，n=5）
2.3 miR-451a 對 BxPc3 細胞克隆形成的影響
BxPc3 細胞克隆數空白對照組為（299.78±13.39）個，200 μmol/L 濃度 miR-451a 轉染后的 BxPc3 細胞為（144.77±32.05）個，后者明顯少于前者（t=9.831，P<0.001）。
2.4 轉染 miR-451a 后對 BxPc3 細胞周期分化及細胞凋亡的影響
2.4.1 細胞周期分化
連續培養 48 h 后，在不同濃度 miR-451a 轉染后的 BxPc3 細胞中 G0/G1 期細胞所占百分比明顯高于空白對照組（P<0.050），而 S 期和 G2/M 期細胞在不同濃度 miR-451a 轉染后的 BxPc3 細胞中所占百分比明顯低于空白對照組（P<0.050）；隨著 miR-451a 濃度的增加，G0/G1 期、S 期和 G2/M 期細胞在不同濃度之間總體比較差異有統計學意義（=138.29，P<0.001；FS 期=342.11，P<0.001；=97.32，P<0.001）。見圖 1c、1d。
2.4.2 細胞凋亡
不同濃度的 miR-451a 轉染 BxPc3 細胞 48 h 后，各組 BxPc3 細胞凋亡率顯著高于空白對照組（P<0.050）；隨著 miR-451a 濃度的增加，在不同濃度之間細胞凋亡率總體比較差異有統計學意義（F=271.16，P<0.001）。見圖 1e、1f。
2.5 不同濃度 miR-451a 轉染后 BxPc3 細胞中 MIF、CAB39、p-PI3K 和 p-AKT 蛋白表達的影響
不同濃度 miR-451a 轉染后的 BxPc3 細胞中 MIF、CAB39、p-PI3K 和 p-AKT 蛋白的表達水平均明顯低于空白對照組（P<0.050），且隨著 miR-451a 濃度的增加而逐漸下降（P<0.050）。見圖 1g 及表 2。
表2
miR-451a 作用 48 h 時對 BxPc3 細胞中 MIF、CAB39、p-PI3K 和 p-AKT蛋白表達的影響（，n=5）
3 討論
胰腺癌素有“癌中之王”之稱[11]，其起病隱匿，多數患者確診時已是局部進展期或已發生遠處轉移，喪失了手術治療時機[12-14]。藥物化療仍是胰腺癌綜合治療不可或缺的重要手段，但嚴重的耐藥問題至今仍亟待解決[15-16]，因此，尋求新的藥物治療靶點尤為重要。
miRNA 廣泛參與了多種腫瘤的發展進程[17]，其被證實是一種抑癌基因，可顯著抑制結腸癌[18]、胃癌[19]、食管癌[20]、肺癌[21]、乳腺癌[22]等腫瘤細胞增殖及侵襲。但目前國內關于 miR-451a 與胰腺癌的相關性研究報道較少，僅有常振宇等[23]的研究發現 miR-451a 可增強胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性，但其具體作用機制尚不清楚。
本研究通過脂質體轉染法構建過表達 miR-451a的 BxPc3 細胞，qRT-PCR 法檢測結果發現轉染后的 BxPc3 細胞內熒光點及 miR-451a mRNA 表達量均高于空白對照組，且轉染濃度越高，miR-451a mRNA 表達量也越高，結果提示，BxPc3 細胞均得到有效轉染，為后續實驗打下較好的基礎。MTT 法及平板克隆實驗發現，miR-451a 不僅可顯著抑制 BxPc3 細胞增殖、減少細胞克隆數，且隨著其濃度增加及作用時間延長，細胞增殖抑制效果更明顯，表現出明顯的時間及濃度依賴性。細胞周期分析結果發現，miR-451a 作用后的 BxPc3 細胞多數停滯在 G0/G1 期，細胞凋亡率高于空白對照組且呈現濃度依賴性。本研究實驗結果提示，miR-451a 可抑制 BxPc3 細胞增殖、誘導細胞凋亡并呈濃度依賴性。
有研究[24-25]發現，MIF 廣泛參與了腫瘤發生及發展進程，可促進腫瘤細胞增殖、分化，抑制細胞凋亡。CAB39 參與了腫瘤發生的重要信號通路之一的 PI3K/AKT 信號通路，可誘導下游蛋白 PI3K 及 AKT 磷酸化，進而促進細胞分化、抑制細胞凋亡。本實驗進一步通過 Western blot 法檢測發現，miR-451a 轉染組 BxPc3 細胞內 MIF、CAB39、p-PI3K 和 p-AKT 蛋白的表達水平均明顯低于空白對照組且呈濃度依賴性。結合既有研究[26]推測 miR-451a 可能是通過靶向抑制 MIF、CAB39 及其下游蛋白表達，阻斷 PI3K/AKT 信號通路，進而抑制 PI3K 及 AKT 磷酸化，導致 BxPc3 細胞周期分化停滯，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，這與 Goto 等[27]的研究結論基本一致。
本研究結果提示，miR-451a 在胰腺癌 BxPc3 細胞中發揮著抑癌基因的作用，為尋求胰腺癌治療新的潛在分子靶點提供了一定參考。本課題研究小組后續將結合臨床研究進一步探討 miR-451a 在胰腺癌診斷及治療中的潛在應用價值。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉少朋負責本課題的實驗設計、操作、數據統計等并負責文章校對及修改；劉海潮和白明輝協助完成相關實驗及數據收集和整理。
志謝：感謝蘇寶威及王小亮在實驗設計、數據收集等方面予以的大力協助。
