引用本文： 賀功建, 杜正貴. 乳腺癌骨轉移相關的基因研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(10): 1254-1258. doi: 10.7507/1007-9424.201912069 復制
骨是乳腺癌最常見的靶向轉移器官，最常見的骨轉移部位是椎骨、骨盆、長骨和頭骨的近端，出現骨轉移的乳腺癌患者往往預后不良[1-2]。當前的姑息性治療手段并不能提高乳腺癌骨轉移患者的總生存率。因此，有必要深入探究乳腺癌骨轉移的機制，從而尋找新的靶向治療藥物。乳腺癌骨轉移的機制極其復雜，涉及到腫瘤細胞、成骨細胞、破骨細胞和礦化骨基質之間的協同相互作用[3-5]。骨質降解、骨形成和腫瘤生長之間的相互作用受到基因表達及信號轉導通路的調控[6-7]。隨著越來越多的乳腺癌骨轉移相關基因被發現，乳腺癌骨轉移的相關機制也正逐漸被揭開。本研究擬從美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的基因表達綜合數據庫（gene expression omnibus，GEO）下載乳腺癌骨轉移數據，并采用加權基因共表達網絡分析（weighted gene coexpression network analysis，WGCNA）方法找到乳腺癌骨轉移相關的關鍵（hub）基因。
1 資料與方法
1.1 乳腺癌患者腫瘤組織的基因表達數據整理
從 GEO 數據庫下載 GSE2034 數據集中共 286 例乳腺癌患者的基本臨床特征及腫瘤標本的基因表達信息。基因測序平臺是 GPL96，基因芯片的探針注釋信息來自于 Affymetrix 公司下載的原始文件［（HG-U133A）Affymetrix Human Genome U133A Array］。通過 R 軟件實現基因芯片的分析。通過 affy 包將原始的 CEL 數據導入 R 軟件中，并使用 Robust Multi-Array（RMA）對各乳腺癌樣本的基因表達值進行歸一化處理；然后將歸一化的表達譜用于進一步的分析。通過基因芯片的注釋信息將探針與對應的基因進行匹配。排除一個探針同時對應一個以上基因的情況，對于一個基因同時對應多個探針的情況應該計算所有探針表達值的平均值。本研究選擇在各數據集樣本中表達超過 50% 的探針用于后續研究；以最近鄰算法（k-nearest neighbor，KNN）補充缺失值；以 limma 包進行差異表達值計算，并用貝葉斯方法進行多重檢驗校正。
1.2 建立基因共表達模塊
首先用 R 語言中的 flashClust 工具對所有乳腺癌樣本進行聚類分析，同時檢測離群值并剔除。通過 WGCNA 算法，在構建基因模塊的過程中篩選出適當的軟閾值。采用梯度法檢測不同軟閾值（從 1 到 20）時不同基因模塊的獨立性和平均連接度。取模塊獨立性為 0.8 時的軟閾值為最適軟閾值。確定軟閾值后，使用 WGCNA 算法構建基因共表達模塊并提取出每個模塊中相應基因的信息。
1.3 基因共表達模塊與臨床特征的關系分析
根據每個基因模塊中的特征基因將連接度較高的基因聚集在同一個模塊中，進而挖掘與臨床特征相關的重要基因模塊，并可容易識別出與該表型高度相關的表達模塊。在每個表達譜中，基因顯著性（GS）即為基因表達譜與每種特征之間相關性的絕對值。模塊成員（module membership，MM）是基因在模塊內的模塊隸屬度。特征基因連接度（KME）值為使用主成分分析計算的特征基因的值，其將每個模塊的表達模式概括為單個基因特征表達譜。
1.4 確定與骨轉移相關的關鍵基因
將關鍵基因模塊中每個基因的 KME 和 GS 值分別進行排序，后將兩者的排序結果通過韋恩圖取交集，將取交集后得到的基因進行單因素 Cox 比例風險回歸分析，以探索其與乳腺癌骨轉移的相關性，繼而找到乳腺癌骨轉移相關的關鍵基因。
1.5 統計學方法
采用 R 軟件（3.5.1）中植入的 WGCNA 包用于加權相關網絡分析中的各種分析（
2 結果
2.1 乳腺癌患者的基本臨床信息
本研究納入 GSE2034 數據集中共 286 例乳腺癌患者的腫瘤樣本。這些患者中共有 107 例發生了乳腺癌的遠處轉移，其中出現骨轉移的患者 69 例。在發生遠處轉移的患者中，有 39 例在術后2 年內發生遠處轉移，63 例在術后 2 年后才發生遠處轉移，另 5 例患者發生遠處轉移的時間不詳。患者發生遠處轉移的中位時間為 77.52 個月（2～171個月）。
2.2 共表達基因模塊的構建
通過 WGCNA 方法選取了 286 例乳腺癌患者的腫瘤樣本中方差變異度最大的前 5 000 個基因做進一步的基因富集分析，并根據基因表達值構建基因共表達模塊（圖 1a 和1b）。
圖1
示乳腺癌患者腫瘤樣本的聚類分析熱圖、軟閾值的確定、動態剪切樹、交聯圖及基因表達網絡的 3D 圖
a：286 例乳腺癌患者的腫瘤樣本行聚類分析后，發現有離群值；b：剔除離群值后，剩余樣本聚類良好；c：不同軟閾值下的無尺度網絡符合指數；d：不同軟閾值下的平均連接度；e：軟閾值為 5 時的連接度分布直方圖；f：軟閾值為 5 時的無尺度網絡拓撲檢測結果，log10（k）為連接度的常用對數值，log10 ［p（k）］為概率的常用對數值；g：通過 WGCNA 方法構建基因共表達模塊，圖中的每個分支都代表一個基因，下面的每種顏色代表一個基因共表達模塊；h：共表達基因相互作用關系的交聯圖；i：整個基因表達網絡的 3D 圖，每個基因用一個點來表示，其中點的顏色對應于該基因所屬的基因模塊
篩查合適的軟閾值是進一步分析的基礎，如圖 1c–1f 所示，當軟閾值等于 5 時，無尺度符合指數為 0.8，并且各基因模塊的平均連接度更高，因此，5 為最適軟閾值。最終，通過 WGCNA 方法，本研究共建立了 15 個基因共表達模塊，其中每個基因模塊都用不同的顏色表示（圖 1g–1i），黑色（black）、藍色（blue）、棕色（brown）、青色（cyan）、綠色（green）、黃綠色（greenyellow）、灰色（grey）、洋紅色（magenta）、粉紅色（pink）、紫色（purple）、紅色（red）、深粉色（salmon）、棕褐色（tan）、天青色（turquoise）和黃色（yellow）模塊中分別包含了 242、826、678、38、484、102、98、185、203、167、250、47、50、843 和 587 個基因（圖 1g）。
2.3 確定乳腺癌骨轉移相關基因模塊及關鍵基因
從模塊-臨床特征關系表中可以看出（基于 Pearson 相關性檢驗），在所有模塊中，magenta 模塊是與乳腺癌骨轉移事件呈顯著正相關且相關系數最大的模塊（圖 2a）。各相關基因模塊與乳腺癌骨轉移關系的散點圖（圖 2b–2e）也顯示，magenta 模塊與乳腺癌骨轉移呈顯著正相關（r=0.94，P<0.001）。。
圖2
示乳腺癌骨轉移相關的基因模塊的確定
a：模塊特征基因（MEs）與乳腺癌臨床特征之間的 Pearson 相關性檢驗，表格中每個單元格顯示 MEs（行）和臨床特征（列）之間的相關性
為了探索 magenta 模塊中的關鍵基因，本研究通過 KME 值對 magenta 模塊中的基因進行了排序，并取前 30 個 KME 值最大的基因；然后根據 GS 值對 magenta 模塊中的基因進行排序后，同樣取排在前 30 個的基因；之后通過韋恩圖將兩次排序結果取交集后，共得到 6 個基因：分別是 Ral GTPase 激活蛋白亞單位 α-1（RALGAPA1）、B 細胞抗原受體復合物相關蛋白 α 鏈（CD79A）、人免疫球蛋白 kappa 鏈（IGKC）、抑制蛋白 β2（ARRB2）、FDCP 6 同源異構體（DEF6）和人免疫球蛋白 lambda 鏈（IGLV2）。通過單因素 Cox 比例風險回歸分析，本研究驗證了以上 6 個基因均影響乳腺癌骨轉移患者的生存（表 1）。
表1
magenta 基因模塊中的關鍵基因表達與乳腺癌骨轉移的單因素 Cox 比例風險回歸分析
3 討論
近年來，GEO 等數據庫中基因微陣列數據集的數量不斷增加為乳腺癌相關研究提供了極好的機會。不同于傳統的差異基因表達分析，WGCNA 通過整合多個數據集，并使用無監督的層次聚類方法識別基因模塊，既避免了潛在的主觀決策或選擇偏差，又揭示了目標表型的復雜生物學機制[8-10]。
本研究通過 WGCNA 方法共構建了 15 個基因共表達模塊，并且找到了與乳腺癌骨轉移呈顯著正相關的 magenta 基因模塊。通過進一步分析，本研究找到了 magenta 基因模塊中與骨轉移呈顯著正相關的 6 個關鍵基因，分別是 RALGAPA1、CD79A、IGKC、ARRB2、DEF6 和 IGLV2。
RALGAPA1 基因編碼了 RAL-GTP 酶激活蛋白的主要亞基管樣蛋白基因 1（GARNL1）。RAL 由兩種緊密相關的 G 蛋白 RALA 和 RALB 構成，其與 RAS 基因具有高度相似的序列，是小 GTP 酶-RAS 超家族的一個分支。RAL 在細胞中以與 GDP 結合的未激活狀態和與 GTP 結合的激活狀態之間循環[11]。RAL-GTP 酶的固有 GTP 酶活性非常弱，因此它們主要依賴鳥嘌呤核苷酸交換因子（RALGEF）和 GTP 酶活化蛋白（RALGAP）來催化 GDP-GTP 交換。有研究[12]表明，GARNL1 通過與 14-3-3 蛋白相互作用來調節胰島素刺激的 RALA 激活。RALGEF-RALA 信號通路在 RAS 介導的腫瘤進展中起重要作用。Wu 等[13]的研究表明，RALA 減少會抑制前列腺癌細胞發生骨轉移。
早期研究發現，到達骨微環境中的腫瘤細胞會分泌甲狀旁腺激素相關肽或白細胞介素等因子，導致成骨細胞分化減少、破骨細胞生成增加和骨基質沉積減少[14]。Luger 等[15]發現，B 細胞受體亞單位—CD79A 被腫瘤細胞分泌的細胞因子激活后，致使 T 細胞的增殖受到抑制、促腫瘤發生細胞因子的分泌增加，如白細胞介素 6（IL-6）。IL-6 過表達可促進破骨細胞的生成和骨質溶解，研究[16]顯示，IL-6 的過表達與腫瘤骨轉移高度相關。
IGKC 和 IGLV2 基因分別編碼了免疫球蛋白 kappa 和 lambda 輕鏈蛋白。Groot Kormelink 等[17]的研究表明，免疫球蛋白 kappa 和 lambda 輕鏈蛋白的表達與乳腺癌腫瘤大小、腫瘤分級、臨床分期和血管侵襲呈顯著正相關。lambda 輕鏈蛋白的表達與乳腺癌特異性生存更差以及無遠處轉移時間更短高度相關。免疫球蛋白輕鏈可以以抗原特異性方式激活肥大細胞。在包括乳腺癌、惡性黑色素瘤等多種腫瘤的周圍都發現了肥大細胞的浸潤，肥大細胞可以募集包括巨噬細胞在內的多種其他炎性細胞，進而參與腫瘤的侵襲和轉移[18-19]。
除了乳腺癌細胞自身分泌的一些促進腫瘤生長的細胞因子以外，骨微環境的其他組成部分在乳腺癌細胞的定植中也發揮了關鍵的作用。如活化的成骨細胞可以上調 TNF 相關激活誘導細胞因子—核因子 κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear κB ligand，RANKL）的表達，而 RANKL 與其受體核因子 κB 受體活化因子（RANK）的結合是破骨細胞活化所必須的[20]。Binder 等[21]在 DEF6 基因缺失的炎性骨溶解小鼠模型中發現，DEF6 缺乏導致腫瘤壞死因子 α（TNF-α）誘導的破骨細胞生成及骨吸收顯著增加。DEF6 通過調節由內源性 RANKL 或 TNF-α 誘導的干擾素-β（IFN-β）介導的自分泌反饋路徑，來抑制關鍵的破骨細胞生成因子—依賴性鈣調神經磷酸酶 1（NFATc1）、B 淋巴細胞誘導成熟蛋白 1（Blimp1）和 c-Fos 的表達。
目前的一些研究[22-24]顯示，ARRB2（又名β-arrestin-2）在腫瘤中的表達與腫瘤的侵襲轉移能力有關。如 Sun 等[25]發現，ARRB2 表達下調與肝癌遠處轉移呈顯著正相關（P=0.024），同時體外研究的結果顯示，ARRB2 的過表達可以降低肝癌細胞的侵襲和遷移能力。此外，過表達的 ARRB2 會導致 E-鈣黏蛋白的表達上調、波形蛋白表達下調和磷脂酰肌醇依賴的激酶 [蛋白激酶 B（Akt）] 活化受抑。近年一項研究[26]也發現，ARRB2 基因表達下調導致趨化因子受體 2（CXCR2）基因表達上調，進而促進非小細胞肺癌患者出現淋巴結轉移。
目前乳腺癌骨轉移的作用機制仍有待進一步探索，特別是骨轉移瘤微環境中免疫抑制的相關機制，未來將會有更多免疫治療反應的潛在作用靶點被發現。本研究通過 WGCNA 方法分析得到與乳腺癌骨轉移密切相關的 magenta 基因模塊，并確定該基因模塊中的 6 個關鍵基因分別是：CD79A、RALGAPA1、IGKC、ARRB2、DEF6 和 IGLV2。以上 6 個關鍵基因在乳腺癌骨轉移中的具體機制仍有待進一步的研究闡釋。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：本研究由賀功建和杜正貴共同設計；資料統計、數據分析、繪圖及論文寫作由賀功建在杜正貴的指導下完成。
骨是乳腺癌最常見的靶向轉移器官，最常見的骨轉移部位是椎骨、骨盆、長骨和頭骨的近端，出現骨轉移的乳腺癌患者往往預后不良[1-2]。當前的姑息性治療手段并不能提高乳腺癌骨轉移患者的總生存率。因此，有必要深入探究乳腺癌骨轉移的機制，從而尋找新的靶向治療藥物。乳腺癌骨轉移的機制極其復雜，涉及到腫瘤細胞、成骨細胞、破骨細胞和礦化骨基質之間的協同相互作用[3-5]。骨質降解、骨形成和腫瘤生長之間的相互作用受到基因表達及信號轉導通路的調控[6-7]。隨著越來越多的乳腺癌骨轉移相關基因被發現，乳腺癌骨轉移的相關機制也正逐漸被揭開。本研究擬從美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的基因表達綜合數據庫（gene expression omnibus，GEO）下載乳腺癌骨轉移數據，并采用加權基因共表達網絡分析（weighted gene coexpression network analysis，WGCNA）方法找到乳腺癌骨轉移相關的關鍵（hub）基因。
1 資料與方法
1.1 乳腺癌患者腫瘤組織的基因表達數據整理
從 GEO 數據庫下載 GSE2034 數據集中共 286 例乳腺癌患者的基本臨床特征及腫瘤標本的基因表達信息。基因測序平臺是 GPL96，基因芯片的探針注釋信息來自于 Affymetrix 公司下載的原始文件［（HG-U133A）Affymetrix Human Genome U133A Array］。通過 R 軟件實現基因芯片的分析。通過 affy 包將原始的 CEL 數據導入 R 軟件中，并使用 Robust Multi-Array（RMA）對各乳腺癌樣本的基因表達值進行歸一化處理；然后將歸一化的表達譜用于進一步的分析。通過基因芯片的注釋信息將探針與對應的基因進行匹配。排除一個探針同時對應一個以上基因的情況，對于一個基因同時對應多個探針的情況應該計算所有探針表達值的平均值。本研究選擇在各數據集樣本中表達超過 50% 的探針用于后續研究；以最近鄰算法（k-nearest neighbor，KNN）補充缺失值；以 limma 包進行差異表達值計算，并用貝葉斯方法進行多重檢驗校正。
1.2 建立基因共表達模塊
首先用 R 語言中的 flashClust 工具對所有乳腺癌樣本進行聚類分析，同時檢測離群值并剔除。通過 WGCNA 算法，在構建基因模塊的過程中篩選出適當的軟閾值。采用梯度法檢測不同軟閾值（從 1 到 20）時不同基因模塊的獨立性和平均連接度。取模塊獨立性為 0.8 時的軟閾值為最適軟閾值。確定軟閾值后，使用 WGCNA 算法構建基因共表達模塊并提取出每個模塊中相應基因的信息。
1.3 基因共表達模塊與臨床特征的關系分析
根據每個基因模塊中的特征基因將連接度較高的基因聚集在同一個模塊中，進而挖掘與臨床特征相關的重要基因模塊，并可容易識別出與該表型高度相關的表達模塊。在每個表達譜中，基因顯著性（GS）即為基因表達譜與每種特征之間相關性的絕對值。模塊成員（module membership，MM）是基因在模塊內的模塊隸屬度。特征基因連接度（KME）值為使用主成分分析計算的特征基因的值，其將每個模塊的表達模式概括為單個基因特征表達譜。
1.4 確定與骨轉移相關的關鍵基因
將關鍵基因模塊中每個基因的 KME 和 GS 值分別進行排序，后將兩者的排序結果通過韋恩圖取交集，將取交集后得到的基因進行單因素 Cox 比例風險回歸分析，以探索其與乳腺癌骨轉移的相關性，繼而找到乳腺癌骨轉移相關的關鍵基因。
1.5 統計學方法
采用 R 軟件（3.5.1）中植入的 WGCNA 包用于加權相關網絡分析中的各種分析（
2 結果
2.1 乳腺癌患者的基本臨床信息
本研究納入 GSE2034 數據集中共 286 例乳腺癌患者的腫瘤樣本。這些患者中共有 107 例發生了乳腺癌的遠處轉移，其中出現骨轉移的患者 69 例。在發生遠處轉移的患者中，有 39 例在術后2 年內發生遠處轉移，63 例在術后 2 年后才發生遠處轉移，另 5 例患者發生遠處轉移的時間不詳。患者發生遠處轉移的中位時間為 77.52 個月（2～171個月）。
2.2 共表達基因模塊的構建
通過 WGCNA 方法選取了 286 例乳腺癌患者的腫瘤樣本中方差變異度最大的前 5 000 個基因做進一步的基因富集分析，并根據基因表達值構建基因共表達模塊（圖 1a 和1b）。
圖1
示乳腺癌患者腫瘤樣本的聚類分析熱圖、軟閾值的確定、動態剪切樹、交聯圖及基因表達網絡的 3D 圖
a：286 例乳腺癌患者的腫瘤樣本行聚類分析后，發現有離群值；b：剔除離群值后，剩余樣本聚類良好；c：不同軟閾值下的無尺度網絡符合指數；d：不同軟閾值下的平均連接度；e：軟閾值為 5 時的連接度分布直方圖；f：軟閾值為 5 時的無尺度網絡拓撲檢測結果，log10（k）為連接度的常用對數值，log10 ［p（k）］為概率的常用對數值；g：通過 WGCNA 方法構建基因共表達模塊，圖中的每個分支都代表一個基因，下面的每種顏色代表一個基因共表達模塊；h：共表達基因相互作用關系的交聯圖；i：整個基因表達網絡的 3D 圖，每個基因用一個點來表示，其中點的顏色對應于該基因所屬的基因模塊
篩查合適的軟閾值是進一步分析的基礎，如圖 1c–1f 所示，當軟閾值等于 5 時，無尺度符合指數為 0.8，并且各基因模塊的平均連接度更高，因此，5 為最適軟閾值。最終，通過 WGCNA 方法，本研究共建立了 15 個基因共表達模塊，其中每個基因模塊都用不同的顏色表示（圖 1g–1i），黑色（black）、藍色（blue）、棕色（brown）、青色（cyan）、綠色（green）、黃綠色（greenyellow）、灰色（grey）、洋紅色（magenta）、粉紅色（pink）、紫色（purple）、紅色（red）、深粉色（salmon）、棕褐色（tan）、天青色（turquoise）和黃色（yellow）模塊中分別包含了 242、826、678、38、484、102、98、185、203、167、250、47、50、843 和 587 個基因（圖 1g）。
2.3 確定乳腺癌骨轉移相關基因模塊及關鍵基因
從模塊-臨床特征關系表中可以看出（基于 Pearson 相關性檢驗），在所有模塊中，magenta 模塊是與乳腺癌骨轉移事件呈顯著正相關且相關系數最大的模塊（圖 2a）。各相關基因模塊與乳腺癌骨轉移關系的散點圖（圖 2b–2e）也顯示，magenta 模塊與乳腺癌骨轉移呈顯著正相關（r=0.94，P<0.001）。。
圖2
示乳腺癌骨轉移相關的基因模塊的確定
a：模塊特征基因（MEs）與乳腺癌臨床特征之間的 Pearson 相關性檢驗，表格中每個單元格顯示 MEs（行）和臨床特征（列）之間的相關性
為了探索 magenta 模塊中的關鍵基因，本研究通過 KME 值對 magenta 模塊中的基因進行了排序，并取前 30 個 KME 值最大的基因；然后根據 GS 值對 magenta 模塊中的基因進行排序后，同樣取排在前 30 個的基因；之后通過韋恩圖將兩次排序結果取交集后，共得到 6 個基因：分別是 Ral GTPase 激活蛋白亞單位 α-1（RALGAPA1）、B 細胞抗原受體復合物相關蛋白 α 鏈（CD79A）、人免疫球蛋白 kappa 鏈（IGKC）、抑制蛋白 β2（ARRB2）、FDCP 6 同源異構體（DEF6）和人免疫球蛋白 lambda 鏈（IGLV2）。通過單因素 Cox 比例風險回歸分析，本研究驗證了以上 6 個基因均影響乳腺癌骨轉移患者的生存（表 1）。
表1
magenta 基因模塊中的關鍵基因表達與乳腺癌骨轉移的單因素 Cox 比例風險回歸分析
3 討論
近年來，GEO 等數據庫中基因微陣列數據集的數量不斷增加為乳腺癌相關研究提供了極好的機會。不同于傳統的差異基因表達分析，WGCNA 通過整合多個數據集，并使用無監督的層次聚類方法識別基因模塊，既避免了潛在的主觀決策或選擇偏差，又揭示了目標表型的復雜生物學機制[8-10]。
本研究通過 WGCNA 方法共構建了 15 個基因共表達模塊，并且找到了與乳腺癌骨轉移呈顯著正相關的 magenta 基因模塊。通過進一步分析，本研究找到了 magenta 基因模塊中與骨轉移呈顯著正相關的 6 個關鍵基因，分別是 RALGAPA1、CD79A、IGKC、ARRB2、DEF6 和 IGLV2。
RALGAPA1 基因編碼了 RAL-GTP 酶激活蛋白的主要亞基管樣蛋白基因 1（GARNL1）。RAL 由兩種緊密相關的 G 蛋白 RALA 和 RALB 構成，其與 RAS 基因具有高度相似的序列，是小 GTP 酶-RAS 超家族的一個分支。RAL 在細胞中以與 GDP 結合的未激活狀態和與 GTP 結合的激活狀態之間循環[11]。RAL-GTP 酶的固有 GTP 酶活性非常弱，因此它們主要依賴鳥嘌呤核苷酸交換因子（RALGEF）和 GTP 酶活化蛋白（RALGAP）來催化 GDP-GTP 交換。有研究[12]表明，GARNL1 通過與 14-3-3 蛋白相互作用來調節胰島素刺激的 RALA 激活。RALGEF-RALA 信號通路在 RAS 介導的腫瘤進展中起重要作用。Wu 等[13]的研究表明，RALA 減少會抑制前列腺癌細胞發生骨轉移。
早期研究發現，到達骨微環境中的腫瘤細胞會分泌甲狀旁腺激素相關肽或白細胞介素等因子，導致成骨細胞分化減少、破骨細胞生成增加和骨基質沉積減少[14]。Luger 等[15]發現，B 細胞受體亞單位—CD79A 被腫瘤細胞分泌的細胞因子激活后，致使 T 細胞的增殖受到抑制、促腫瘤發生細胞因子的分泌增加，如白細胞介素 6（IL-6）。IL-6 過表達可促進破骨細胞的生成和骨質溶解，研究[16]顯示，IL-6 的過表達與腫瘤骨轉移高度相關。
IGKC 和 IGLV2 基因分別編碼了免疫球蛋白 kappa 和 lambda 輕鏈蛋白。Groot Kormelink 等[17]的研究表明，免疫球蛋白 kappa 和 lambda 輕鏈蛋白的表達與乳腺癌腫瘤大小、腫瘤分級、臨床分期和血管侵襲呈顯著正相關。lambda 輕鏈蛋白的表達與乳腺癌特異性生存更差以及無遠處轉移時間更短高度相關。免疫球蛋白輕鏈可以以抗原特異性方式激活肥大細胞。在包括乳腺癌、惡性黑色素瘤等多種腫瘤的周圍都發現了肥大細胞的浸潤，肥大細胞可以募集包括巨噬細胞在內的多種其他炎性細胞，進而參與腫瘤的侵襲和轉移[18-19]。
除了乳腺癌細胞自身分泌的一些促進腫瘤生長的細胞因子以外，骨微環境的其他組成部分在乳腺癌細胞的定植中也發揮了關鍵的作用。如活化的成骨細胞可以上調 TNF 相關激活誘導細胞因子—核因子 κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear κB ligand，RANKL）的表達，而 RANKL 與其受體核因子 κB 受體活化因子（RANK）的結合是破骨細胞活化所必須的[20]。Binder 等[21]在 DEF6 基因缺失的炎性骨溶解小鼠模型中發現，DEF6 缺乏導致腫瘤壞死因子 α（TNF-α）誘導的破骨細胞生成及骨吸收顯著增加。DEF6 通過調節由內源性 RANKL 或 TNF-α 誘導的干擾素-β（IFN-β）介導的自分泌反饋路徑，來抑制關鍵的破骨細胞生成因子—依賴性鈣調神經磷酸酶 1（NFATc1）、B 淋巴細胞誘導成熟蛋白 1（Blimp1）和 c-Fos 的表達。
目前的一些研究[22-24]顯示，ARRB2（又名β-arrestin-2）在腫瘤中的表達與腫瘤的侵襲轉移能力有關。如 Sun 等[25]發現，ARRB2 表達下調與肝癌遠處轉移呈顯著正相關（P=0.024），同時體外研究的結果顯示，ARRB2 的過表達可以降低肝癌細胞的侵襲和遷移能力。此外，過表達的 ARRB2 會導致 E-鈣黏蛋白的表達上調、波形蛋白表達下調和磷脂酰肌醇依賴的激酶 [蛋白激酶 B（Akt）] 活化受抑。近年一項研究[26]也發現，ARRB2 基因表達下調導致趨化因子受體 2（CXCR2）基因表達上調，進而促進非小細胞肺癌患者出現淋巴結轉移。
目前乳腺癌骨轉移的作用機制仍有待進一步探索，特別是骨轉移瘤微環境中免疫抑制的相關機制，未來將會有更多免疫治療反應的潛在作用靶點被發現。本研究通過 WGCNA 方法分析得到與乳腺癌骨轉移密切相關的 magenta 基因模塊，并確定該基因模塊中的 6 個關鍵基因分別是：CD79A、RALGAPA1、IGKC、ARRB2、DEF6 和 IGLV2。以上 6 個關鍵基因在乳腺癌骨轉移中的具體機制仍有待進一步的研究闡釋。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：本研究由賀功建和杜正貴共同設計；資料統計、數據分析、繪圖及論文寫作由賀功建在杜正貴的指導下完成。
