上皮細胞生長因子作用時間對富集結腸癌腫瘤干細胞的影響_《中國普外基礎與臨床雜志》

作者：

吳妮莎 ^1,3 , 周國俊 ^1,2,3 , 徐黎明 ^1,3 , 羅博 ^1,3 , 竇亞軍 ^1,3 , 黃理政 ^1,3 , 侍琳 ^1,3 , 孫成杰 ^1,3 ,  冷政偉 ^1,2,3

1. 川北醫學院附屬醫院肝膽外科二（四川南充 637000）;
2. 川北醫學院附屬醫院腫瘤干細胞研究中心（四川南充 637000）;
3. 川北醫學院轉化醫學中心（四川南充 637000）;

關鍵詞：

結直腸癌腫瘤干細胞無血清懸浮培養時間上皮細胞生長因子

DOI：

10.7507/1007-9424.201911124

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摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

目的探討在上皮細胞生長因子（EGF）作用下，用懸浮培養法富集結腸癌腫瘤干細胞的最佳培養時間。方法在含 20 ng/mL EGF 的無血清培養基中，懸浮培養人結腸癌 DLD-1 細胞獲取球細胞，設置時間梯度為 10 d、20 d、30 d 及 40 d。采用流式細胞術（FCM）檢測球細胞中 CD133⁺、CD44⁺和 CD133⁺CD44⁺細胞的比例；采用成球實驗和有限稀釋法檢測細胞球的自我更新能力，平板克隆形成實驗檢測細胞體外成瘤能力。結果流式細胞術檢測結果顯示：30 d 組球細胞中 CD133⁺及 CD133⁺CD44⁺ 細胞的比例較其他組明顯增多（均 P<0.05），其CD44⁺細胞的比例高于 20 d 組（P<0.05），但與另外 2 組的差異無統計學意義（P>0.05）。有限稀釋法和平板克隆形成實驗中，30 d 組或 40 d 組的數量最高，2 組比較差異無統計學意義（P >0.05），30 d 組與 10 d 及 20 d組比較差異均有統計學意義（均P<0.05）。成球實驗中，30 d 組細胞球自我更新能力較其他組明顯增強（均P<0.05）。結論在 20 ng/mL EGF 懸浮培養 30 d 可最大效率地富集結腸癌 DLD-1 腫瘤干細胞。

引用本文： 吳妮莎, 周國俊, 徐黎明, 羅博, 竇亞軍, 黃理政, 侍琳, 孫成杰, 冷政偉. 上皮細胞生長因子作用時間對富集結腸癌腫瘤干細胞的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(8): 959-963. doi: 10.7507/1007-9424.201911124 復制

近年來，結腸癌發病率急劇上升，死亡率及新發病率均居所有腫瘤中的第 3 名^[1]，耐藥、轉移復發是導致患者死亡的主要原因^[2]。研究^[3-4]發現，腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）對化療藥物具有耐藥性，具有表型和功能上的異質性和極高的致瘤性，在結直腸癌的轉移和復發中起著重要的作用。但 CSCs 在腫瘤中所占的比例非常小^[5]。結直腸 CSCs 是一種具有自我更新、無限分裂和多向分化潛能的腫瘤細胞亞群，由一組細胞表面標志物定義，如 CD44、CD133^[6]。CSCs 學說^[7]認為，腫瘤細胞能通過無血清懸浮培養得到腫瘤細胞球，但在實際操作中，能夠經歷長期傳代的腫瘤細胞球數目少，懸浮細胞篩選時間的長短影響細胞球的克隆性^[8-9]。許多研究者^[10-13]在球細胞懸浮培養時，采用時間為 7～14 d 不等，但目前尚未有文獻報道對懸浮培養時間進行系統性研究。有研究^[14-15]表明，20 ng/mL 的上皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）可有效富集 CSCs，但是目前尚未有文章探討在此濃度下的最佳富集時間。本研究旨在探討在 20 ng/mL EGF 的無血清培養基中懸浮培養不同時間后形成的球細胞中結腸癌 CSCs 比例變化以及其自我更新和侵襲轉移能力變化。以期篩選出最佳的 CSCs 培養時間，為后期腫瘤發病機制的研究及臨床靶向 CSCs 的治療提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人結腸癌 DLD-1 細胞購自美國 ATCC 公司，DMEM/F12 培養基、1640 培養基及胎牛血清均購自美國 Hyclone 公司，EGF 購自美國 PeproTech 公司，胰島素購自美國 Sigma 公司，牛血清白蛋白購自美國 Amresco 公司，B27 購自美國 Invitrogen 公司，CD44-APC 和 CD133-PE 及相應同型對照流式抗體來自美國 Thermo Fisher Scientific 公司，Human Fc Receptor Binding inhibitor buffer 購自美國 eBioscience 公司，結晶紫購自 Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 球細胞的懸浮培養及實驗分組

以 DMEM/F12 為基礎，向其中加入終濃度為 20 ng/mL EGF、5 μg/mL 胰島素、0.4% 牛血清白蛋白（BSA）、2% B27 細胞培養添加劑、100 U/mL 青霉素以及 0.1 mg/mL 鏈霉素配制無血清懸浮培養培養基（SFM）。向處于對數生長期、貼壁培養的 DLD-1 細胞中加入 DMEM/F12 培養基饑餓培養 24 h。消化收集 DLD-1 細胞，以 2×10⁶個/mL 的細胞密度懸浮培養于 SFM 中，隔日吹打細胞并加入 SFM 2 mL，培養至目的時間消化收集細胞行后續實驗。設置的培養時間分別為 10 d、20 d、30 d 和 40 d，其組別分別為 10 d 組、20 d 組、30 d 組和 40 d 組。

1.2.2 流式細胞術檢測 DLD-1 細胞表面標志物表達

流式細胞術檢測 DLD-1 細胞表面 CD44⁺、CD133⁺及 CD44⁺CD133⁺表達，完全按照說明書操作：取 5×10⁵ 個經胰酶消化、PBS 單個懸浮的球細胞，PBS 漂洗 2 次，向其中加入封閉液（pH 為 7.2 的 PBS，含 2% FBS 和 0.4% BSA），4 ℃ 封閉 l h，離心棄上清（1 500 r/min，5 min，離心半徑 13.7 cm），加入 25 μL 封閉液及相應的 CD133⁺、CD44⁺ 和 CD133⁺CD44⁺抗體各 1.25 μL，4 ℃ 避光孵育 30 min，再次離心（1 500 r/min，5 min，離心半徑 13.7 cm），丟棄上清液，以 500 μL PBS 懸浮，使用 BD FACS Verse 流式細胞儀檢測。

1.2.3 有限稀釋法（limited dilution method，LDA）計算腫瘤干細胞比例

10 d 組、20 d 組、30 d 組和 40 d 組分別以每孔不同細胞個數（4、2、1、0.5 個細胞/孔）接種于 96 孔板中培養 14 d 后，有球細胞生長為陽性，計算陽性孔比例。

1.2.4 平板克隆形成實驗

取每組 500 個細胞，用含 10% FBS 的 1640 培養基貼壁培養于 6 孔板中，15 d 后用結晶紫乙醇溶液染色，在顯微鏡下計數形成克隆的數量，然后進行統計學分析。

1.2.5 成球實驗（sphere-forming assay）

取各組的球細胞各 100 個，用相應組的培養基 1 mL，懸浮培養于 24 孔板，分別在培養后第 15 d 時計數球細胞個數，并行統計學分析。

1.3 統計學方法

應用 SPSS 21.0 統計軟件進行分析。正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用配對樣本 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。

2 結果

2.1 流式細胞術檢測結果

結果見圖 1a-圖 1g。由圖 1a-圖 1g 可見，10 d 組、20 d 組、30 d 組和 40 d 組細胞中 CD133⁺ 細胞比例分別為（2.470±0.149）%、（2.277±0.047）%、（6.053±0.112）% 和（2.050±0.235）%，4 組間比較差異有統計學意義（F=0.994，P<0.05）；30 d 組 CD133⁺細胞比例分別高于 10 d 組、20 d 組和 40 d 組，其差異均有統計學意義（t=33.210、t=53.650、t=26.600，均 P<0.05），10 d 組與 20 d 組及 10 d 組與 40 d 組以及 20 d 組與 40 d 組比較差異均無統計學意義（t=0.099、t=0.059、t=0.177，均 P>0.05）。10 d 組、20 d 組、30 d 組和 40 d 組細胞中 CD44⁺細胞比例分別為（20.553±3.572）%、（14.013±1.544）%、（24.870±1.946）% 和（26.083±4.615）%，4 組間比較差異有統計學意義（F=8.874，P<0.05）；20 d 組 CD44⁺細胞比例分別低于 10 d 組、30 d 組和 40 d 組，其差異均有統計學意義（t=2.911、t=7.569、t=4.296，均 P<0.05），10 d 組與 30 d 組、10 d 組與 40 d 組以及 30 d 組與 40 d 組比較差異均無統計學意義（t=1.838、t=1.641、t=0.420，均 P>0.05）。10 d 組、20 d 組、30 d 組和 40 d 組細胞中 CD133⁺CD44⁺ 細胞比例分別為（0.387±0.091）%、（0.353±0.047）%、（0.950±0.053）% 和（0.407±0.061）%，4 組間比較差異有統計學意義（F=57.230，P<0.05）；30 d 組 CD133⁺CD44⁺細胞比例分別高于 10 d 組、20 d 組和 40 d 組，其差異均有統計學意義（t=9.289、t=14.570、t=11.640，均 P<0.05），10 d 組與 20 d 組、10 d 組與 40 d 組以及 20 d 組與 40 d 組比較差異均無統計學意義（t=0.564、t=0.317、t=1.196，均 P>0.05）。

圖1 示流式細胞術檢測細胞表面標志物 CD44⁺、CD133⁺及 CD44⁺ CD133⁺細胞表達結果及懸浮培養的球細胞有限稀釋法實驗結果

a–d：分別為流式細胞術檢測培養 10 d、20 d、30 d 及 40 d 組的 CD44⁺CD133⁺細胞表達結果；e–g：分別為流式細胞術檢測的 CD44⁺細胞、CD133⁺細胞及 CD133⁺CD44⁺細胞比例結果；h：有限稀釋法實驗結果；P 值表示與 30 d 組比較的結果

圖選項

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下載幻燈片

2.2 有限稀釋法實驗結果

經過 3 次重復實驗后，有球細胞的孔數比例分別如下：10 d 組為（0.127±0.021）%，20 d 組為（0.213±0.025）%，30 d 組為（0.387±0.035）%，40 d 組為（0.390±0.079）%；兩兩比較分析后，10 d 組與 20 d 組以及 30 d 組與 40 d 組比較其差異均無統計學意義（P=0.080、P=0.963），30 d 組分別與 10 d 組和 20 d 組比較，其差異有統計學意義（P=0.009、P=0.010）。具體見圖 1h。

2.3 平板克隆形成實驗結果

結晶紫染色后記數平板克隆細胞數量，培養 10 d、20 d、30 d 及 40 d 組的細胞數量分別為（31.000±8.000）個、（25.667±5.859）個、（60.667±10.017）個和（54.000±7.000）個。30 d 組的平板克隆數量最多，與 10 d 組和 20 d 組比較差異有統計學意義（P=0.005、P=0.019），但與 40 d 組比較，差異無統計意義（P=0.063），見圖 2a-圖 2e。

圖2 示懸浮培養的球細胞的平板克隆形成結果和成球實驗檢測結果

a–d：分別示懸浮培養 10 d、20 d、30 d 及 40 d 的平板克隆細胞（結晶紫染色）；e：平板克隆形成實驗細胞數；f–i：分別示成球實驗檢測懸浮培養 10 d、20 d、30 d 及 40 d 的球細胞結果（放大倍率 12.6，標尺=50 μm）；j：成球實驗檢測的球細胞數；P 值表示與 30 d 組比較的結果

圖選項

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2.4 成球實驗檢測結果

培養 10 d、20 d、30 d 及 40 d 組細胞球數分別為（24.000±3.646）個、（26.000±6.245）個、（51.333±1.528）個和（27.000±5.568）個，各組間比較差異有統計學意義（F=23.660，P<0.05）；30 d 組細胞球數分別高于 10 d 組、20 d 組和 40 d 組，其差異均有統計學意義（t=12.500、t=6.825、t=7.300，均 P<0.05），10 d 組與 20 d 組、10 d 組與 40 d 組以及 20 d 組與 40 d 組比較差異均無統計學意義（t=0.485、t=0.792、t=0.207，均 P>0.05）。見圖 2f-圖 2j。

3 討論

CSCs 是腫瘤組織中存在的一小部分具有無限自我更新能力，并可產生不同分化程度腫瘤細胞的細胞群，它是惡性腫瘤發生、發展、復發、轉移及耐藥的根本原因^[16]。CSCs 的調控機制及相關治療靶點是目前腫瘤研究領域的熱點，但 CSCs 在腫瘤中所占的比例非常小^{[5, 17]}，因此獲取足夠 CSCs 進行后續研究非常困難。目前科學家主要通過檢測細胞表面標志物或表型（如 CD133、CD44、CD166、EpCAM、Lgr5、SP 等）^[18-20]，運用流式細胞術分選或磁珠分選獲取 CSCs。但是，以上兩種方法只能獲取表達特定表面標志或表型的 CSCs，而不能獲得表達其他標志或表型的 CSCs；另外，由于 CSCs 過于稀少，分選過程耗時較長，所獲得細胞活性也較低，從而影響后續研究。無血清懸浮培養是將腫瘤細胞培養于添加各種生長因子的無血清培養基中，成本低、操作簡單、能夠富集所有表型的 CSCs，是 CSCs 研究的細胞模型，也可以用于流式細胞或磁珠分選的前期處理，在一定程度上解決分選過程中的技術難題。

由于無血清培養去除了血清和細胞貼壁 2 個細胞分化的必要條件，所以只有具備干細胞特性的 CSCs 可以在這種培養條件中長期存活并自我更新。例如，有前期研究發現乳腺癌^[21]、惡性神經系統腫瘤^[22-23]、結腸癌^[24]等腫瘤細胞在僅含有 EGF 的無血清培養基中，大部分已分化的腫瘤細胞不耐受無血清環境在數天內死亡，而極少部分未分化的 CSCs 可生存并形成細胞球懸浮生長，這些細胞球富含 CSCs，消化后可在含血清培養基中再次被誘導分化為相應的腫瘤細胞，且具有相同的腫瘤特性。更多的研究是通過向無血清培養基中添加 EGF 和 bFGF 培養大約 14 d 時間以富集 CSCs^{[11, 13]}，但并未進行系統研究以獲得實驗室數據支持，且未對 EGF 或 bFGF 單獨富集 CSCs 的效力及最佳培養時間進行研究，對其相關機制研究不明。

因此，本研究以添加 EGF 為基礎的無血清培養基為基礎，培養不同時間，研究無血清懸浮培養對結腸癌 CSCs 富集效率的影響。本研究發現，含有 20 ng/mL EGF 的無血清培養基，此濃度的培養基對 CSCs 球的生長速度、形成狀態和形成時間均為有利。在本研究中，大部分已分化的 DLD-1 細胞不能形成細胞球，并在 l～2 d 內凋亡崩解，而少數細胞以“出芽”方式逐漸由單個細胞形成細胞球，時間在 3～5 d，第 2 代細胞球形成時間要比第 1 代快且形態規則。隨著培養時間的延長，發現其細胞具有可不斷自我更新、增殖并分化的生物學特性，但連續傳代研究發現，約 26%的懸浮腫瘤球細胞經消化傳代后可形成新的腫瘤球^[25]，但僅有不到 6%的懸浮細胞可以連續傳代 6 代以上^[26]，這意味著培養早期形成的細胞球，很多來自于快速增殖腫瘤細胞而非真正的腫瘤干細胞，因此代數較早的球細胞可能并不適用于腫瘤干細胞的研究。本實驗采用 20 ng/mL EGF 的無血清培養基，懸浮培養得到不同時間段的結腸癌細胞球，培養 30 d 組 CSCs 的分子特性明顯強于培養 10 d 組、20 d 組和 40 d 組；有限稀釋法及成球實驗檢測結果表明培養 30 d 組的球細胞腫瘤干細胞比例最高，自我更新能力強于其余組；平板克隆形成實驗結果表明培養 30 d 組的球細胞體外成瘤能力強于培養 10 d 組、20 d 組和 40 d 組。所以，我們認為采用 20 ng/mL EGF 懸浮培養富集腫瘤干細胞的最佳時間應為 30 d。

Manupati 等^[27]通過抑制表皮生長因子受體信號的轉導，發現可以抑制乳腺癌干細胞的 EMT 過程、增強對抗癌藥物的反應，其機制是 EGFR 下游信號通路如 Akt 等受到抑制。De Angelis 等^[28]研究發現，EGF 可能是通過 EGFR 信號通路增強腫瘤干細胞的干細胞特性。Xu 等^[29]也表示 EGF 可以通過 EGF 信號通路調控腫瘤干細胞的增殖、凋亡以及 EMT 過程。同時，Ding 等^[30]研究表示，EGF 可通過調節 PTEN/PI3K/AKT 通路來抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞增殖。Lee 等^[31]表示 EGF 也可通過 EGFR-AKT-mTOR 信號通路影響腫瘤細胞的轉移，耐藥等特性。關于 EGF 與腫瘤干細胞之間的作用機制，仍未有統一結論，可能是多種機制多條信號通路參與的復雜生物學過程。

本研究只使用一種細胞系且未對 EGF 的濃度選擇進一步研究，未進一步進行體內成瘤實驗的研究，且未對 EGF 在富集腫瘤干細胞中的作用機制進行深入研究，以上問題均需要更進一步深入探討。綜上所述，培養 30 d 組的懸浮微細胞球，在懸浮生長過程中更表現出了干細胞自我更新、無限增殖和分化能力的生物學特性，比培養 10 d 組、20 d 組和 40 d 組更能接近 CSCs。故培養 30 d 組能有效地富集結腸癌 CSCs。筆者所在研究團隊將在本研究基礎上對培養時間和生長因子濃度做進一步探討，不斷優化無血清懸浮培養技術，為深入研究結直腸癌 CSCs 分子機制奠定技術基礎。

重要聲明

利益沖突聲明：本研究無任何利益沖突。

作者貢獻聲明：吳妮莎：文章撰寫，實驗統籌管理；周國俊、徐黎明、羅博：流式細胞術、成球實驗、LDA、平板克隆形成實驗的操作；竇亞軍、黃理政：實驗數據分析，圖片采集，相關文獻的查詢。侍琳、孫成杰：細胞培養，實驗數據分析。冷政偉：課題的設計，文章撰寫、修改。