引用本文： 龔辰, 王海清, 馮燮林, 劉愛祥, 張麗霞, 李磊, 薄文滔, 胡勇, 張明儀, 張輝, 田浪, 唐小麗. TERT 啟動子突變及其 mRNA 表達對肝細胞癌患者根治術后預后的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(8): 950-958. doi: 10.7507/1007-9424.201911030 復制
肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一[1]，也是我國 60 歲之前男性因癌致死的主要原因[2]。近年來隨著肝癌的早期診斷技術和手術技術的不斷提高，使得 HCC 肝切除患者的長期生存率顯著提高，但肝癌患者術后的 1 年復發率可達 25%，5 年復發率超過 60%[3]，因而肝癌患者的術后生存情況仍不樂觀。近年研究[4]發現，端粒酶是控制細胞分化增殖的重要調控因子，端粒酶異常激活，細胞就有可能出現無序增殖進而引發癌變，而端粒酶逆轉錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）是端粒酶的核心組成部分，是端粒酶活性的限速酶，對端粒酶的活性起關鍵作用。TERT 通常在自我更新的細胞（如干細胞）中表達活躍，而在成體細胞中少有表達，但在各類實體癌細胞中 TERT 也被發現廣泛表達[5]，究其原因可能是 TERT 啟動子的突變誘發了 TERT 的高表達，進而引發腫瘤。有研究[6]表明，在肝細胞癌中 TERT 啟動子的突變率可高達 59%。本研究的目的就是通過分析 HCC 患者的 TERT 啟動子突變情況和 TERT mRNA 表達水平與患者臨床病理學特征的關系，探討 TERT 啟動子突變是否影響肝癌患者術后的預后。
1 資料和方法
1.1 研究對象
本研究回顧性收集了 2009 年 1 月至 2016 年1 月期間在電子科技大學附屬腫瘤醫院進行 HCC 根治性切除術患者的病例資料，總共納入了 212 例患者進行研究。患者的納入和排除標準如下：① 病理學檢查證實的 HCC 患者；② 納入的患者必須同時有病理證實的肝硬變（Ishak 評分≥5）；③ 納入的患者必須為初次行肝癌根治性切除術的患者，排除復發后再次手術者；④ 納入的患者必須為根治性肝切除（判斷標準：肝癌患者無遠處轉移，無門靜脈主干、肝靜脈以及其他大血管侵犯；完全切除腫瘤；病理學檢查證實切緣無肝癌細胞殘留）。排除標準：① 遠處轉移、淋巴結轉移以及侵犯大血管（門靜脈主干、肝靜脈以及其他大血管）的患者；② 接受射頻消融及無水乙醇治療的患者；③ 無完整冰凍組織病理學檢查結果或無法隨訪的患者。212 例患者中，男 167 例（78.8%），女 45 例（21.2%）；年齡 27～75 歲、（53±11）歲；病因：HBV 感染 187 例 [占 88.2%，其中乙肝病毒載量（HBV-DNA）>1 000 copies/mL 60 例]，HCV 感染4 例（1.9%）；Child-Pugh 分級：A 級 199 例（93.9%），B 級 13 例（6.1%）；巴塞羅那分期（BCLC 分期）：0 期 13 例（6.1%），A 期 145 例（68.4%），B 期 42 例（19.8%），C 期 12 例（5.7%）；分化程度：高分化 3 例（1.4%），中分化 183 例（86.3%），低分化 26 例（12.3%）；單發 166 例（78.3%），多發 46 例（21.7%）；解剖性肝切除 97 例（45.8%）。
1.2 患者管理及隨訪
所有患者均由同一手術團隊進行管理，并在術前進行了全面的體格檢查和常規實驗室檢查。患者術后每 3 個月進行 1 次隨訪以監測 HCC 的復發和轉移。隨訪包括超聲檢查、計算機斷層掃描或磁共振成像及甲胎蛋白（AFP）檢測。本組患者的末次隨訪時間是 2018 年 3 月 31 日。總生存時間（overall survival，OS）為手術日期至死亡日期或末次隨訪日期，無瘤生存時間（disease-free survival，DFS）為手術日期至腫瘤復發日期或末次隨訪日期。所有患者均獲訪，隨訪時間 1～63 個月，中位數為 20 個月。截至隨訪結束，有 56 例患者存活，97 例患者未復發。
1.3 主要試劑及儀器
主要試劑：組織 DNA 提取試劑盒（德國 QIAGEN 公司）、多重 PCR 試劑盒（德國 QIAGEN 公司）、RNA 提取試劑（北京百泰克公司）、第一鏈 cDNA 合成試劑盒（上海賽默飛世爾科技公司）和熒光定量 PCR 試劑盒（德國 QIAGEN 公司）；主要儀器：DU-730 紫外/可見分光光度計（美國 BECKMAN 公司）、熒光定量 PCR 儀（美國 ABI 公司）和高速冷凍離心機（美國 Sigma 公司）。
1.4 TERT、腫瘤蛋白 p53（TP53）和 β-連環蛋白（CTNNB1）基因突變檢測
所有腫瘤冰凍標本均由電子科技大學附屬腫瘤醫院病理科收集，患者術后取腫瘤組織進行快速冰凍保存，其后進行突變檢測。① DNA 提取：使用組織 DNA 提取試劑盒，DNA 提取后保存于–20 ℃備用。② PCR 擴增：使用多重 PCR 試劑盒，擴增引物見表 1。TP53 和 CTNNB1 基因的擴增循環條件：95 ℃ 初始熱活化，94 ℃ 變性，于 65 ℃ 和 50 ℃ 中退火，72 ℃ 延期，循環 25～40 個循環，最后在 60 ℃ 中擴展；TERT 基因的擴增循環條件：95 ℃ 初始熱活化，94 ℃ 變性，60 ℃ 退火，72 ℃ 延期，循環 35 個循環，最后在 60 ℃ 中擴展。③ 突變檢測：檢測 DNA 濃度（≥20 ng/μL）和純度（A260/A280在 1.6～1.8 之間，A 為吸光度值）合格后，用 Sanger 測序法檢測 TERT、TP53 以及 CTNNB1 基因突變。
表1
待檢測突變基因的擴增引物
1.5 TERT mRNA 的表達檢測
TERT mRNA 的表達檢測步驟為：① RNA 提取，使用北京百泰克公司試劑，提取后使用 DU-730 紫外可見分光光度計檢測提取液的濃度及純度，濃度≥100 ng/μL 和純度 A260/A280>1.9 為合格；② RNA 逆轉錄，使用 Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis kit 進行逆轉錄；③ TERT mRNA 的表達水平檢測，試劑盒使用 Quanti NovaTM SYNR? Green PCR Kit，用 SYBR 法定量 PCR 檢測 TERT mRNA 的表達水平。操作均按試劑盒說明書進行。
1.6 統計學方法
所有統計分析均使用 SPSS 17.0 版統計軟件進行分析。患者的計數資料采用均數±標準差（
±s）或中位數（范圍）表示；服從正態分布計量資料的統計方法采用成組 t 檢驗，否則使用 Mann-Whitney U 或 Kruskal-Wallis H 檢驗。計數資料以例數（百分比）表示，并使用成組 χ2 檢驗或 Fisher 精確檢驗進行組間比較（非等級資料），等級資料采用秩和檢驗。非侵入性指標的診斷價值用接受者操作特征曲線（ROC）分析，最佳臨界值用 ROC 曲線下面積（AUC）來評估，最大靈敏度和特異度之和與 1 的差值，即為 Youden 指數[7]。累積總體生存率和無瘤生存率使用 Kaplan-Meier 方法計算，并通過對數秩檢驗進行統計學分析；Cox 比例風險模型用于 OS 和 DFS 的單因素和多因素分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 TERT 啟動子突變與患者臨床病理學特征的關系
通過對 212 例 HCC 患者的基因 PCR 產物進行測序分析，結果顯示（圖 1），3 種基因突變均有出現，其中 TERT 啟動子的突變率為 17.9%（38/212），TP53 基因的突變率為 40.1%（85/212），CTNNB1 基因的突變率為 13.7%（29/212）。TERT 啟動子突變與患者臨床病理學特征關系的分析結果表明，TERT 啟動子突變組和 TERT 啟動子未突變組的 Child-Pugh 分級（P=0.015）和術前白蛋白水平（P=0.038）不同，差異均有統計學意義；但 TERT 啟動子突變與 TERT mRNA 的表達水平、TP53 基因突變和 CTNNB1 基因突變均無關（P>0.05）；與肝癌患者的其他臨床病理學特征無關（P>0.05），包括性別、年齡、HBV 感染、HBV-DNA 載量、HCV 感染、術前 APF 水平，術前 AST 水平、術前 ALT 水平、術前血小板計數、肝切除體積、BCLC 分期、分化程度、術中出血量、輸血情況、微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）、腫瘤數量、手術方式、并發癥和腫瘤直徑（表 2）。
圖1
示 TERT 啟動子、TP53 基因和 CTNNB1 基因 PCR 產物的測序分析結果
a：TERT 啟動子突變位點為距 ATG 翻譯起始位點上游 –124 位的 G>A 突變；b：TP53 基因的突變形式為 G>C 突變；c：CTNNB1 基因的突變形式為 T>C 突變；黑箭指示突變的具體位點
表2
TERT 啟動子突變及 TERT mRNA 表達與患者臨床病理學特征的關系
2.2 TERT mRNA 表達水平與患者臨床病理學特征的關系
本組患者的 TERT mRNA 表達水平值的中位數為 0.007 812 5（范圍為 0.000 006 9～0.500 000 0），通過 ROC 曲線分析 TERT mRNA 表達水平預測腫瘤復發的最佳臨界值為 0.010 8（AUC=0.599，P=0.013，靈敏度=0.412，特異度=0.904，Youden 指數=0.316），據此將 TERT mRNA 表達分為高表達和低表達 2 組。分析結果表明，TERT mRNA 的表達與 HBV 感染（P=0.046）、Child-Pugh 分級（P=0.003）、術前 AST 水平（P=0.002）和 ALT 水平（P=0.008）相關；而與其他臨床病理學特征無關（P>0.05），包括性別、年齡、HBV-DNA 載量、HCV 感染、術前 APF 水平、術前白蛋白水平、術前血小板計數、肝切除體積、BCLC 分期、分化程度、術中輸血量、輸血情況、MVI、腫瘤數量、手術方式、并發癥、腫瘤直徑、TP53 基因突變及 CTNNB1 基因突變（表 2）。
2.3 OS 影響因素的單因素和多因素分析
單因素分析結果表明：非解剖性肝切除、腫瘤直徑>5 cm 和 TERT mRNA 高表達是影響 OS 的因素（表 3）。根據專業知識和單因素分析結果，將患者性別、年齡、HBV 感染、Child-Pugh 分級、BCLC 分期、MVI、肝癌分化程度、術前 AFP 水平、術前 AST 水平、術前 ALT 水平、術前白蛋白水平、術前血小板計數、手術方式、肝切除體積、腫瘤直徑、并發癥、TP53 基因突變、CTNNB1 基因突變、TERT 啟動子突變及 TERT mRNA 表達納入 Cox 風險比例回歸模型分析，結果表明：非解剖性肝切除 ［HR=2.22，95%CI 為（1.28，3.85）］、腫瘤直徑>5 cm ［HR=2.06，95%CI 為（1.19，3.55）］ 和 TERT mRNA 高表達 ［HR=5.74，95%CI 為（3.20，10.30）］ 仍是影響 OS 的獨立危險因素（圖 2 和表 4）。
圖2
示不同 TERT 啟動子突變及 TERT mRNA 表達情況患者的 OS 和 DFS 曲線
a：TERT 啟動子突變與未突變患者的 OS 曲線；b：TERT 啟動子突變與未突變患者的 DFS 曲線；c：TERT mRNA 高表達與低表達患者的 OS 曲線；d：TERT mRNA 高表達與低表達患者的 DFS 曲線
表3
OS 和 DFS 影響因素的單因素分析結果
表4
OS 和 DFS 影響因素的多因素分析結果
2.4 DFS 影響因素的單因素和多因素分析
單因素分析結果表明：術前血小板計數>100×109/L、術前 AST 水平>40 U/mL、腫瘤直徑>5 cm 和 TERT mRNA 高表達是影響 DFS 的影響因素（表 3）。根據專業知識和單因素分析結果，將患者性別、年齡、HBV 感染、Child-Pugh 分級、BCLC 分期、MVI、肝癌分化程度、術前 AFP 水平、術前 AST 水平、術前 ALT 水平、術前白蛋白水平、術前血小板計數、手術方式、肝切除體積、腫瘤直徑、并發癥、TP53 基因突變、CTNNB1 基因突變、TERT 啟動子突變以及 TERT mRNA 表達納入 Cox 比例風險回歸模型，結果表明：血小板計數>100×109/L ［HR=0.62，95%CI 為（0.41，0.94）］ 是 DFS 的保護因素，腫瘤直徑>5 cm ［HR=1.91，95%CI 為（1.26，2.90）］ 和 TERT mRNA 高表達 ［HR=1.79，95%CI 為（1.14，2.83）］ 是影響 DFS 的危險因素（表 4和圖 2）。
3 討論
近年來 TERT 和腫瘤的相關性已經被越來越多的人認識到，但其在腫瘤中的表達和作用機制還不是太明確。有研究[9]表明，TERT 啟動子、TP53 基因及 CTNNB1 基因突變在腫瘤早期普遍存在（發生率>85%），而其中 TERT 啟動子突變和拷貝數變化才是影響癌癥發生的核心。對于感染了 HBV 的漢族 HCC 患者，TERT 啟動子突變是他們的常見體細胞突變，在 AFP 水平低的人群中檢測 TERT 啟動子突變可能有助于診斷非典型肝癌[10-11]。因此，本研究著眼于 TERT 基因和表達兩方面，分析了 TERT 啟動子突變和 TERT mRNA 表達與肝癌患者臨床病理學特征的關系，結果發現，TERT 啟動子突變并不影響 TERT mRNA 的表達以及其他常見基因的突變，TERT 啟動子突變與患者的臨床預后的聯系也并不緊密，而 TERT mRNA 的表達水平卻與患者的臨床預后有相關性，這可能是我們以后評估抗腫瘤治療和腫瘤復發有價值的標志物。
在本研究中，首先對 HCC 患者的腫瘤切除組織進行了基因測序，結果 TERT 啟動子的突變率為 17.9%，與其他學者[9]研究所示的癌癥患者中 TERT 啟動子突變率（10.5%）接近。國外的研究[12]報道，亞洲 HCC 患者的 TERT 啟動子突變率約為 42.5%，本研究的突變率與之相比偏低，產生這種差異的原因可能如下。① 與我國的 HBV 高感染率有關。有研究[13-14]表明，HBV 可以整合到 TERT 啟動子序列中，HBV-DNA 在 TERT 啟動子序列中的插入可能是降低 TERT 啟動子突變率的原因之一。② 與飲食習慣有關。有研究[15-16]表明，TERT 啟動子的突變與乙醇、黃曲霉毒素 B1（AFB1）等化學因素的刺激也密切相關。近年來健康飲食的倡導，使人們攝入乙醇和 AFB1 減少，可能導致 TERT 啟動子突變率降低。本研究通過統計分析還發現，TERT 啟動子突變僅與患者的 Child-Pugh 分級和術前白蛋白值相關，說明 TERT 突變與患者的肝功能相關，TERT 啟動子突變患者的肝功能更差。這可能與“雙擊”理論有關，即 TERT 誘導癌癥發生需要 2 次刺激：第 1 次 TERT 啟動子發生突變，第 2 次端粒酶活性和端粒的穩定性繼發性急劇改變[17]。而且有研究[18]顯示，TERT 擴增和 TERT 啟動子中插入 HBV 病毒是解釋端粒酶激活的另一種機制。綜上，TERT 啟動子突變與肝功能相關，而與肝癌發生不直接相關。
通過檢測和統計學分析可知，TERT mRNA 表達水平與 HCC 患者預后的關系為：TERT mRNA 的表達與 HBV 感染、Child-Pugh 分級、術前 AST 值和 ALT 值相關，且影響患者的 OS 和 DFS。有研究[19-20]指出，外周血中人類端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，h-TERT）mRNA 是否表達是影響患者生存時間的因素之一，其表達水平的高低與腫瘤直徑有關，并可以用于評估腫瘤復發和治療情況，其靈敏度似乎比 AFP mRNA 更高。而在實體癌組織中，目前只發現成人神經膠質瘤中 TERT 啟動子突變與 TERT mRNA 表達上調和端粒酶活性高度相關[21]，而肝癌組織中的 TERT 啟動子突變與 TERT 表達之間并不完全統一，它們之間還存在著多種可能機制（如甲基化）相互影響，但肝癌組織中 TERT mRNA 的表達水平與肝癌患者的腫瘤生長情況和生存率是明確相關的[22-23]。這些都和本研究結果相符，究其原因，這可能是由于 TERT mRNA 高表達能影響端粒酶活性，使細胞永生化進而發生癌變[4]，促進腫瘤復發和縮短患者生存期。其次，端粒酶異常激活將導致肝星狀細胞活性增強[24]，肝星狀細胞的活化將使肝炎進一步向肝結節和肝纖維化發展，影響肝功能，引發肝損害，降低肝臟的免疫能力。而對于 HBV 感染的 HCC 患者來說，肝臟免疫能力降低引起的高 HBV DNA 拷貝是影響其 OS 和 DFS 的獨立危險因素[25]。以上結果說明，TERT mRNA 表達水平的高低可能才是我們應該關注的肝癌預后的特征因子。
本研究分析結果表明，影響患者 OS 的因素有非解剖性肝切除、腫瘤直徑>5 cm 及 TERT mRNA 高表達，影響患者 DFS 的因素有術前血小板計數>100×109/L、腫瘤直徑>5 cm 及 TERT mRNA 高表達。肝癌的腫瘤直徑是多種肝癌分期系統的主要考慮因素，腫瘤直徑越大越易誘發腫瘤血管侵犯和多發。已有研究[8]表明，腫瘤直徑>5 cm 的患者行肝癌手術后 5 年生存率低于腫瘤直徑≤5 cm 的患者，所以腫瘤直徑應是影響患者 OS 與 DSF 的因素之一。有研究[26]顯示，非解剖性肝切除會影響術中出血、輸血及腫瘤受壓迫的情況，這些將直接影響患者的術后恢復及并發癥的發生，間接影響患者的機體免疫能力，而機體免疫力的高低是影響術后感染和腫瘤復發的關鍵因素之一[27]，所以非解剖性肝切除與患者的 OS 密切相關。此外，血小板在肝臟病變中發揮著重要的作用，血小板的缺乏會增大患者的出血風險，而且還會影響肝臟的再生。有研究[28]表明，血小板數量的降低可能會影響肝臟的重要代謝途徑，促進肝功能不全。同時血小板影響血管內皮生成，在肝癌的炎癥反應中起關鍵作用，有助于維持肝癌炎癥微環境和毛細血管生成，影響肝癌的預后[29-30]。
綜上，本研究結果表明，TERT 啟動子突變存在于 HCC 患者當中，但它只與患者的肝功能相關，并不能成為預測 HCC 術后患者預后的指標，也不影響患者的 OS 和 DFS；TERT mRNA 表達水平的高低是影響 HCC 患者術后預后的指標，它與患者的 OS 與 DFS 相關，TERT mRNA 可能是 HCC 預后的標志物。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：龔辰、王海清和馮燮林負責臨床研究方案設計；馮燮林、王海清、劉愛祥、張麗霞、李磊、薄文滔、胡勇、張明儀、張輝、田浪和唐小麗參與臨床數據收集、整理與分析；王海清和龔辰負責基因突變和 TERT mRNA 表達檢查及數據收集；馮燮林、張明儀、張麗霞、唐小麗、王海清和龔辰參與對最終結果的討論與分析。
倫理聲明：本研究已通過電子科技大學附屬腫瘤醫院倫理審查委員會的倫理審核批準。
肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一[1]，也是我國 60 歲之前男性因癌致死的主要原因[2]。近年來隨著肝癌的早期診斷技術和手術技術的不斷提高，使得 HCC 肝切除患者的長期生存率顯著提高，但肝癌患者術后的 1 年復發率可達 25%，5 年復發率超過 60%[3]，因而肝癌患者的術后生存情況仍不樂觀。近年研究[4]發現，端粒酶是控制細胞分化增殖的重要調控因子，端粒酶異常激活，細胞就有可能出現無序增殖進而引發癌變，而端粒酶逆轉錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）是端粒酶的核心組成部分，是端粒酶活性的限速酶，對端粒酶的活性起關鍵作用。TERT 通常在自我更新的細胞（如干細胞）中表達活躍，而在成體細胞中少有表達，但在各類實體癌細胞中 TERT 也被發現廣泛表達[5]，究其原因可能是 TERT 啟動子的突變誘發了 TERT 的高表達，進而引發腫瘤。有研究[6]表明，在肝細胞癌中 TERT 啟動子的突變率可高達 59%。本研究的目的就是通過分析 HCC 患者的 TERT 啟動子突變情況和 TERT mRNA 表達水平與患者臨床病理學特征的關系，探討 TERT 啟動子突變是否影響肝癌患者術后的預后。
1 資料和方法
1.1 研究對象
本研究回顧性收集了 2009 年 1 月至 2016 年1 月期間在電子科技大學附屬腫瘤醫院進行 HCC 根治性切除術患者的病例資料，總共納入了 212 例患者進行研究。患者的納入和排除標準如下：① 病理學檢查證實的 HCC 患者；② 納入的患者必須同時有病理證實的肝硬變（Ishak 評分≥5）；③ 納入的患者必須為初次行肝癌根治性切除術的患者，排除復發后再次手術者；④ 納入的患者必須為根治性肝切除（判斷標準：肝癌患者無遠處轉移，無門靜脈主干、肝靜脈以及其他大血管侵犯；完全切除腫瘤；病理學檢查證實切緣無肝癌細胞殘留）。排除標準：① 遠處轉移、淋巴結轉移以及侵犯大血管（門靜脈主干、肝靜脈以及其他大血管）的患者；② 接受射頻消融及無水乙醇治療的患者；③ 無完整冰凍組織病理學檢查結果或無法隨訪的患者。212 例患者中，男 167 例（78.8%），女 45 例（21.2%）；年齡 27～75 歲、（53±11）歲；病因：HBV 感染 187 例 [占 88.2%，其中乙肝病毒載量（HBV-DNA）>1 000 copies/mL 60 例]，HCV 感染4 例（1.9%）；Child-Pugh 分級：A 級 199 例（93.9%），B 級 13 例（6.1%）；巴塞羅那分期（BCLC 分期）：0 期 13 例（6.1%），A 期 145 例（68.4%），B 期 42 例（19.8%），C 期 12 例（5.7%）；分化程度：高分化 3 例（1.4%），中分化 183 例（86.3%），低分化 26 例（12.3%）；單發 166 例（78.3%），多發 46 例（21.7%）；解剖性肝切除 97 例（45.8%）。
1.2 患者管理及隨訪
所有患者均由同一手術團隊進行管理，并在術前進行了全面的體格檢查和常規實驗室檢查。患者術后每 3 個月進行 1 次隨訪以監測 HCC 的復發和轉移。隨訪包括超聲檢查、計算機斷層掃描或磁共振成像及甲胎蛋白（AFP）檢測。本組患者的末次隨訪時間是 2018 年 3 月 31 日。總生存時間（overall survival，OS）為手術日期至死亡日期或末次隨訪日期，無瘤生存時間（disease-free survival，DFS）為手術日期至腫瘤復發日期或末次隨訪日期。所有患者均獲訪，隨訪時間 1～63 個月，中位數為 20 個月。截至隨訪結束，有 56 例患者存活，97 例患者未復發。
1.3 主要試劑及儀器
主要試劑：組織 DNA 提取試劑盒（德國 QIAGEN 公司）、多重 PCR 試劑盒（德國 QIAGEN 公司）、RNA 提取試劑（北京百泰克公司）、第一鏈 cDNA 合成試劑盒（上海賽默飛世爾科技公司）和熒光定量 PCR 試劑盒（德國 QIAGEN 公司）；主要儀器：DU-730 紫外/可見分光光度計（美國 BECKMAN 公司）、熒光定量 PCR 儀（美國 ABI 公司）和高速冷凍離心機（美國 Sigma 公司）。
1.4 TERT、腫瘤蛋白 p53（TP53）和 β-連環蛋白（CTNNB1）基因突變檢測
所有腫瘤冰凍標本均由電子科技大學附屬腫瘤醫院病理科收集，患者術后取腫瘤組織進行快速冰凍保存，其后進行突變檢測。① DNA 提取：使用組織 DNA 提取試劑盒，DNA 提取后保存于–20 ℃備用。② PCR 擴增：使用多重 PCR 試劑盒，擴增引物見表 1。TP53 和 CTNNB1 基因的擴增循環條件：95 ℃ 初始熱活化，94 ℃ 變性，于 65 ℃ 和 50 ℃ 中退火，72 ℃ 延期，循環 25～40 個循環，最后在 60 ℃ 中擴展；TERT 基因的擴增循環條件：95 ℃ 初始熱活化，94 ℃ 變性，60 ℃ 退火，72 ℃ 延期，循環 35 個循環，最后在 60 ℃ 中擴展。③ 突變檢測：檢測 DNA 濃度（≥20 ng/μL）和純度（A260/A280在 1.6～1.8 之間，A 為吸光度值）合格后，用 Sanger 測序法檢測 TERT、TP53 以及 CTNNB1 基因突變。
表1
待檢測突變基因的擴增引物
1.5 TERT mRNA 的表達檢測
TERT mRNA 的表達檢測步驟為：① RNA 提取，使用北京百泰克公司試劑，提取后使用 DU-730 紫外可見分光光度計檢測提取液的濃度及純度，濃度≥100 ng/μL 和純度 A260/A280>1.9 為合格；② RNA 逆轉錄，使用 Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis kit 進行逆轉錄；③ TERT mRNA 的表達水平檢測，試劑盒使用 Quanti NovaTM SYNR? Green PCR Kit，用 SYBR 法定量 PCR 檢測 TERT mRNA 的表達水平。操作均按試劑盒說明書進行。
1.6 統計學方法
所有統計分析均使用 SPSS 17.0 版統計軟件進行分析。患者的計數資料采用均數±標準差（±s）或中位數（范圍）表示；服從正態分布計量資料的統計方法采用成組 t 檢驗，否則使用 Mann-Whitney U 或 Kruskal-Wallis H 檢驗。計數資料以例數（百分比）表示，并使用成組 χ2 檢驗或 Fisher 精確檢驗進行組間比較（非等級資料），等級資料采用秩和檢驗。非侵入性指標的診斷價值用接受者操作特征曲線（ROC）分析，最佳臨界值用 ROC 曲線下面積（AUC）來評估，最大靈敏度和特異度之和與 1 的差值，即為 Youden 指數[7]。累積總體生存率和無瘤生存率使用 Kaplan-Meier 方法計算，并通過對數秩檢驗進行統計學分析；Cox 比例風險模型用于 OS 和 DFS 的單因素和多因素分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 TERT 啟動子突變與患者臨床病理學特征的關系
通過對 212 例 HCC 患者的基因 PCR 產物進行測序分析，結果顯示（圖 1），3 種基因突變均有出現，其中 TERT 啟動子的突變率為 17.9%（38/212），TP53 基因的突變率為 40.1%（85/212），CTNNB1 基因的突變率為 13.7%（29/212）。TERT 啟動子突變與患者臨床病理學特征關系的分析結果表明，TERT 啟動子突變組和 TERT 啟動子未突變組的 Child-Pugh 分級（P=0.015）和術前白蛋白水平（P=0.038）不同，差異均有統計學意義；但 TERT 啟動子突變與 TERT mRNA 的表達水平、TP53 基因突變和 CTNNB1 基因突變均無關（P>0.05）；與肝癌患者的其他臨床病理學特征無關（P>0.05），包括性別、年齡、HBV 感染、HBV-DNA 載量、HCV 感染、術前 APF 水平，術前 AST 水平、術前 ALT 水平、術前血小板計數、肝切除體積、BCLC 分期、分化程度、術中出血量、輸血情況、微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）、腫瘤數量、手術方式、并發癥和腫瘤直徑（表 2）。
圖1
示 TERT 啟動子、TP53 基因和 CTNNB1 基因 PCR 產物的測序分析結果
a：TERT 啟動子突變位點為距 ATG 翻譯起始位點上游 –124 位的 G>A 突變；b：TP53 基因的突變形式為 G>C 突變；c：CTNNB1 基因的突變形式為 T>C 突變；黑箭指示突變的具體位點
表2
TERT 啟動子突變及 TERT mRNA 表達與患者臨床病理學特征的關系
2.2 TERT mRNA 表達水平與患者臨床病理學特征的關系
本組患者的 TERT mRNA 表達水平值的中位數為 0.007 812 5（范圍為 0.000 006 9～0.500 000 0），通過 ROC 曲線分析 TERT mRNA 表達水平預測腫瘤復發的最佳臨界值為 0.010 8（AUC=0.599，P=0.013，靈敏度=0.412，特異度=0.904，Youden 指數=0.316），據此將 TERT mRNA 表達分為高表達和低表達 2 組。分析結果表明，TERT mRNA 的表達與 HBV 感染（P=0.046）、Child-Pugh 分級（P=0.003）、術前 AST 水平（P=0.002）和 ALT 水平（P=0.008）相關；而與其他臨床病理學特征無關（P>0.05），包括性別、年齡、HBV-DNA 載量、HCV 感染、術前 APF 水平、術前白蛋白水平、術前血小板計數、肝切除體積、BCLC 分期、分化程度、術中輸血量、輸血情況、MVI、腫瘤數量、手術方式、并發癥、腫瘤直徑、TP53 基因突變及 CTNNB1 基因突變（表 2）。
2.3 OS 影響因素的單因素和多因素分析
單因素分析結果表明：非解剖性肝切除、腫瘤直徑>5 cm 和 TERT mRNA 高表達是影響 OS 的因素（表 3）。根據專業知識和單因素分析結果，將患者性別、年齡、HBV 感染、Child-Pugh 分級、BCLC 分期、MVI、肝癌分化程度、術前 AFP 水平、術前 AST 水平、術前 ALT 水平、術前白蛋白水平、術前血小板計數、手術方式、肝切除體積、腫瘤直徑、并發癥、TP53 基因突變、CTNNB1 基因突變、TERT 啟動子突變及 TERT mRNA 表達納入 Cox 風險比例回歸模型分析，結果表明：非解剖性肝切除 ［HR=2.22，95%CI 為（1.28，3.85）］、腫瘤直徑>5 cm ［HR=2.06，95%CI 為（1.19，3.55）］ 和 TERT mRNA 高表達 ［HR=5.74，95%CI 為（3.20，10.30）］ 仍是影響 OS 的獨立危險因素（圖 2 和表 4）。
圖2
示不同 TERT 啟動子突變及 TERT mRNA 表達情況患者的 OS 和 DFS 曲線
a：TERT 啟動子突變與未突變患者的 OS 曲線；b：TERT 啟動子突變與未突變患者的 DFS 曲線；c：TERT mRNA 高表達與低表達患者的 OS 曲線；d：TERT mRNA 高表達與低表達患者的 DFS 曲線
表3
OS 和 DFS 影響因素的單因素分析結果
表4
OS 和 DFS 影響因素的多因素分析結果
2.4 DFS 影響因素的單因素和多因素分析
單因素分析結果表明：術前血小板計數>100×109/L、術前 AST 水平>40 U/mL、腫瘤直徑>5 cm 和 TERT mRNA 高表達是影響 DFS 的影響因素（表 3）。根據專業知識和單因素分析結果，將患者性別、年齡、HBV 感染、Child-Pugh 分級、BCLC 分期、MVI、肝癌分化程度、術前 AFP 水平、術前 AST 水平、術前 ALT 水平、術前白蛋白水平、術前血小板計數、手術方式、肝切除體積、腫瘤直徑、并發癥、TP53 基因突變、CTNNB1 基因突變、TERT 啟動子突變以及 TERT mRNA 表達納入 Cox 比例風險回歸模型，結果表明：血小板計數>100×109/L ［HR=0.62，95%CI 為（0.41，0.94）］ 是 DFS 的保護因素，腫瘤直徑>5 cm ［HR=1.91，95%CI 為（1.26，2.90）］ 和 TERT mRNA 高表達 ［HR=1.79，95%CI 為（1.14，2.83）］ 是影響 DFS 的危險因素（表 4和圖 2）。
3 討論
近年來 TERT 和腫瘤的相關性已經被越來越多的人認識到，但其在腫瘤中的表達和作用機制還不是太明確。有研究[9]表明，TERT 啟動子、TP53 基因及 CTNNB1 基因突變在腫瘤早期普遍存在（發生率>85%），而其中 TERT 啟動子突變和拷貝數變化才是影響癌癥發生的核心。對于感染了 HBV 的漢族 HCC 患者，TERT 啟動子突變是他們的常見體細胞突變，在 AFP 水平低的人群中檢測 TERT 啟動子突變可能有助于診斷非典型肝癌[10-11]。因此，本研究著眼于 TERT 基因和表達兩方面，分析了 TERT 啟動子突變和 TERT mRNA 表達與肝癌患者臨床病理學特征的關系，結果發現，TERT 啟動子突變并不影響 TERT mRNA 的表達以及其他常見基因的突變，TERT 啟動子突變與患者的臨床預后的聯系也并不緊密，而 TERT mRNA 的表達水平卻與患者的臨床預后有相關性，這可能是我們以后評估抗腫瘤治療和腫瘤復發有價值的標志物。
在本研究中，首先對 HCC 患者的腫瘤切除組織進行了基因測序，結果 TERT 啟動子的突變率為 17.9%，與其他學者[9]研究所示的癌癥患者中 TERT 啟動子突變率（10.5%）接近。國外的研究[12]報道，亞洲 HCC 患者的 TERT 啟動子突變率約為 42.5%，本研究的突變率與之相比偏低，產生這種差異的原因可能如下。① 與我國的 HBV 高感染率有關。有研究[13-14]表明，HBV 可以整合到 TERT 啟動子序列中，HBV-DNA 在 TERT 啟動子序列中的插入可能是降低 TERT 啟動子突變率的原因之一。② 與飲食習慣有關。有研究[15-16]表明，TERT 啟動子的突變與乙醇、黃曲霉毒素 B1（AFB1）等化學因素的刺激也密切相關。近年來健康飲食的倡導，使人們攝入乙醇和 AFB1 減少，可能導致 TERT 啟動子突變率降低。本研究通過統計分析還發現，TERT 啟動子突變僅與患者的 Child-Pugh 分級和術前白蛋白值相關，說明 TERT 突變與患者的肝功能相關，TERT 啟動子突變患者的肝功能更差。這可能與“雙擊”理論有關，即 TERT 誘導癌癥發生需要 2 次刺激：第 1 次 TERT 啟動子發生突變，第 2 次端粒酶活性和端粒的穩定性繼發性急劇改變[17]。而且有研究[18]顯示，TERT 擴增和 TERT 啟動子中插入 HBV 病毒是解釋端粒酶激活的另一種機制。綜上，TERT 啟動子突變與肝功能相關，而與肝癌發生不直接相關。
通過檢測和統計學分析可知，TERT mRNA 表達水平與 HCC 患者預后的關系為：TERT mRNA 的表達與 HBV 感染、Child-Pugh 分級、術前 AST 值和 ALT 值相關，且影響患者的 OS 和 DFS。有研究[19-20]指出，外周血中人類端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，h-TERT）mRNA 是否表達是影響患者生存時間的因素之一，其表達水平的高低與腫瘤直徑有關，并可以用于評估腫瘤復發和治療情況，其靈敏度似乎比 AFP mRNA 更高。而在實體癌組織中，目前只發現成人神經膠質瘤中 TERT 啟動子突變與 TERT mRNA 表達上調和端粒酶活性高度相關[21]，而肝癌組織中的 TERT 啟動子突變與 TERT 表達之間并不完全統一，它們之間還存在著多種可能機制（如甲基化）相互影響，但肝癌組織中 TERT mRNA 的表達水平與肝癌患者的腫瘤生長情況和生存率是明確相關的[22-23]。這些都和本研究結果相符，究其原因，這可能是由于 TERT mRNA 高表達能影響端粒酶活性，使細胞永生化進而發生癌變[4]，促進腫瘤復發和縮短患者生存期。其次，端粒酶異常激活將導致肝星狀細胞活性增強[24]，肝星狀細胞的活化將使肝炎進一步向肝結節和肝纖維化發展，影響肝功能，引發肝損害，降低肝臟的免疫能力。而對于 HBV 感染的 HCC 患者來說，肝臟免疫能力降低引起的高 HBV DNA 拷貝是影響其 OS 和 DFS 的獨立危險因素[25]。以上結果說明，TERT mRNA 表達水平的高低可能才是我們應該關注的肝癌預后的特征因子。
本研究分析結果表明，影響患者 OS 的因素有非解剖性肝切除、腫瘤直徑>5 cm 及 TERT mRNA 高表達，影響患者 DFS 的因素有術前血小板計數>100×109/L、腫瘤直徑>5 cm 及 TERT mRNA 高表達。肝癌的腫瘤直徑是多種肝癌分期系統的主要考慮因素，腫瘤直徑越大越易誘發腫瘤血管侵犯和多發。已有研究[8]表明，腫瘤直徑>5 cm 的患者行肝癌手術后 5 年生存率低于腫瘤直徑≤5 cm 的患者，所以腫瘤直徑應是影響患者 OS 與 DSF 的因素之一。有研究[26]顯示，非解剖性肝切除會影響術中出血、輸血及腫瘤受壓迫的情況，這些將直接影響患者的術后恢復及并發癥的發生，間接影響患者的機體免疫能力，而機體免疫力的高低是影響術后感染和腫瘤復發的關鍵因素之一[27]，所以非解剖性肝切除與患者的 OS 密切相關。此外，血小板在肝臟病變中發揮著重要的作用，血小板的缺乏會增大患者的出血風險，而且還會影響肝臟的再生。有研究[28]表明，血小板數量的降低可能會影響肝臟的重要代謝途徑，促進肝功能不全。同時血小板影響血管內皮生成，在肝癌的炎癥反應中起關鍵作用，有助于維持肝癌炎癥微環境和毛細血管生成，影響肝癌的預后[29-30]。
綜上，本研究結果表明，TERT 啟動子突變存在于 HCC 患者當中，但它只與患者的肝功能相關，并不能成為預測 HCC 術后患者預后的指標，也不影響患者的 OS 和 DFS；TERT mRNA 表達水平的高低是影響 HCC 患者術后預后的指標，它與患者的 OS 與 DFS 相關，TERT mRNA 可能是 HCC 預后的標志物。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：龔辰、王海清和馮燮林負責臨床研究方案設計；馮燮林、王海清、劉愛祥、張麗霞、李磊、薄文滔、胡勇、張明儀、張輝、田浪和唐小麗參與臨床數據收集、整理與分析；王海清和龔辰負責基因突變和 TERT mRNA 表達檢查及數據收集；馮燮林、張明儀、張麗霞、唐小麗、王海清和龔辰參與對最終結果的討論與分析。
倫理聲明：本研究已通過電子科技大學附屬腫瘤醫院倫理審查委員會的倫理審核批準。
