引用本文： 銀東智, 左健, 袁又能, 左燕妮, 羅海平, 汪燕舞. 白細胞介素-6 及微衛星不穩定在潰瘍性結腸炎相關性結直腸癌中的表達及意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(7): 841-845. doi: 10.7507/1007-9424.201910009 復制
在正常人體中存在一套完整的 DNA 錯配修復（MMR）系統，如果此修復機制出現問題如 MMR 基因發生甲基化、突變或缺失，可以導致 MMR 蛋白表達缺失（dMMR）[1]，繼而出現 DNA MMR 錯誤，出現這些簡單重復序列增多或丟失即微衛星不穩定性（MSI），其結果是子細胞發生突變甚或癌變[2]。因此，可以通過檢測 MMR 蛋白表達是否缺失來確定是否存在 MSI。潰瘍性結腸炎（UC）是一種病因尚不明確、特異性作用于直腸和結腸黏膜、慢性反復發作的炎癥性病變，UC 病程進展過程中可能會癌變即發展成 UC 相關性結直腸癌（UC-CRC）。結直腸癌中大多數呈散發性（非遺傳性）即散發性結直腸癌（SCRC），而少部分有遺傳背景，其中遺傳性非息肉結直腸癌（HNPCC）發病率占到結直腸癌總發病的 3%～5%[3]。有文獻[4]報道，90% 以上的 HNPCC 和 10%～15% 的 SCRC 均與 MSI 有關。另外，有研究[5-6]發現，結直腸癌患者的血清中白細胞介素-6（IL-6）的水平明顯增高可能與 MSI 有關，且這種現象也常見于 UC 的有炎癥黏膜上皮細胞中[7]。由此，在 UC-CRC 的發病過程中 MSI 是否參與其中并起到了怎樣的作用、炎癥因子 IL-6 是否參與了 MSI 的發生等這些問題的研究值得進一步進行探索。歐美等國家對此的相關研究雖然不多，但還是已經積累了一定的經驗，但中國作為亞洲的一個大國，UC-CRC 相關研究資料卻非常欠缺。筆者前期曾對 UC-CRC 患者的臨床病理特點作了分析總結[8]，在本研究擬進一步分析 UC-CRC 患者中的 IL-6 及 MMR 蛋白表達情況并探討 UC 患者癌變過程中 IL-6 及 MSI 所起的作用。
1 資料與方法
1.1 病例納入標準和排除標準
① UC-CRC 納入標準：接受手術治療、術前未接受輔助放化療等治療，結腸鏡活檢和（或）手術后病理檢查明確診斷為結直腸癌且結腸鏡檢查見典型 UC 表現和（或）結腸鏡活檢和術后病理檢查診斷為 UC。② SCRC 納入標準：接受手術治療、術前未接受輔助放化療等治療，病理檢查診斷為結直腸癌，與 UC-CRC 患者同期收治且術后病理檢查示腫瘤分期相同。③ UC 患者的納入標準：與 UC-CRC 患者同期收治且診斷非 UC-CRC、SCRC 的 UC 患者，結腸鏡檢查見典型 UC 表現和（或）結腸鏡活檢和術后病理檢查診斷為 UC。④ 對照組患者的納入標準：納入與 UC-CRC 患者同期且診斷非 UC、UC-CRC、SCRC 患者，按每 1～2 個的病案號列表隨機抽選 1 個，共抽取 30 例作為對照組。
1.2 免疫組織化學方法檢測 hMLH1、hMSH2、hMSH6、hPMS2 及 IL-6 的蛋白表達
1.2.1 主要試劑
小鼠抗人 hMLH1、hMSH2、hMSH6、hPMS2、IL-6 單克隆抗體均購自武漢珈源生物醫學工程有限公司；血清 IL-6 定量檢測試劑盒購自北京熱景生物技術有限公司；EnVision 免疫組織化學檢測試劑盒購自丹麥 Dako 公司。
1.2.2 免疫組織化學染色
操作嚴格按試劑盒說明書進行，常規固定脫水、包埋切片、抗原修復等后依次滴加一抗、二抗、顯色，封片后顯微鏡下觀察。
1.2.3 染色結果判斷
① UC-CRC 及 SCRC 癌組織中 hMLH1、hMSH2、hMSH6、hPMS2 蛋白陽性表達：有絲分裂期的細胞中該抗原標記在染色體和細胞質，除有絲分裂期的細胞外，該抗體標記的陽性細胞顯示為細胞核呈棕黃色染色且背景無染色，組織內預期細胞中未見棕黃色著色為陰性表達；4 種 MMR 蛋白（hMLH1、hMSH2、hMSH6、hPMS2）中若有 1 種及以上表達缺失者則判定為錯配修復基因缺乏（dMMR），若 4 種 MMR 蛋白全部陽性表達則判定為錯配修復基因完整（pMMR）。② IL-6 蛋白陽性表達：抗體標記的細胞顯示細胞漿呈棕黃色著色且背景無染色為陽性表達，組織內預期細胞中未見棕黃色著色為陰性表達。其最終表達強度用半定量分析方法判定，觀察著色強度并評分（細胞未著色 0 分、淡黃色 1 分、棕黃色 2 分、棕褐色3 分）和鏡下隨機觀察 5 個高倍（×400）視野（每個視野計數 100 個細胞）的陽性細胞平均數判定陽性細胞百分率并進行評分（0～5% 為 0 分，6%～25% 為 1 分，26%～50% 為 2 分，51%～75% 為 3 分，>75% 為 4 分），將著色強度評分與陽性細胞百分率評分相乘得到染色指數值，當染色指數值>4 為高表達（陽性或強陽性）、≤4 為低表達（陰性或弱陽性）。由兩名經驗豐富的病理醫生共同做出最終結果判定。
1.2.4 血清 IL-6 定量分析
使用電化學發光免疫分析方法測定對照組、UC 組、UC-CRC 組及 SCRC 組患者的血清 IL-6 水平。
1.3 統計學方法
應用 SPSS 20.0 軟件對數據進行分析。血清 IL-6水平在對照組、UC 組、UC-CRC 組及 SCRC 組間比較采用 t 檢驗；UC-CRC 患者的 hMLH1、hPMS2、hMSH2 和 hMSH6 蛋白缺失情況采用卡方（χ2）檢驗進行相關分析；SCRC 及 UC-CRC 組織中 IL-6 蛋白表達與 MSI 蛋白表達的相關性分析采用 Spearman 等級相關分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 本研究納入患者的基本情況
本研究納入了鄂東醫療集團（包括黃石市中心醫院中心院區及普愛院區、黃石市中醫院）2013 年 1 月至 2019 年 1 月期間收治的 UC-CRC 患者 17 例、SCRC 患者 55 例、UC 患者 43 例，對照組患者 30 例。
2.2 UC-CRC 及 SCRC 組織中 MMR 蛋白表達情況及相關性分析結果
MMR 蛋白 hMLH1、hPMS2、hMSH2 和 hMSH6 在 UC-CRC 患者癌組織中的定性表達情況見圖1a–圖 1h，其在 UC-CRC 和 SCRC 癌組織中的表達情況見表1。在 UC-CRC 和 SCRC 癌組織中 hMLH1 和 hPMS2 共同缺失分別為 2 例（11.8%）和 2 例（3.6%）、hMSH2 和 hMSH6 共同缺失分別為 3 例（17.6%）和 2 例（3.6%），兩種癌組織中 hMLH1 與 hPMS2 蛋白表達缺失、hMSH2 與 hMSH6 蛋白表達缺失均明顯相關（P<0.05），見表 2 和表 3。
圖1
示 MMR（EnVision ×100）、IL-6（EnVision ×200）和 CEA（EnVision ×200）蛋白在 UC-CRC 組織中的表達情況
a：hMLH1（–）；b：hMLH1（+）；c：hMSH2（–）；d：hMSH2（+）；e：hMSH6（–）；f：hMSH6（+）；g：hPMS2（–）；h：hPMS2（+）；i：IL-6（+）；j：CEA（+），可見大量印戒細胞
表1
MMR 蛋白在 UC-CRC 和 SCRC 癌組織中的表達［例（%）］
表2
hMLH1 和 hPMS2 以及 hMSH2 和 hMSH6 在 UC-CRC 癌組織中表達的相關性分析結果（例）
表3
hMLH1 和 hPMS2 以及 hMSH2 和 hMSH6 在 SCRC 癌組織中表達的相關性分析結果（例）
17 例 UC-CRC 癌組織中出現 dMMR 者共 7 例（總缺失率為 41.2%），而 55 例 SCRC 癌組織中出現 dMMR 者占 12 例（總缺失率為 21.8%），二者比較差異無統計學意義（χ2=2.505，P=0.113）。
2.3 IL-6 在 UC-CRC 癌組織中的表達以及 IL-6 與 MMR 蛋白表達的相關性分析結果
IL-6 蛋白在 UC-CRC 的眾多腫瘤細胞漿中呈陽性表達（圖1i），CEA 蛋白表達陽性的 UC-CRC 癌組織中可見大量印戒細胞表達（圖1j）。IL-6 蛋白在 UC-CRC 癌組織中高表達 9 例（52.9%），SCRC 癌組織中高表達 30 例（54.5%），UC-CRC 患者中 7 例 dMMR 者的 IL-6 高表達者 5 例（5/7），10 例 pMMR 者 IL-6 高表達者 4 例（4/10），因 UC-CRC 樣本量較小未進行統計分析，但從初步結果提示，dMMR 可能與 IL-6 有一定的關系；SCRC 癌組織中 MMR 蛋白表達與 IL-6 蛋白表達水平無明顯相關性（rs=0.04，P=0.77），見表4。
表4
UC-CRCS 及 SCRC 癌組織中 IL-6 與 MMR 蛋白表達的相關性分析結果（例）
2.4 各組患者血清中 IL-6 水平
結果見表5。從表5 可見，血清 IL-6 水平在 UC 組明顯高于對照組（t=7.82，P<0.001），在 UC-CRC 組明顯高于 UC 組（t=4.97，P<0.001）及 SCRC 組（t=5.26，P=0.006）。
表5
各組患者血清中 IL-6 水平（
，mg/L）
3 討論
結直腸腫瘤的發生是個遺傳、環境等多種因素相互作用下的多基因改變的復雜過程，常見的途徑之一是 MSI。微衛星是指基因組中一些簡單的、多不超過 10 個核苷酸的重復序列，多為由 2 個核苷酸組成的 10～50 次的重復序列，其基因的多態性由重復序列數量的多少所造成。正常人體中的 DNA MMR 系統是由 MMR 基因編碼的一系列 MMR 蛋白組成，是細胞復制出現異常時的一種保護機制，可識別 DNA 復制過程中出現的錯配堿基并進行水解和修復，從而維持 DNA 復制保真度，預防基因突變[9]。如果此修復機制出現問題，則會出現這些簡單重復序列增多或丟失即 MSI。pMMR 指 MMR 蛋白完整（所有位點均穩定時的情況）或基本完整表達（僅有 1 個位點出現不穩定時的情況）即微衛星穩定或微衛星低度不穩定，dMMR 指 MMR 蛋白明顯缺失（有不少于 2 個位點出現不穩定時的情況）即微衛星高度不穩定[10]。
對結直腸癌標本進行 MMR 蛋白表達檢測可用聚合酶鏈式反應（PCR）和免疫組織化學方法，相對于操作復雜、成本較高的 PCR 技術，免疫組織化學法操作簡便、價格低廉且與 PCR 檢測結果一致率較高[11]，更利于在臨床上開展。因此，本研究用免疫組織化學方法檢測 MMR 蛋白 hMLH1、hMSH2、hMSH6 及 hPMS2 在 UC-CRC 組織中的表達情況。
目前，針對 UC-CRC 的 MSI 研究較少，本研究對此進行研究的結果顯示，在 17 例 UC-CRC 癌組織中出現至少 1 種 MMR 蛋白陰性表達者共 7 例（缺失率為 41.2%），而在 55 例 SCRC 癌組織中出現至少 1 種 MMR 蛋白陰性表達者共 12 例（缺失率為 21.8%），二者在發生 MSI 方面未見明顯差異，提示與 SCRC 類似，MSI 可能也參與了 UC-CRC 的發生及發展過程。在本研究中發現 UC-CRC 組的 hMLH1、hMSH2、hMSH6、hPMS2 蛋白表達缺失率分別為 17.6%、29.4%、23.5%、17.6%，這與歐洲一項結直腸癌的研究結果[12]相似。相關研究[13]發現，每個 DNA 結合的 hMutSα 復合體的信號轉導過程是由 hMutLα 異二聚體（hMLH1-hPMS2）完成的，其中 hMLH1 為主導蛋白，hPMS2 為配對蛋白；而 hMSH6 是 hMSH2 的 G∶T 結合配偶體，它們共同形成 hMutSα 錯配結合復合體（hMSH2-hMSH6），hMSH2 為主導蛋白、hMSH6 為配對蛋白，當主導蛋白 hMSH2 發生突變缺失時，hMSH6 是不穩定的，即可出現兩者的共同缺失，這種情況亦適用于 hMutLα 異二聚體（hMLH1-hPMS2）。在本研究中的結果顯示，hMLH1 和 hPMS2 共同缺失占 11.8%，hMSH2 和 hMSH6 共同缺失占 17.6%，而且 hMLH1 與 hPMS2 蛋白缺失之間、hMSH2 與 hMSH6 蛋白缺失之間均明顯相關，這與 Edelbrock 等[13]的研究結果相吻合。
UC 曾被認為在歐美等國家發病率較高[14]，我國其患病率不高，但近年來發現其在我國的發病率呈快速上升趨勢[15]。UC 被認為可持續增加患者結直腸癌的發病風險，其結直腸黏膜上皮細胞在出現不典型增生或癌變之前就處于炎性變，長期的積累便出現了基因改變[16-20]。氧化應激作用是公認的 UC 和結直腸癌發生基因突變的驅動因素[21-22]。UC 被認為時常處于氧自由基過量的狀態，其中脫顆粒的多形核細胞引起細胞發生 DNA 突變等損傷[23-24]，而多形核細胞能產生某些細胞因子（如 IL-6、TNF-α 等）促進腫瘤的發生、發展和轉移[25-26]；且研究[5-6]發現，結直腸癌患者血清 IL-6 水平明顯增高，IL-6 可能參與了結直腸癌細胞的 MSI 發生，這種現象也常見于 UC 的有炎癥黏膜上皮細胞中[7]。那么 UC 癌變與 IL-6 是否有關？IL-6 是否亦通過誘導 MSI 而導致 UC-CRC 的發生？筆者從 2009 年接觸 UC-CRC，初始時因經驗缺乏，故在臨床診療中遇到了一些問題，然后對其臨床經驗進行了初步總結；從 2012 年開始，有了研究其發病機制的設想，故從 2013 年及以后術前確診或擬診病例我們均常規檢查了包括 IL-6 在內的多個臨床指標。本研究對對照組、UC 組、UC-CRC 組及 SCRC 組患者的血清 IL-6 水平進行分析發現，UC 組患者的血清 IL-6 水平明顯高于對照組（P<0.05），UC-CRC 組明顯高于 UC 組（P<0.05）及 SCRC 組（P<0.05），提示 IL-6 可能與 UC 患者反復炎癥損害及其最終癌變有關。進而本研究嘗試探討了在 SCRC 及 UC-CRC 組織中 IL-6 與 MMR 蛋白表達的關系，未發現 SCRC 癌組織中 MMR 與 IL-6 有關，不能確切明確 IL-6 參與了結直腸癌的 MSI 相關癌變機制；對于 UC-CRC，因其樣本量較少未進行統計學分析，但根據 UC-CRC 癌組織 dMMR 者中出現 IL-6 高表達的比例較高而 pMMR 者中出現 IL-6 低表達的比例較低初步推測 dMMR 可能與 IL-6 有一定的關系，即 IL-6 可能參與了 MSI 的發生，但是該推測有待將來積累更多的 UC-CRC 病例資料加以判斷是否正確。
總之，與 SCRC 類似，MSI 參與了 UC-CRC 的發生及發展過程。UC-CRC 的 MMR 蛋白缺失更常見于 hMLH1 與 hPMS2、hMSH2 與 hMSH6 表達的共同缺失，本研究結果未能發現 IL-6 參與了結直腸癌的 MSI 相關癌變機制的證據，然而從本研究的初步研究結果推測 IL-6 可能參與了 UC-CRC 患者 MSI 的發生。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：銀東智、左健參與了起草文章；袁又能對文章進行了審閱；銀東智、袁又能、羅海平參與了手術實施;左健、左燕妮、汪燕舞數據采集及數據庫的建立；銀東智、羅海平參與了數據的統計分析。
倫理聲明：本研究通過了鄂東醫療集團黃石市中心醫院倫理委員會審批（倫理批文編號：2019-WCK-013）。
在正常人體中存在一套完整的 DNA 錯配修復（MMR）系統，如果此修復機制出現問題如 MMR 基因發生甲基化、突變或缺失，可以導致 MMR 蛋白表達缺失（dMMR）[1]，繼而出現 DNA MMR 錯誤，出現這些簡單重復序列增多或丟失即微衛星不穩定性（MSI），其結果是子細胞發生突變甚或癌變[2]。因此，可以通過檢測 MMR 蛋白表達是否缺失來確定是否存在 MSI。潰瘍性結腸炎（UC）是一種病因尚不明確、特異性作用于直腸和結腸黏膜、慢性反復發作的炎癥性病變，UC 病程進展過程中可能會癌變即發展成 UC 相關性結直腸癌（UC-CRC）。結直腸癌中大多數呈散發性（非遺傳性）即散發性結直腸癌（SCRC），而少部分有遺傳背景，其中遺傳性非息肉結直腸癌（HNPCC）發病率占到結直腸癌總發病的 3%～5%[3]。有文獻[4]報道，90% 以上的 HNPCC 和 10%～15% 的 SCRC 均與 MSI 有關。另外，有研究[5-6]發現，結直腸癌患者的血清中白細胞介素-6（IL-6）的水平明顯增高可能與 MSI 有關，且這種現象也常見于 UC 的有炎癥黏膜上皮細胞中[7]。由此，在 UC-CRC 的發病過程中 MSI 是否參與其中并起到了怎樣的作用、炎癥因子 IL-6 是否參與了 MSI 的發生等這些問題的研究值得進一步進行探索。歐美等國家對此的相關研究雖然不多，但還是已經積累了一定的經驗，但中國作為亞洲的一個大國，UC-CRC 相關研究資料卻非常欠缺。筆者前期曾對 UC-CRC 患者的臨床病理特點作了分析總結[8]，在本研究擬進一步分析 UC-CRC 患者中的 IL-6 及 MMR 蛋白表達情況并探討 UC 患者癌變過程中 IL-6 及 MSI 所起的作用。
1 資料與方法
1.1 病例納入標準和排除標準
① UC-CRC 納入標準：接受手術治療、術前未接受輔助放化療等治療，結腸鏡活檢和（或）手術后病理檢查明確診斷為結直腸癌且結腸鏡檢查見典型 UC 表現和（或）結腸鏡活檢和術后病理檢查診斷為 UC。② SCRC 納入標準：接受手術治療、術前未接受輔助放化療等治療，病理檢查診斷為結直腸癌，與 UC-CRC 患者同期收治且術后病理檢查示腫瘤分期相同。③ UC 患者的納入標準：與 UC-CRC 患者同期收治且診斷非 UC-CRC、SCRC 的 UC 患者，結腸鏡檢查見典型 UC 表現和（或）結腸鏡活檢和術后病理檢查診斷為 UC。④ 對照組患者的納入標準：納入與 UC-CRC 患者同期且診斷非 UC、UC-CRC、SCRC 患者，按每 1～2 個的病案號列表隨機抽選 1 個，共抽取 30 例作為對照組。
1.2 免疫組織化學方法檢測 hMLH1、hMSH2、hMSH6、hPMS2 及 IL-6 的蛋白表達
1.2.1 主要試劑
小鼠抗人 hMLH1、hMSH2、hMSH6、hPMS2、IL-6 單克隆抗體均購自武漢珈源生物醫學工程有限公司；血清 IL-6 定量檢測試劑盒購自北京熱景生物技術有限公司；EnVision 免疫組織化學檢測試劑盒購自丹麥 Dako 公司。
1.2.2 免疫組織化學染色
操作嚴格按試劑盒說明書進行，常規固定脫水、包埋切片、抗原修復等后依次滴加一抗、二抗、顯色，封片后顯微鏡下觀察。
1.2.3 染色結果判斷
① UC-CRC 及 SCRC 癌組織中 hMLH1、hMSH2、hMSH6、hPMS2 蛋白陽性表達：有絲分裂期的細胞中該抗原標記在染色體和細胞質，除有絲分裂期的細胞外，該抗體標記的陽性細胞顯示為細胞核呈棕黃色染色且背景無染色，組織內預期細胞中未見棕黃色著色為陰性表達；4 種 MMR 蛋白（hMLH1、hMSH2、hMSH6、hPMS2）中若有 1 種及以上表達缺失者則判定為錯配修復基因缺乏（dMMR），若 4 種 MMR 蛋白全部陽性表達則判定為錯配修復基因完整（pMMR）。② IL-6 蛋白陽性表達：抗體標記的細胞顯示細胞漿呈棕黃色著色且背景無染色為陽性表達，組織內預期細胞中未見棕黃色著色為陰性表達。其最終表達強度用半定量分析方法判定，觀察著色強度并評分（細胞未著色 0 分、淡黃色 1 分、棕黃色 2 分、棕褐色3 分）和鏡下隨機觀察 5 個高倍（×400）視野（每個視野計數 100 個細胞）的陽性細胞平均數判定陽性細胞百分率并進行評分（0～5% 為 0 分，6%～25% 為 1 分，26%～50% 為 2 分，51%～75% 為 3 分，>75% 為 4 分），將著色強度評分與陽性細胞百分率評分相乘得到染色指數值，當染色指數值>4 為高表達（陽性或強陽性）、≤4 為低表達（陰性或弱陽性）。由兩名經驗豐富的病理醫生共同做出最終結果判定。
1.2.4 血清 IL-6 定量分析
使用電化學發光免疫分析方法測定對照組、UC 組、UC-CRC 組及 SCRC 組患者的血清 IL-6 水平。
1.3 統計學方法
應用 SPSS 20.0 軟件對數據進行分析。血清 IL-6水平在對照組、UC 組、UC-CRC 組及 SCRC 組間比較采用 t 檢驗；UC-CRC 患者的 hMLH1、hPMS2、hMSH2 和 hMSH6 蛋白缺失情況采用卡方（χ2）檢驗進行相關分析；SCRC 及 UC-CRC 組織中 IL-6 蛋白表達與 MSI 蛋白表達的相關性分析采用 Spearman 等級相關分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 本研究納入患者的基本情況
本研究納入了鄂東醫療集團（包括黃石市中心醫院中心院區及普愛院區、黃石市中醫院）2013 年 1 月至 2019 年 1 月期間收治的 UC-CRC 患者 17 例、SCRC 患者 55 例、UC 患者 43 例，對照組患者 30 例。
2.2 UC-CRC 及 SCRC 組織中 MMR 蛋白表達情況及相關性分析結果
MMR 蛋白 hMLH1、hPMS2、hMSH2 和 hMSH6 在 UC-CRC 患者癌組織中的定性表達情況見圖1a–圖 1h，其在 UC-CRC 和 SCRC 癌組織中的表達情況見表1。在 UC-CRC 和 SCRC 癌組織中 hMLH1 和 hPMS2 共同缺失分別為 2 例（11.8%）和 2 例（3.6%）、hMSH2 和 hMSH6 共同缺失分別為 3 例（17.6%）和 2 例（3.6%），兩種癌組織中 hMLH1 與 hPMS2 蛋白表達缺失、hMSH2 與 hMSH6 蛋白表達缺失均明顯相關（P<0.05），見表 2 和表 3。
圖1
示 MMR（EnVision ×100）、IL-6（EnVision ×200）和 CEA（EnVision ×200）蛋白在 UC-CRC 組織中的表達情況
a：hMLH1（–）；b：hMLH1（+）；c：hMSH2（–）；d：hMSH2（+）；e：hMSH6（–）；f：hMSH6（+）；g：hPMS2（–）；h：hPMS2（+）；i：IL-6（+）；j：CEA（+），可見大量印戒細胞
表1
MMR 蛋白在 UC-CRC 和 SCRC 癌組織中的表達［例（%）］
表2
hMLH1 和 hPMS2 以及 hMSH2 和 hMSH6 在 UC-CRC 癌組織中表達的相關性分析結果（例）
表3
hMLH1 和 hPMS2 以及 hMSH2 和 hMSH6 在 SCRC 癌組織中表達的相關性分析結果（例）
17 例 UC-CRC 癌組織中出現 dMMR 者共 7 例（總缺失率為 41.2%），而 55 例 SCRC 癌組織中出現 dMMR 者占 12 例（總缺失率為 21.8%），二者比較差異無統計學意義（χ2=2.505，P=0.113）。
2.3 IL-6 在 UC-CRC 癌組織中的表達以及 IL-6 與 MMR 蛋白表達的相關性分析結果
IL-6 蛋白在 UC-CRC 的眾多腫瘤細胞漿中呈陽性表達（圖1i），CEA 蛋白表達陽性的 UC-CRC 癌組織中可見大量印戒細胞表達（圖1j）。IL-6 蛋白在 UC-CRC 癌組織中高表達 9 例（52.9%），SCRC 癌組織中高表達 30 例（54.5%），UC-CRC 患者中 7 例 dMMR 者的 IL-6 高表達者 5 例（5/7），10 例 pMMR 者 IL-6 高表達者 4 例（4/10），因 UC-CRC 樣本量較小未進行統計分析，但從初步結果提示，dMMR 可能與 IL-6 有一定的關系；SCRC 癌組織中 MMR 蛋白表達與 IL-6 蛋白表達水平無明顯相關性（rs=0.04，P=0.77），見表4。
表4
UC-CRCS 及 SCRC 癌組織中 IL-6 與 MMR 蛋白表達的相關性分析結果（例）
2.4 各組患者血清中 IL-6 水平
結果見表5。從表5 可見，血清 IL-6 水平在 UC 組明顯高于對照組（t=7.82，P<0.001），在 UC-CRC 組明顯高于 UC 組（t=4.97，P<0.001）及 SCRC 組（t=5.26，P=0.006）。
表5
各組患者血清中 IL-6 水平（，mg/L）
3 討論
結直腸腫瘤的發生是個遺傳、環境等多種因素相互作用下的多基因改變的復雜過程，常見的途徑之一是 MSI。微衛星是指基因組中一些簡單的、多不超過 10 個核苷酸的重復序列，多為由 2 個核苷酸組成的 10～50 次的重復序列，其基因的多態性由重復序列數量的多少所造成。正常人體中的 DNA MMR 系統是由 MMR 基因編碼的一系列 MMR 蛋白組成，是細胞復制出現異常時的一種保護機制，可識別 DNA 復制過程中出現的錯配堿基并進行水解和修復，從而維持 DNA 復制保真度，預防基因突變[9]。如果此修復機制出現問題，則會出現這些簡單重復序列增多或丟失即 MSI。pMMR 指 MMR 蛋白完整（所有位點均穩定時的情況）或基本完整表達（僅有 1 個位點出現不穩定時的情況）即微衛星穩定或微衛星低度不穩定，dMMR 指 MMR 蛋白明顯缺失（有不少于 2 個位點出現不穩定時的情況）即微衛星高度不穩定[10]。
對結直腸癌標本進行 MMR 蛋白表達檢測可用聚合酶鏈式反應（PCR）和免疫組織化學方法，相對于操作復雜、成本較高的 PCR 技術，免疫組織化學法操作簡便、價格低廉且與 PCR 檢測結果一致率較高[11]，更利于在臨床上開展。因此，本研究用免疫組織化學方法檢測 MMR 蛋白 hMLH1、hMSH2、hMSH6 及 hPMS2 在 UC-CRC 組織中的表達情況。
目前，針對 UC-CRC 的 MSI 研究較少，本研究對此進行研究的結果顯示，在 17 例 UC-CRC 癌組織中出現至少 1 種 MMR 蛋白陰性表達者共 7 例（缺失率為 41.2%），而在 55 例 SCRC 癌組織中出現至少 1 種 MMR 蛋白陰性表達者共 12 例（缺失率為 21.8%），二者在發生 MSI 方面未見明顯差異，提示與 SCRC 類似，MSI 可能也參與了 UC-CRC 的發生及發展過程。在本研究中發現 UC-CRC 組的 hMLH1、hMSH2、hMSH6、hPMS2 蛋白表達缺失率分別為 17.6%、29.4%、23.5%、17.6%，這與歐洲一項結直腸癌的研究結果[12]相似。相關研究[13]發現，每個 DNA 結合的 hMutSα 復合體的信號轉導過程是由 hMutLα 異二聚體（hMLH1-hPMS2）完成的，其中 hMLH1 為主導蛋白，hPMS2 為配對蛋白；而 hMSH6 是 hMSH2 的 G∶T 結合配偶體，它們共同形成 hMutSα 錯配結合復合體（hMSH2-hMSH6），hMSH2 為主導蛋白、hMSH6 為配對蛋白，當主導蛋白 hMSH2 發生突變缺失時，hMSH6 是不穩定的，即可出現兩者的共同缺失，這種情況亦適用于 hMutLα 異二聚體（hMLH1-hPMS2）。在本研究中的結果顯示，hMLH1 和 hPMS2 共同缺失占 11.8%，hMSH2 和 hMSH6 共同缺失占 17.6%，而且 hMLH1 與 hPMS2 蛋白缺失之間、hMSH2 與 hMSH6 蛋白缺失之間均明顯相關，這與 Edelbrock 等[13]的研究結果相吻合。
UC 曾被認為在歐美等國家發病率較高[14]，我國其患病率不高，但近年來發現其在我國的發病率呈快速上升趨勢[15]。UC 被認為可持續增加患者結直腸癌的發病風險，其結直腸黏膜上皮細胞在出現不典型增生或癌變之前就處于炎性變，長期的積累便出現了基因改變[16-20]。氧化應激作用是公認的 UC 和結直腸癌發生基因突變的驅動因素[21-22]。UC 被認為時常處于氧自由基過量的狀態，其中脫顆粒的多形核細胞引起細胞發生 DNA 突變等損傷[23-24]，而多形核細胞能產生某些細胞因子（如 IL-6、TNF-α 等）促進腫瘤的發生、發展和轉移[25-26]；且研究[5-6]發現，結直腸癌患者血清 IL-6 水平明顯增高，IL-6 可能參與了結直腸癌細胞的 MSI 發生，這種現象也常見于 UC 的有炎癥黏膜上皮細胞中[7]。那么 UC 癌變與 IL-6 是否有關？IL-6 是否亦通過誘導 MSI 而導致 UC-CRC 的發生？筆者從 2009 年接觸 UC-CRC，初始時因經驗缺乏，故在臨床診療中遇到了一些問題，然后對其臨床經驗進行了初步總結；從 2012 年開始，有了研究其發病機制的設想，故從 2013 年及以后術前確診或擬診病例我們均常規檢查了包括 IL-6 在內的多個臨床指標。本研究對對照組、UC 組、UC-CRC 組及 SCRC 組患者的血清 IL-6 水平進行分析發現，UC 組患者的血清 IL-6 水平明顯高于對照組（P<0.05），UC-CRC 組明顯高于 UC 組（P<0.05）及 SCRC 組（P<0.05），提示 IL-6 可能與 UC 患者反復炎癥損害及其最終癌變有關。進而本研究嘗試探討了在 SCRC 及 UC-CRC 組織中 IL-6 與 MMR 蛋白表達的關系，未發現 SCRC 癌組織中 MMR 與 IL-6 有關，不能確切明確 IL-6 參與了結直腸癌的 MSI 相關癌變機制；對于 UC-CRC，因其樣本量較少未進行統計學分析，但根據 UC-CRC 癌組織 dMMR 者中出現 IL-6 高表達的比例較高而 pMMR 者中出現 IL-6 低表達的比例較低初步推測 dMMR 可能與 IL-6 有一定的關系，即 IL-6 可能參與了 MSI 的發生，但是該推測有待將來積累更多的 UC-CRC 病例資料加以判斷是否正確。
總之，與 SCRC 類似，MSI 參與了 UC-CRC 的發生及發展過程。UC-CRC 的 MMR 蛋白缺失更常見于 hMLH1 與 hPMS2、hMSH2 與 hMSH6 表達的共同缺失，本研究結果未能發現 IL-6 參與了結直腸癌的 MSI 相關癌變機制的證據，然而從本研究的初步研究結果推測 IL-6 可能參與了 UC-CRC 患者 MSI 的發生。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：銀東智、左健參與了起草文章；袁又能對文章進行了審閱；銀東智、袁又能、羅海平參與了手術實施;左健、左燕妮、汪燕舞數據采集及數據庫的建立；銀東智、羅海平參與了數據的統計分析。
倫理聲明：本研究通過了鄂東醫療集團黃石市中心醫院倫理委員會審批（倫理批文編號：2019-WCK-013）。
