引用本文： 周柯均, 王城, 謝夢憶, 侯永川, 熊云麟, 劉瑜, 鄧琳. 白藜蘆醇通過 PI3K p85/Akt 信號軸抗 HepG2 肝癌細胞增殖. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(7): 808-813. doi: 10.7507/1007-9424.201910006 復制
原發性肝癌是目前我國常見的惡性腫瘤之一，其發病率占所有惡性腫瘤的第 4 位，致死率占第3 位，嚴重威脅我國人民的生命和健康[1]。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原發性肝癌的 85%～90%，預后差且死亡率高[2-4]。自 20 世紀以來，我國的 HCC 發病率呈逐年上升趨勢，己成為農村惡性腫瘤致死的主要原因之一。目前 HCC 的治療多以手術切除作為首選手段。雖然基于早期診斷的完整瘤體切除并輔之術后系統治療的手段能有效延長患者的存活期限，但仍不能逆轉或干預患者的不良預后結局[5]。因此，研發新型、高效且低毒的抗 HCC 藥物迫在眉睫。非黃酮類的多酚化合物白藜蘆醇，在植物中主要以反式形式存在，具有顯著的抗炎和抗氧化的作用，在腫瘤的防治研究中備受關注。梁睿及其團隊[6]曾發現，白藜蘆醇可能通過升高 MCF-7/ADR 細胞中的 miR-519c 水平，抑制細胞耐藥蛋白的表達，發揮逆轉乳腺癌耐藥的作用。苗向霞等[7]也發現，白藜蘆醇可降低肝癌 HepG2 細胞中 O-乙酰葡糖胺糖基化蛋白（O-GlcNAc）的糖基化水平，進而抑制肝癌 HepG2 細胞中的脂肪合成。趙宇及其團隊[8]曾報道，白藜蘆醇可通過誘導自噬而抑制 HepG2 細胞的增殖，其機制可能與磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）通路有關。但目前關于白藜蘆醇對 HCC 作用的研究主要基于其誘導自噬和抗氧化的功能，針對白藜蘆醇如何通過 PI3K/Akt 軸影響 HCC 細胞增殖的機制的研究相對較少。因此，本研究擬觀察白藜蘆醇是否影響 HCC 細胞的增殖，并進一步研究白藜蘆醇如何通過 PI3K/Akt 軸影響 HCC 細胞增殖，旨在為 HCC 的防治提供新的臨床前藥效效價依據。
1 材料和方法
1.1 細胞株、藥物、試劑與設備
人肝癌細胞株 HepG2 由美國愛因斯坦醫學院惠贈。
藥物和試劑包括：二甲基亞砜（DMSO）和白藜蘆醇（西格瑪奧德里奇貿易有限公司）、DMEM 高糖培養基和 DEPC 水（賽默飛世爾科技有限公司）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）、CCK8 細胞增殖與活性檢查試劑盒（DOJINDO LABORATORIES/日本株式會社同仁化學研究所）、胎牛血清（FBS，上海逍鵬生物科技有限公司）、PI3 Kinase p85α（型號：6G10，Mouse mAb，貨號：#13666，Cell Signaling Technology）、Phospho-PI3 Kinase p85/p55（型號：E3U1H，Rabbit mAb，貨號：#17366，Cell Signaling Technology）、Akt（型號：11E7，Rabbit mAb，貨號：4685，Cell Signaling Technology）和 Phospho-Akt（型號：D9E，Rabbit mAb，貨號：4060，Cell Signaling Technology）。
設備包括：光學顯微鏡（Leica Microsystems company）、酶標儀（Bio-Rad Laboratories company）、低速自動平衡離心機（雷勃爾醫療器械有限公司）、高速臺式冷凍離心機（湘儀離心機儀器有限公司）、CO2 培養箱（賽默飛世爾科技有限公司）、超凈工作臺（Bio-Rad Laboratories company）、制冰機（Panasonic company）、漩渦振蕩器（IKA 公司）、Fusion Solo 化學發光成像儀（VILBER 公司）、NovoCyte 流式細胞儀（ACEA）和 xCElligence RTCA DP（ACEA Biosciences，Inc）。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養
將 HepG2 細胞加入 10 cm2培養皿中，添加含 10% FBS、1% 抗生素（青霉素和鏈霉素）的 DMEM 培養基約 10 mL，在溫度 37 ℃、5% CO2 培養箱中培養。
1.2.2 細胞處理及分組干預方式
取傳代后 3 d 的 HepG2 細胞，給予不同濃度白藜蘆醇處理：0、6.25、12.5、25.0 以及 50.0 μmol/L。0 μmol/L 組中加入等體積的 0.1% 的 DMSO 溶液作為對照。本實驗用 0.1% 的 DMSO 溶液配置成 6.25、12.5、25.0 以及50.0 μmol/L 的白藜蘆醇。
1.2.3 CCK8 細胞增殖與活性檢測試劑盒檢測細胞增殖活性
取對數期的 HepG2 細胞，用新鮮的完全培養基制成單細胞懸液，調整細胞密度為 5×104個/mL，每孔取 100 μL 細胞懸液于 96 孔板中，置于 37 ℃、5% CO2 的飽和濕度培養箱中培養 24 h 后，每孔加入相應的白藜蘆醇，使其終末濃度分別為 0、12.5、25.0 和 50.0 μmol/L，每個濃度設置 6 個復孔。在 0、24、48 和 72 h 時，每孔加入 10 μLCCK8 溶液，放入培養箱繼續孵育 2 h 后，在酶標儀上測定每孔在 450 nm 處的吸光度（A）值。計算每個濃度的均值，繪制生長曲線。
1.2.4 實時細胞分析儀（RTCA）系統檢測細胞增殖與毒理
在 HepG2 細胞的對數生長期加入不同濃度的白藜蘆醇（濃度包括 0、6.25、12.5、25.0 及 50.0 μmol/L），在之后的 2 d 時間內設定每 10 分鐘連續讀取 HepG2 細胞的 NCI（normalized cell index）值，以觀察各個濃度白藜蘆醇對 HepG2 細胞增殖的影響。具體操作為：實驗前用 75% 乙醇棉球將 RTCA 檢測儀擦拭干凈，放入超凈臺中以紫外線消毒 1～2 h，再將 RTCA 檢測儀置入恒溫孵箱中，連接電腦檢查儀器情況。實驗步驟如下：① 首先，在超凈工作臺中向 16 孔增殖板的每個小孔中加入 60 μL 無血清基礎培養基，后將 16 孔增殖板放入 RTCA 檢測儀中，檢查是否接觸良好（在“Message”頁面，顯示 Connection OK），開始檢測基線，檢測后確定“Message”頁面無警告報錯信息；② 取出 16 孔增殖板，在超凈工作臺中以每孔 6 000 個細胞接種處于對數生長期的 HepG2 細胞混懸液 60 μL，室溫放置 30 min，放入孵箱內的 RTCA 檢測儀中，開始第二步檢測增殖；③ 待細胞進入對數生長期后，于電腦軟件上點擊“abort current step”，放棄當前步驟，將板子取出。在每孔中加入不同濃度白藜蘆醇并設置無藥物的空白對照組。再次將加完藥物的 16 孔板放回孵箱中。設定程序每 10 分鐘進行 1 次阻抗值讀數，48 h 后獲得完整的細胞生長曲線。平行實驗至少重復 3 次。
1.2.5 流式細胞術檢測腫瘤細胞凋亡
本研究 RTCA 結果提示，6.25 μmol/L 白藜蘆醇對細胞的抑制作用與 0 μmol/L 比較差異不大，因此后續實驗未設定該濃度，白藜蘆醇濃度包括 0、12.5、25.0 及 50.0 μmol/L。收集 4 組處理 48 h 后的 HepG2 細胞于流式管中，用 PBS 重懸上述細胞，1 000 rpm/min 離心 5 min（離心半徑為 13.5 cm）后棄上清液，再加入 300 μL 的 1×Binding Buffer 重懸細胞，添加 5 μL 的熒光素 APC 標記的 Annexin V（Annexin V-APC）和 7 氨基放線菌素（7-AAD）/核糖核酸酶（RNase）染液混勻后，室溫避光孵育 15 min。將染好色后的細胞使用 NovoCyte 流式細胞儀進行凋亡細胞的檢測。通過軟件分析，繪制雙色散點圖，其中 APC 為橫坐標，PE 為縱坐標。實驗均重復 3 次，取均值。
1.2.6 Western blot 法檢測 PI3K p85、磷酸化蛋白激酶 B（p-Akt）、總 Akt（t-Akt）和細胞周期素 A2（CyclinA2）蛋白的表達
收集 4 組處理 48 h 后的 HepG2 細胞，使用 RIPA 在冰上裂解細胞 30 min 后提取細胞總蛋白。以 BCA 試劑盒定量檢測 4 組樣本的蛋白濃度，然后取等量蛋白以 100 ℃ 變性 5 min。各取 20 μg 已經煮沸變性的蛋白樣品上樣，進行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳。使用聚偏氟乙烯（PVDF）膜轉膜，用含 5% 脫脂奶粉的 TBST 室溫封閉超過 2 h，分別用 PI3K p85 抗體（1∶1 000）、p-Akt（phospho S473）抗體（1∶1 000）、t-Akt 抗體（1∶1 000）和 CyclinA2 抗體（1∶1 000）4 ℃ 冰箱孵育 PVDF 膜過夜。經過 TBST 洗滌 3 次后加入二抗，室溫下于搖床上平搖1 h，用 TBST 漂洗 3 次 PVDF 膜后，暗室中使用顯影液顯影曝光。以細胞內 GAPDH 的含量作為內參，利用 ImageJ 軟件對曝光后的 4 組目的蛋白條帶進行光密度掃描定量。PI3K p85、t-Akt 和 CyclinA2 蛋白的相對表達水平為相應蛋白條帶的光密度量比上對應內參蛋白 GAPDH 的光密度量。常規內參 GAPDH 檢測只能排除體系誤差，為明確 p-Akt 的表達變化是因上樣量不同所致還是因白藜蘆醇作用而致，在后續結果分析中進一步明確比較 p-Akt 蛋白的相對表達水平與 t-Akt 的相對表達水平的比值。每組細胞重復測量 3 次。
1.3 統計學方法
用 SPSS 23.0 統計軟件進行分析。計量數據均采用均數±標準差（
±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD 法）。檢驗水準為 α=0.05。
2 結果
2.1 CCK8 法觀察白藜蘆醇對 HepG2 細胞活力的影響
如圖 1a 所示，CCK8 實驗結果顯示，白藜蘆醇對 HepG2 細胞的生長具有明顯的抑制作用：相較于不加白藜蘆醇的 0 μmol/L 組而言，隨著濃度和時間的延長，各濃度組在不同時間點的 OD值均小于 0 μmol/L 組，表現出抑制效應；白藜蘆醇作用 48 h 后，各個濃度對細胞的抑制效應均增大，且 50 μmol/L濃度下細胞的抑制效應最大。
圖1
示 CCK8 法和 RTCA 系統檢測各濃度白藜蘆醇對 HepG2 細胞活力的影響、流式細胞儀檢測細胞凋亡情況以及 Western blot 法檢測各濃度白藜蘆醇對 HepG2 細胞中 PI3K/Akt 信號及其下游 CyclinA2 蛋白的表達結果
a：CCK8 法檢測的各濃度白藜蘆醇對 HepG2 細胞活力的影響結果；b：RTCA 系統示蹤曲線；c：RTCA 系統檢測各濃度白藜蘆醇對 HepG2 細胞活力的影響結果，與 0 μmol/L 和 6.25 μmol/L 比較，*
2.2 RTCA 系統觀察各濃度白藜蘆醇對 HepG2 細胞增殖的影響
通過 RTCA 系統檢測加藥后不同時間點不同濃度白藜蘆醇處理組細胞的 NCI 值，結果顯示，與 0 μmol/L 相比，白藜蘆醇在濃度為 6.25 μmol/L 時對 HepG2 細胞 NCI 值的影響不大；但從濃度為 12.5 μmol/L 開始，HepG2 細胞的 NCI 值顯著降低；且隨著時間的延長，12.5、25.0 和 50.0 μmol/L 白藜蘆醇組的 NCI 值逐漸降低（圖 1b）。
處理 12、24、36 和 48 h 時，同時點 0 μmol/L 組和 6.25 μmol/L 組的 NCI 值比較差異均無統計學意義（P>0.05），但同時點 12.5、25.0 及 50.0 μmol/L 組與 0 μmol/L 組比較，NCI 值均降低，差異有統計學意義（P<0.05），見圖 1c。
2.3 白藜蘆醇可以誘導 HepG2 細胞凋亡
4 組細胞的流式細胞儀檢測結果表明，白藜蘆醇可以誘導 HepG2 細胞發生細胞凋亡，且具有劑量依賴性。通過與 0 μmol/L 濃度比較，發現不同濃度白藜蘆醇可以誘導前肝癌細胞系 HepG2 的細胞凋亡，晚期凋亡細胞率由 0 μmol/L 處理組的 3.21% 上升到 50.0 μmol/L 白藜蘆醇處理組的 20.64%，具體見圖 1d–1g）。
2.4 白藜蘆醇在肝癌細胞中抑制 PI3K p85/Akt 信號的表達
Western blot 結果顯示，12.5、25.0 以及50.0 μmol/L 白藜蘆醇可以顯著降低 HepG2 細胞內 PI3K p85 蛋白的表達水平，與 0 μmol/L 白藜蘆醇組比較差異均有統計學意義（P<0.05），且白藜蘆醇的效應呈劑量依賴關系，即白藜蘆醇的給藥濃度越高越能降低 HepG2 細胞內 PI3K p85 的表達水平，3 個濃度組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。但白藜蘆醇對 HepG2 細胞內 t-Akt 蛋白的表達水平無顯著影響，4 組間比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 1h 和圖 1i。
此外，鑒于前述研究中觀察到白藜蘆醇對 HepG2 細胞內 t-Akt 蛋白的表達水平無顯著影響，而 Akt 的磷酸化也能從側面反映出 PI3K 信號通路的激活，故本研究進一步檢測 p-Akt 的水平。常規內參 GAPDH 檢測只能排除體系誤差，為明確p-Akt 的表達變化是因上樣量不同所致還是因白藜蘆醇作用而致，在后續結果分析中明確比較 p-Akt 蛋白的相對表達水平與 t-Akt 蛋白的相對表達水平的比值。結果表明，與 0 μmol/L 白藜蘆醇組比較，12.5、25.0 和 50.0 μmol/L 白藜蘆醇組的 p-Akt 和p-Akt/t-Akt 比值均較低（P<0.05），見圖 1i。該研究結果提示，白藜蘆醇抑制的是 HepG2 細胞內 Akt 的第 473 位絲氨酸的磷酸化。
2.5 白藜蘆醇在肝癌細胞中抑制 PI3K p85/Akt 下游 CyclinA2 蛋白的表達
Western blot 結果顯示，與 0 μmol/L 比較，12.5、25.0 和 50.0 μmol/L 白藜蘆醇可以顯著降低HepG2 細胞內 CyclinA2 蛋白的表達水平（P<0.05），且呈劑量依賴關系，即白藜蘆醇的給藥濃度越高越能降低 HepG2 細胞內 CyclinA2 蛋白的表達水平（圖 1j 和 1k）。
3 討論
白藜蘆醇的化學名稱為 3,5,4′-三羥基苯二烯，主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中，是植物在惡劣環境下或遭到病原體侵害時自身分泌的一種抵御感染的多酚類抗菌素[9]。白藜蘆醇作為一種天然的有多種生物學功能的植物化合物，具有降脂、抗氧化、抗癌、保護心腦血管、保肝、抗衰老、免疫調節、雌激素樣作用等功能。隨著研究的不斷深入發展，其藥理活性的研究逐漸得到關注，尤其在防治腫瘤、心血管疾病等方面顯示出巨大的應用潛力，有望開發成為可防治多種疾病的新型藥物，具有廣泛的應用前景[10]。研究發現，白藜蘆醇可以通過減少細胞凋亡、抑制脂質過氧化、抑制炎性細胞因子表達等，實現保護肝細胞、減輕肝損傷和促進肝功能恢復的目的[11-12]。離體或動物實驗觀察到，白藜蘆醇對消化、血液、呼吸、生殖等多個系統來源的多種腫瘤細胞都有拮抗作用[13]。本實驗在不同濃度白藜蘆醇處理 HepG2 肝癌細胞的研究中觀察到，白藜蘆醇對 HepG2 細胞的生長具有明顯的抑制作用，并且隨著時間的延長和白藜蘆醇濃度的增高，HepG2 細胞的活力越來越低。白藜蘆醇作用 48 h 后，各個濃度對細胞的抑制效應逐漸增大，且 50.0 μmol/L 濃度下細胞的抑制效應最強。進一步的 RTCA 系統研究也發現，白藜蘆醇對 HepG2 細胞的 NCI 值降低作用具有濃度依賴關系，即白藜蘆醇濃度越高對 HepG2 細胞的 NCI 值降低作用越強，且該作用具有時間依賴效應。以上結果也證實了，高濃度的白藜蘆醇可以抑制 HepG2 肝癌細胞的增殖，而白藜蘆醇抑制 HepG2 肝癌細胞增殖的效應也具有時間和劑量依賴效應。
白藜蘆醇抑制腫瘤細胞的生長，與其對細胞周期的調控相關[14]。白藜蘆醇在腫瘤的發生和發展過程中都具有抗腫瘤功效。這主要依靠其抗氧化性和抗突變作用，誘導第二相藥代酶產生（抗啟動活性）；此外，它可以傳遞抗炎作用并有抑制環氧合酶（COX）和過氧代氫酶的功能（即抗促進作用）[15-16]。白藜蘆醇通過誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、阻滯細胞周期、介導體液免疫應答、調節細胞因子分泌和拮抗腫瘤血管生成而影響腫瘤的發生發展[17]。Delmas 等[18]發現，白藜蘆醇作用于肝癌小鼠模型后，可以抑制周期蛋白的產生，降低周期蛋白依賴性蛋白激酶（CDK）蛋白表達和活性，阻滯細胞周期，達到抑制肝癌細胞增殖的作用；上述作用存在時間和劑量的依賴性。有實驗[18]表明，白藜蘆醇在短時間內可以通過濃度依賴性作用阻斷腫瘤的 DNA 合成，當作用時間延長后通過作用于細胞周期而起到阻滯腫瘤生長的作用；進一步實驗證實，白藜蘆醇可以通過減慢細胞周期循環速度或阻滯某一特定時相從而發揮其作用，這種作用與其濃度有關。經白藜蘆醇處理過的細胞不僅僅有相應的細胞周期改變，并伴有細胞核增大。Bishayee 等[19]對二乙亞硝胺誘導的動物肝癌的實驗研究發現，白藜蘆醇誘導腫瘤細胞凋亡的途徑之一可能是上調 Nrf2 核轉錄因子介導的蛋白及 mRNA 的表達，從而起促進肝癌細胞凋亡的作用[20]。
白藜蘆醇可通過多條途徑發揮抗腫瘤作用，其中 PI3K 信號轉導通路成為近年來的研究熱點[21-22]。在培養的小鼠 JB6 表皮細胞中，白藜蘆醇及其衍生物通過阻斷表皮生長因子介導的 PI3K/Akt 的活性而抑制腫瘤細胞的轉化[23-24]。在人類乳腺癌細胞中，白藜蘆醇通過影響與雌激素受體 α 相關的 PI3K 信號通路，從而阻斷細胞的生存和增殖[25-26]。筆者在本研究中觀察到，白藜蘆醇可以顯著降低 HepG2 細胞內 PI3K p85 的表達水平，且呈劑量依賴關系，即白藜蘆醇的給藥濃度越高越能下調 HepG2 細胞內 PI3K p85 的表達。雖然白藜蘆醇對 HepG2 細胞內 t-Akt 的表達水平無顯著影響，但白藜蘆醇可以顯著降低 HepG2 細胞內 p-Akt 的表達水平，且白藜蘆醇降低的是 HepG2 細胞內 Akt 的第 473 位絲氨酸的磷酸化。此外，本研究結果還顯示，白藜蘆醇可以顯著降低 HepG2 細胞內 PI3K p85/Akt 信號通路下游 CyclinA2 蛋白的表達水平，且呈劑量依賴關系，即白藜蘆醇的給藥濃度越高越能降低 HepG2 細胞內 CyclinA2 蛋白的表達水平。因此，結合前人研究與本實驗的觀察發現，筆者認為，白藜蘆醇可能通過 PI3K p85/Akt 信號軸來達到抗肝癌細胞增殖的作用，這為 HCC 的藥物治療提供了新的思路。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：周柯均撰寫文章和參與實驗；王城負責實驗質控；謝夢憶參與數據分析、整理及匯總；侯永川、熊云麟、劉瑜和鄧琳參與實驗。
原發性肝癌是目前我國常見的惡性腫瘤之一，其發病率占所有惡性腫瘤的第 4 位，致死率占第3 位，嚴重威脅我國人民的生命和健康[1]。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原發性肝癌的 85%～90%，預后差且死亡率高[2-4]。自 20 世紀以來，我國的 HCC 發病率呈逐年上升趨勢，己成為農村惡性腫瘤致死的主要原因之一。目前 HCC 的治療多以手術切除作為首選手段。雖然基于早期診斷的完整瘤體切除并輔之術后系統治療的手段能有效延長患者的存活期限，但仍不能逆轉或干預患者的不良預后結局[5]。因此，研發新型、高效且低毒的抗 HCC 藥物迫在眉睫。非黃酮類的多酚化合物白藜蘆醇，在植物中主要以反式形式存在，具有顯著的抗炎和抗氧化的作用，在腫瘤的防治研究中備受關注。梁睿及其團隊[6]曾發現，白藜蘆醇可能通過升高 MCF-7/ADR 細胞中的 miR-519c 水平，抑制細胞耐藥蛋白的表達，發揮逆轉乳腺癌耐藥的作用。苗向霞等[7]也發現，白藜蘆醇可降低肝癌 HepG2 細胞中 O-乙酰葡糖胺糖基化蛋白（O-GlcNAc）的糖基化水平，進而抑制肝癌 HepG2 細胞中的脂肪合成。趙宇及其團隊[8]曾報道，白藜蘆醇可通過誘導自噬而抑制 HepG2 細胞的增殖，其機制可能與磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）通路有關。但目前關于白藜蘆醇對 HCC 作用的研究主要基于其誘導自噬和抗氧化的功能，針對白藜蘆醇如何通過 PI3K/Akt 軸影響 HCC 細胞增殖的機制的研究相對較少。因此，本研究擬觀察白藜蘆醇是否影響 HCC 細胞的增殖，并進一步研究白藜蘆醇如何通過 PI3K/Akt 軸影響 HCC 細胞增殖，旨在為 HCC 的防治提供新的臨床前藥效效價依據。
1 材料和方法
1.1 細胞株、藥物、試劑與設備
人肝癌細胞株 HepG2 由美國愛因斯坦醫學院惠贈。
藥物和試劑包括：二甲基亞砜（DMSO）和白藜蘆醇（西格瑪奧德里奇貿易有限公司）、DMEM 高糖培養基和 DEPC 水（賽默飛世爾科技有限公司）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）、CCK8 細胞增殖與活性檢查試劑盒（DOJINDO LABORATORIES/日本株式會社同仁化學研究所）、胎牛血清（FBS，上海逍鵬生物科技有限公司）、PI3 Kinase p85α（型號：6G10，Mouse mAb，貨號：#13666，Cell Signaling Technology）、Phospho-PI3 Kinase p85/p55（型號：E3U1H，Rabbit mAb，貨號：#17366，Cell Signaling Technology）、Akt（型號：11E7，Rabbit mAb，貨號：4685，Cell Signaling Technology）和 Phospho-Akt（型號：D9E，Rabbit mAb，貨號：4060，Cell Signaling Technology）。
設備包括：光學顯微鏡（Leica Microsystems company）、酶標儀（Bio-Rad Laboratories company）、低速自動平衡離心機（雷勃爾醫療器械有限公司）、高速臺式冷凍離心機（湘儀離心機儀器有限公司）、CO2 培養箱（賽默飛世爾科技有限公司）、超凈工作臺（Bio-Rad Laboratories company）、制冰機（Panasonic company）、漩渦振蕩器（IKA 公司）、Fusion Solo 化學發光成像儀（VILBER 公司）、NovoCyte 流式細胞儀（ACEA）和 xCElligence RTCA DP（ACEA Biosciences，Inc）。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養
將 HepG2 細胞加入 10 cm2培養皿中，添加含 10% FBS、1% 抗生素（青霉素和鏈霉素）的 DMEM 培養基約 10 mL，在溫度 37 ℃、5% CO2 培養箱中培養。
1.2.2 細胞處理及分組干預方式
取傳代后 3 d 的 HepG2 細胞，給予不同濃度白藜蘆醇處理：0、6.25、12.5、25.0 以及 50.0 μmol/L。0 μmol/L 組中加入等體積的 0.1% 的 DMSO 溶液作為對照。本實驗用 0.1% 的 DMSO 溶液配置成 6.25、12.5、25.0 以及50.0 μmol/L 的白藜蘆醇。
1.2.3 CCK8 細胞增殖與活性檢測試劑盒檢測細胞增殖活性
取對數期的 HepG2 細胞，用新鮮的完全培養基制成單細胞懸液，調整細胞密度為 5×104個/mL，每孔取 100 μL 細胞懸液于 96 孔板中，置于 37 ℃、5% CO2 的飽和濕度培養箱中培養 24 h 后，每孔加入相應的白藜蘆醇，使其終末濃度分別為 0、12.5、25.0 和 50.0 μmol/L，每個濃度設置 6 個復孔。在 0、24、48 和 72 h 時，每孔加入 10 μLCCK8 溶液，放入培養箱繼續孵育 2 h 后，在酶標儀上測定每孔在 450 nm 處的吸光度（A）值。計算每個濃度的均值，繪制生長曲線。
1.2.4 實時細胞分析儀（RTCA）系統檢測細胞增殖與毒理
在 HepG2 細胞的對數生長期加入不同濃度的白藜蘆醇（濃度包括 0、6.25、12.5、25.0 及 50.0 μmol/L），在之后的 2 d 時間內設定每 10 分鐘連續讀取 HepG2 細胞的 NCI（normalized cell index）值，以觀察各個濃度白藜蘆醇對 HepG2 細胞增殖的影響。具體操作為：實驗前用 75% 乙醇棉球將 RTCA 檢測儀擦拭干凈，放入超凈臺中以紫外線消毒 1～2 h，再將 RTCA 檢測儀置入恒溫孵箱中，連接電腦檢查儀器情況。實驗步驟如下：① 首先，在超凈工作臺中向 16 孔增殖板的每個小孔中加入 60 μL 無血清基礎培養基，后將 16 孔增殖板放入 RTCA 檢測儀中，檢查是否接觸良好（在“Message”頁面，顯示 Connection OK），開始檢測基線，檢測后確定“Message”頁面無警告報錯信息；② 取出 16 孔增殖板，在超凈工作臺中以每孔 6 000 個細胞接種處于對數生長期的 HepG2 細胞混懸液 60 μL，室溫放置 30 min，放入孵箱內的 RTCA 檢測儀中，開始第二步檢測增殖；③ 待細胞進入對數生長期后，于電腦軟件上點擊“abort current step”，放棄當前步驟，將板子取出。在每孔中加入不同濃度白藜蘆醇并設置無藥物的空白對照組。再次將加完藥物的 16 孔板放回孵箱中。設定程序每 10 分鐘進行 1 次阻抗值讀數，48 h 后獲得完整的細胞生長曲線。平行實驗至少重復 3 次。
1.2.5 流式細胞術檢測腫瘤細胞凋亡
本研究 RTCA 結果提示，6.25 μmol/L 白藜蘆醇對細胞的抑制作用與 0 μmol/L 比較差異不大，因此后續實驗未設定該濃度，白藜蘆醇濃度包括 0、12.5、25.0 及 50.0 μmol/L。收集 4 組處理 48 h 后的 HepG2 細胞于流式管中，用 PBS 重懸上述細胞，1 000 rpm/min 離心 5 min（離心半徑為 13.5 cm）后棄上清液，再加入 300 μL 的 1×Binding Buffer 重懸細胞，添加 5 μL 的熒光素 APC 標記的 Annexin V（Annexin V-APC）和 7 氨基放線菌素（7-AAD）/核糖核酸酶（RNase）染液混勻后，室溫避光孵育 15 min。將染好色后的細胞使用 NovoCyte 流式細胞儀進行凋亡細胞的檢測。通過軟件分析，繪制雙色散點圖，其中 APC 為橫坐標，PE 為縱坐標。實驗均重復 3 次，取均值。
1.2.6 Western blot 法檢測 PI3K p85、磷酸化蛋白激酶 B（p-Akt）、總 Akt（t-Akt）和細胞周期素 A2（CyclinA2）蛋白的表達
收集 4 組處理 48 h 后的 HepG2 細胞，使用 RIPA 在冰上裂解細胞 30 min 后提取細胞總蛋白。以 BCA 試劑盒定量檢測 4 組樣本的蛋白濃度，然后取等量蛋白以 100 ℃ 變性 5 min。各取 20 μg 已經煮沸變性的蛋白樣品上樣，進行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳。使用聚偏氟乙烯（PVDF）膜轉膜，用含 5% 脫脂奶粉的 TBST 室溫封閉超過 2 h，分別用 PI3K p85 抗體（1∶1 000）、p-Akt（phospho S473）抗體（1∶1 000）、t-Akt 抗體（1∶1 000）和 CyclinA2 抗體（1∶1 000）4 ℃ 冰箱孵育 PVDF 膜過夜。經過 TBST 洗滌 3 次后加入二抗，室溫下于搖床上平搖1 h，用 TBST 漂洗 3 次 PVDF 膜后，暗室中使用顯影液顯影曝光。以細胞內 GAPDH 的含量作為內參，利用 ImageJ 軟件對曝光后的 4 組目的蛋白條帶進行光密度掃描定量。PI3K p85、t-Akt 和 CyclinA2 蛋白的相對表達水平為相應蛋白條帶的光密度量比上對應內參蛋白 GAPDH 的光密度量。常規內參 GAPDH 檢測只能排除體系誤差，為明確 p-Akt 的表達變化是因上樣量不同所致還是因白藜蘆醇作用而致，在后續結果分析中進一步明確比較 p-Akt 蛋白的相對表達水平與 t-Akt 的相對表達水平的比值。每組細胞重復測量 3 次。
1.3 統計學方法
用 SPSS 23.0 統計軟件進行分析。計量數據均采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD 法）。檢驗水準為 α=0.05。
2 結果
2.1 CCK8 法觀察白藜蘆醇對 HepG2 細胞活力的影響
如圖 1a 所示，CCK8 實驗結果顯示，白藜蘆醇對 HepG2 細胞的生長具有明顯的抑制作用：相較于不加白藜蘆醇的 0 μmol/L 組而言，隨著濃度和時間的延長，各濃度組在不同時間點的 OD值均小于 0 μmol/L 組，表現出抑制效應；白藜蘆醇作用 48 h 后，各個濃度對細胞的抑制效應均增大，且 50 μmol/L濃度下細胞的抑制效應最大。
圖1
示 CCK8 法和 RTCA 系統檢測各濃度白藜蘆醇對 HepG2 細胞活力的影響、流式細胞儀檢測細胞凋亡情況以及 Western blot 法檢測各濃度白藜蘆醇對 HepG2 細胞中 PI3K/Akt 信號及其下游 CyclinA2 蛋白的表達結果
a：CCK8 法檢測的各濃度白藜蘆醇對 HepG2 細胞活力的影響結果；b：RTCA 系統示蹤曲線；c：RTCA 系統檢測各濃度白藜蘆醇對 HepG2 細胞活力的影響結果，與 0 μmol/L 和 6.25 μmol/L 比較，*
2.2 RTCA 系統觀察各濃度白藜蘆醇對 HepG2 細胞增殖的影響
通過 RTCA 系統檢測加藥后不同時間點不同濃度白藜蘆醇處理組細胞的 NCI 值，結果顯示，與 0 μmol/L 相比，白藜蘆醇在濃度為 6.25 μmol/L 時對 HepG2 細胞 NCI 值的影響不大；但從濃度為 12.5 μmol/L 開始，HepG2 細胞的 NCI 值顯著降低；且隨著時間的延長，12.5、25.0 和 50.0 μmol/L 白藜蘆醇組的 NCI 值逐漸降低（圖 1b）。
處理 12、24、36 和 48 h 時，同時點 0 μmol/L 組和 6.25 μmol/L 組的 NCI 值比較差異均無統計學意義（P>0.05），但同時點 12.5、25.0 及 50.0 μmol/L 組與 0 μmol/L 組比較，NCI 值均降低，差異有統計學意義（P<0.05），見圖 1c。
2.3 白藜蘆醇可以誘導 HepG2 細胞凋亡
4 組細胞的流式細胞儀檢測結果表明，白藜蘆醇可以誘導 HepG2 細胞發生細胞凋亡，且具有劑量依賴性。通過與 0 μmol/L 濃度比較，發現不同濃度白藜蘆醇可以誘導前肝癌細胞系 HepG2 的細胞凋亡，晚期凋亡細胞率由 0 μmol/L 處理組的 3.21% 上升到 50.0 μmol/L 白藜蘆醇處理組的 20.64%，具體見圖 1d–1g）。
2.4 白藜蘆醇在肝癌細胞中抑制 PI3K p85/Akt 信號的表達
Western blot 結果顯示，12.5、25.0 以及50.0 μmol/L 白藜蘆醇可以顯著降低 HepG2 細胞內 PI3K p85 蛋白的表達水平，與 0 μmol/L 白藜蘆醇組比較差異均有統計學意義（P<0.05），且白藜蘆醇的效應呈劑量依賴關系，即白藜蘆醇的給藥濃度越高越能降低 HepG2 細胞內 PI3K p85 的表達水平，3 個濃度組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。但白藜蘆醇對 HepG2 細胞內 t-Akt 蛋白的表達水平無顯著影響，4 組間比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 1h 和圖 1i。
此外，鑒于前述研究中觀察到白藜蘆醇對 HepG2 細胞內 t-Akt 蛋白的表達水平無顯著影響，而 Akt 的磷酸化也能從側面反映出 PI3K 信號通路的激活，故本研究進一步檢測 p-Akt 的水平。常規內參 GAPDH 檢測只能排除體系誤差，為明確p-Akt 的表達變化是因上樣量不同所致還是因白藜蘆醇作用而致，在后續結果分析中明確比較 p-Akt 蛋白的相對表達水平與 t-Akt 蛋白的相對表達水平的比值。結果表明，與 0 μmol/L 白藜蘆醇組比較，12.5、25.0 和 50.0 μmol/L 白藜蘆醇組的 p-Akt 和p-Akt/t-Akt 比值均較低（P<0.05），見圖 1i。該研究結果提示，白藜蘆醇抑制的是 HepG2 細胞內 Akt 的第 473 位絲氨酸的磷酸化。
2.5 白藜蘆醇在肝癌細胞中抑制 PI3K p85/Akt 下游 CyclinA2 蛋白的表達
Western blot 結果顯示，與 0 μmol/L 比較，12.5、25.0 和 50.0 μmol/L 白藜蘆醇可以顯著降低HepG2 細胞內 CyclinA2 蛋白的表達水平（P<0.05），且呈劑量依賴關系，即白藜蘆醇的給藥濃度越高越能降低 HepG2 細胞內 CyclinA2 蛋白的表達水平（圖 1j 和 1k）。
3 討論
白藜蘆醇的化學名稱為 3,5,4′-三羥基苯二烯，主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中，是植物在惡劣環境下或遭到病原體侵害時自身分泌的一種抵御感染的多酚類抗菌素[9]。白藜蘆醇作為一種天然的有多種生物學功能的植物化合物，具有降脂、抗氧化、抗癌、保護心腦血管、保肝、抗衰老、免疫調節、雌激素樣作用等功能。隨著研究的不斷深入發展，其藥理活性的研究逐漸得到關注，尤其在防治腫瘤、心血管疾病等方面顯示出巨大的應用潛力，有望開發成為可防治多種疾病的新型藥物，具有廣泛的應用前景[10]。研究發現，白藜蘆醇可以通過減少細胞凋亡、抑制脂質過氧化、抑制炎性細胞因子表達等，實現保護肝細胞、減輕肝損傷和促進肝功能恢復的目的[11-12]。離體或動物實驗觀察到，白藜蘆醇對消化、血液、呼吸、生殖等多個系統來源的多種腫瘤細胞都有拮抗作用[13]。本實驗在不同濃度白藜蘆醇處理 HepG2 肝癌細胞的研究中觀察到，白藜蘆醇對 HepG2 細胞的生長具有明顯的抑制作用，并且隨著時間的延長和白藜蘆醇濃度的增高，HepG2 細胞的活力越來越低。白藜蘆醇作用 48 h 后，各個濃度對細胞的抑制效應逐漸增大，且 50.0 μmol/L 濃度下細胞的抑制效應最強。進一步的 RTCA 系統研究也發現，白藜蘆醇對 HepG2 細胞的 NCI 值降低作用具有濃度依賴關系，即白藜蘆醇濃度越高對 HepG2 細胞的 NCI 值降低作用越強，且該作用具有時間依賴效應。以上結果也證實了，高濃度的白藜蘆醇可以抑制 HepG2 肝癌細胞的增殖，而白藜蘆醇抑制 HepG2 肝癌細胞增殖的效應也具有時間和劑量依賴效應。
白藜蘆醇抑制腫瘤細胞的生長，與其對細胞周期的調控相關[14]。白藜蘆醇在腫瘤的發生和發展過程中都具有抗腫瘤功效。這主要依靠其抗氧化性和抗突變作用，誘導第二相藥代酶產生（抗啟動活性）；此外，它可以傳遞抗炎作用并有抑制環氧合酶（COX）和過氧代氫酶的功能（即抗促進作用）[15-16]。白藜蘆醇通過誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、阻滯細胞周期、介導體液免疫應答、調節細胞因子分泌和拮抗腫瘤血管生成而影響腫瘤的發生發展[17]。Delmas 等[18]發現，白藜蘆醇作用于肝癌小鼠模型后，可以抑制周期蛋白的產生，降低周期蛋白依賴性蛋白激酶（CDK）蛋白表達和活性，阻滯細胞周期，達到抑制肝癌細胞增殖的作用；上述作用存在時間和劑量的依賴性。有實驗[18]表明，白藜蘆醇在短時間內可以通過濃度依賴性作用阻斷腫瘤的 DNA 合成，當作用時間延長后通過作用于細胞周期而起到阻滯腫瘤生長的作用；進一步實驗證實，白藜蘆醇可以通過減慢細胞周期循環速度或阻滯某一特定時相從而發揮其作用，這種作用與其濃度有關。經白藜蘆醇處理過的細胞不僅僅有相應的細胞周期改變，并伴有細胞核增大。Bishayee 等[19]對二乙亞硝胺誘導的動物肝癌的實驗研究發現，白藜蘆醇誘導腫瘤細胞凋亡的途徑之一可能是上調 Nrf2 核轉錄因子介導的蛋白及 mRNA 的表達，從而起促進肝癌細胞凋亡的作用[20]。
白藜蘆醇可通過多條途徑發揮抗腫瘤作用，其中 PI3K 信號轉導通路成為近年來的研究熱點[21-22]。在培養的小鼠 JB6 表皮細胞中，白藜蘆醇及其衍生物通過阻斷表皮生長因子介導的 PI3K/Akt 的活性而抑制腫瘤細胞的轉化[23-24]。在人類乳腺癌細胞中，白藜蘆醇通過影響與雌激素受體 α 相關的 PI3K 信號通路，從而阻斷細胞的生存和增殖[25-26]。筆者在本研究中觀察到，白藜蘆醇可以顯著降低 HepG2 細胞內 PI3K p85 的表達水平，且呈劑量依賴關系，即白藜蘆醇的給藥濃度越高越能下調 HepG2 細胞內 PI3K p85 的表達。雖然白藜蘆醇對 HepG2 細胞內 t-Akt 的表達水平無顯著影響，但白藜蘆醇可以顯著降低 HepG2 細胞內 p-Akt 的表達水平，且白藜蘆醇降低的是 HepG2 細胞內 Akt 的第 473 位絲氨酸的磷酸化。此外，本研究結果還顯示，白藜蘆醇可以顯著降低 HepG2 細胞內 PI3K p85/Akt 信號通路下游 CyclinA2 蛋白的表達水平，且呈劑量依賴關系，即白藜蘆醇的給藥濃度越高越能降低 HepG2 細胞內 CyclinA2 蛋白的表達水平。因此，結合前人研究與本實驗的觀察發現，筆者認為，白藜蘆醇可能通過 PI3K p85/Akt 信號軸來達到抗肝癌細胞增殖的作用，這為 HCC 的藥物治療提供了新的思路。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：周柯均撰寫文章和參與實驗；王城負責實驗質控；謝夢憶參與數據分析、整理及匯總；侯永川、熊云麟、劉瑜和鄧琳參與實驗。
