引用本文： 龔帥, 張蓬波, 張沖, 吳耐, 張易, 張秀忠, 孟凡超, 祁彥韋, 任澤強. 胃轉流術對非肥胖型2型糖尿病大鼠骨骼肌組織中MG53蛋白表達的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(4): 448-453. doi: 10.7507/1007-9424.201908050 復制
胃轉流術治療伴有病理性肥胖的 2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的效果已經得到國內外的認可，但其具體機制還未明確[1-2]。筆者所在團隊的既往研究[3-5]結果已顯示，胃轉流術可以改善肥胖型 T2DM 大鼠的肝臟和脂肪組織的胰島素抵抗。研究[6]報道，胃轉流術也可改善肥胖型 T2DM 大鼠的骨骼肌胰島素抵抗。骨骼肌是機體內最大的代謝器官，在機體的代謝調控中占據非常重要的地位。正常狀態下，骨骼肌對葡萄糖的攝取高達全身的 70%～90%，即便在饑餓時，它對血液中葡萄糖的利用率也達到 20% 左右，由此可見骨骼肌在機體糖代謝過程中占據更為重要的中心地位[7]。有研究[8]表明，骨骼肌發生胰島素抵抗很可能比脂肪和肝臟這兩大代謝中心更早，骨骼肌胰島素抵抗已經成為研究熱點。而筆者所在團隊前期的研究[9]成果證實了胃轉流術對非肥胖型 T2DM 大鼠也有確切的降糖效果，同時改善了骨骼肌的胰島素抵抗，胃轉流術可能通過降低骨骼肌中泛素化蛋白水平，降低胰島素受體底物 1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）蛋白的泛素化降解，從而上調了骨骼肌胰島素信號通路中 IRS-1 蛋白的表達，提高了骨骼肌組織的胰島素敏感性，以達到降糖效果。然而前期實驗僅僅研究了骨骼肌組織中泛素化蛋白的總體變化，并沒有深層次研究能特異性識別 IRS-1 的 E3 泛素連接酶的表達情況，而此次實驗是在前期實驗基礎上，更進一步觀察胃轉流術對非肥胖型 T2DM 大鼠骨骼肌中特異性識別 IRS-1 的 E3 泛素連接酶—膜修復蛋白 mitsugmin53（MG53）蛋白表達的影響，探討胃轉流術治療 T2DM 的可能機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要材料和試劑
雄性 GK 大鼠（一種自發性非肥胖型糖尿病大鼠模型）30 只，清潔級，周齡 8～12 周，體質量 308～334 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司；健康雄性 Wistar 大鼠 8 只，清潔級，周齡 8～12 周，體質量 301～320 g，購自徐州醫科大學動物實驗中心。MG53 抗體和 GAPDH 抗體購自美國 Abcam 公司；總 RNA 提取試劑盒（RNAprep pure Cell/Bacteria Kit）、反轉錄試劑盒（PrimeScript? RT reagent Kit）以及 PCR 試劑盒（EmeraldAmpTM PCR Master Mix）購自北京 Tiangen 公司。IRS-1 基因的引物序列為：上游引物，5′-CGGATACCGATGGCTTCT-3′；下游引物，5′-CTTGTGCCGCCACTTCTT-3；擴增產物長度為 176 bp。MG53 基因的引物序列為：上游引物，5′-GTTTGGGAGGTGTTCCGC-3′；下游引物，5′-CAGGACTGCTACACTCTT-3′；擴增產物長度為 246 bp。GAPDH 基因的引物序列為：上游引物，5′-GTTGGAGGTCGGAGTCAACGG-3′；下游引物：5′-GAGGGATCTCGCTCCTGGAGGA-3′；擴增產物長度為 230 bp。引物均由上海生工生物工程公司合成。山羊抗兔抗體以及山羊抗小鼠抗體由徐州醫科大學腫瘤生物研究所提供。
1.2 實驗方法
1.2.1 動物分組
按隨機數字表法隨機選擇 24 只 GK 大鼠，再按隨機數字表法隨機分為糖尿病手術組、糖尿病假手術組和糖尿病對照組，每組 8 只；其余 6 只備用。8 只 Wistar 大鼠作為正常對照組。
1.2.2 手術方式
4 組大鼠的手術術者以及具體操作過程均與前期實驗[9]相一致。手術過程見圖 1。
圖1
示術中部分手術過程圖
a：大鼠行 3% 戊巴比妥鈉麻醉后固定于手術臺；b：進腹后以紗布保護切口；c：正常胃腸結構的胃十二指腸交界處；d：切斷幽門，縫合關閉十二指腸端；e：距 Treitz 韌帶約 8 cm 處切斷空腸；f：遠端空腸與幽門行端端吻合；g：近端空腸與距胃腸吻合口約 12 cm 處空腸行端側吻合；h：檢查腹腔無活動性出血，逐層關閉腹腔
1.3 測定指標及方法
術后第 8 周時采用頸椎脫臼處死法處死實驗動物，取雙側腓腸肌組織于–80 ℃ 冰箱凍存。采用 Western blot 技術檢測術后第 8 周時各組大鼠骨骼肌組織中 MG53 蛋白的表達水平，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術檢測術后第 8 周時各組骨骼肌組織中 IRS-1 mRNA 和 MG53 mRNA 的表達水平。
1.3.1 Western blot 技術檢測 MG53 蛋白的表達水平
Western blot 法操作同參考文獻[9]。采用 Image J 分析軟件測定 MG53 蛋白和 GAPDH 蛋白條帶的灰度值，MG53 蛋白的表達水平以 MG53 與 GAPDH 條帶灰度值的比值來表示。
1.3.2 RT-PCR 法檢測 IRS-1 mRNA 和 MG53 mRNA 的表達水平
按 Trizol 說明書的方法提取骨骼肌組織的總 RNA，測定 RNA 濃度后，取 2 μg RNA 經逆轉錄酶逆轉錄成 cDNA，進行 PCR 擴增。PCR 反應體系一般為 20 μL：SYBR Master Mix 10 μL，RNase-free 水 7.2 μL，上下游引物各 0.4 μL，逆轉錄產物 2 μL。擴增程序同試劑盒說明書。目的基因的相對表達水平按照 2–ΔΔCt方法計算。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 16.0 軟件對數據進行分析。各組間比較采用方差分析，兩兩比較采用 LSD 法。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 4 組大鼠的圍手術期生存情況
糖尿病手術組和糖尿病假手術組的 8 例大鼠手術均順利完成，無術中死亡者。該 2 組大鼠術后 48 h 內均無死亡，死亡發生在術后 48 h 至 1 周內。糖尿病手術組大鼠死亡 2 只，其中 1 只死于胃腸吻合口漏，另 1 只尸檢時未發現腹腔明顯異常，無腹腔出血，死亡原因不明。糖尿病假手術組死亡1 只，尸檢時未發現腹腔明顯異常，未發現吻合口漏以及腹腔出血，但該大鼠死亡前出現反復腹瀉，為褐色稀便，考慮死亡與術后菌群失調以及細菌移位有關。死亡大鼠以備用 GK 大鼠重新手術來彌補。之后整個實驗觀察期間，未再發生死亡現象。糖尿病對照組和正常對照組大鼠在整個實驗過程中無死亡發生。
2.2 4 組大鼠術后第 8 周時 MG53 蛋白的表達結果
以 Western blot 技術檢測 4 組大鼠術后第 8 周時骨骼肌組織中 MG53 蛋白的表達，結果見圖 2。結果顯示，糖尿病假手術組及糖尿病對照組大鼠的 MG53 蛋白的表達水平均高于正常對照組和糖尿病手術組（P<0.05），但糖尿病手術組和正常對照組間比較、糖尿病假手術組和糖尿病對照組間比較差異均無統計學意義（P>0.05），具體見圖 2a 和圖 2d。
圖2
4 組術后第 8 周時 MG53 蛋白、ISR-1 mRNA 及 MG53 mRNA 的表達水平
a–c：MG53 蛋白（a）、ISR-1 mRNA（b）及 MG53 mRNA（c）的電泳結果；d–f：MG53 蛋白（d）、ISR-1 mRNA（e）及 MG53 mRNA（f）的表達水平結果；1：正常對照組；2：糖尿病對照組；3：糖尿病假手術組；4：糖尿病手術組；與正常對照組比較，*
2.3 4 組大鼠術后第 8 周時 IRS-1 mRNA 的表達結果
以 RT-PCR 技術檢測 4 組大鼠術后第 8 周時骨骼肌組織中 IRS-1 mRNA 的表達水平，其電泳結果見圖 2b，半定量結果見圖 2e。結果顯示，與正常對照組比較，糖尿病手術組、糖尿病假手術組及糖尿病對照組大鼠的 IRS-1 mRNA 的表達水平均較低，差異有統計學意義（P<0.05），但糖尿病手術組、糖尿病假手術組及糖尿病對照組大鼠的 IRS-1 mRNA 的表達水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.4 4 組大鼠術后第 8 周時 MG53 mRNA 的表達結果
以 RT-PCR 技術檢測 4 組大鼠術后第 8 周時骨骼肌組織中 MG53 mRNA 的表達水平，其電泳結果見圖 2c，半定量結果見圖 2f。結果顯示，糖尿病假手術組及糖尿病對照組大鼠的 MG53 mRNA 的表達水平均高于正常對照組和糖尿病手術組（P<0.05），但糖尿病手術組和正常對照組間比較、糖尿病假手術組和糖尿病對照組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
3 討論
胃轉流術治療 T2DM 的具體機制尚不清楚，國內外研究主要提出了兩種假說，包括“前腸假說”和“后腸假說”。“前腸假說”認為，十二指腸和近端空腸被排除出腸-胰島軸可以直接治療糖尿病；“后腸假說”認為，食物快速到達回腸改變了相關胃腸道激素的分泌狀態，從而降低了血糖[10-11]。盡管國內外學者提出了各種各樣的假說，并且實驗的結果也不完全相同，但對胃轉流術改善 T2DM 這個結果是共同一致的。起初，國外專家學者認為，胃轉流術后患者血糖的降低可能是因為術后體質量減輕、脂肪減少，從而增加了胰島素敏感性；但其后諸多研究均證實，術后飲食減少和體質量下降不是改善血糖的主要原因[12-13]。北京武警總醫院[14]給 12 例非肥胖者或輕度肥胖的 T2DM 患者施行胃轉流手術，術后血糖及糖耐量試驗指標均有顯著下降，糖尿病并發癥有所改善。國內王瑜等[15]報道，胃轉流術治療 103 例非肥胖 T2DM 的治愈率為 79.6%。由此可見，對于非肥胖 T2DM 患者，胃轉流術同樣具有良好的降糖效果，且其降糖作用不依賴于體質量的降低及飲食量的減少。因此本研究選取的模型是非肥胖型自發性 T2DM 大鼠，選取的手術方式也是采取保留胃原始容積的轉流手術，即十二指腸空腸旁路術。該術式是一種新型的手術改良術式，目前已應用于臨床，且取得了不錯的效果[16-17]。有研究表明，十二指腸空腸旁路術能夠明顯改善非肥胖糖尿病模型大鼠的糖耐量[18-19]，且不影響其體質量及進食量[20-21]，該術式避免了胃部分切除引起的攝食減少，從而造成的體質量減輕。
筆者所在團隊的前期研究[9]結果已顯示，糖尿病手術組術后前 4 周的體質量明顯低于術前（P<0.05），考慮與胃轉流手術本身的創傷以及營養狀態未恢復有關，而術后 8 周的體質量已恢復至術前（P>0.05），說明采取保留胃容積的轉流手術，對非肥胖的 T2DM 模型在術后 8 周后并不起到明顯減肥的作用，恰恰在術后 8 周，血糖并沒有因為體質量的恢復而重新升高，進一步證明了并不是因為體質量的減輕從而降低了血糖；并且術后第 8 周時糖尿病手術組的空腹血糖已由術前的（9.10±0.98）mmoL/L 降至（5.70±0.91）mmoL/L，穩態模型胰島素抵抗指數（homeostasis model-insulin resistant，HOMA-IR）也由術前的 3.18±0.50 降至 1.96±0.63，且差異均存在統計學意義，可見胃轉流術明顯改善了非肥胖型 T2DM 大鼠的胰島素抵抗，那么它是如何改善胰島素抵抗的呢？
外周胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷是導致 T2DM 的主要原因，其中胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）在胰島素信號轉導中有著重要作用，IRS 蛋白在胞內保持正常的水平和活性是胰島素發揮正常功能的重要條件，IRS 蛋白含量下降，使參與胰島素信號轉導的 IRS 蛋白數量下降，進而影響胰島素信號的傳遞，減弱靶細胞對胰島素的敏感性[22]，從而導致胰島素抵抗。其中，骨骼肌中存在的重要蛋白為 IRS-1 蛋白，且骨骼肌的胰島素抵抗在 T2DM 的發病機制中起到關鍵作用[23]。有研究[24]報道，在 T2DM 的發病早期即出現了骨骼肌的胰島素抵抗。通過筆者所在團隊的前期實驗[9]可以觀察到，胃轉流術后第 8 周時糖尿病手術組骨骼肌組織中 IRS-1 蛋白的表達水平顯著增加，明顯高于糖尿病假手術組和糖尿病對照組，也就是表明了胃轉流術可以上調骨骼肌組織中胰島素信號通路中 IRS-1 蛋白的表達水平，從而提高了胰島素的信號傳導，改善了骨骼肌的胰島素抵抗。那么，它是如何提高 IRS-1 蛋白表達水平的呢？
人們發現，胰島素抵抗的患者或動物模型中，存在大量的“IRS 分子數目”缺失[25-26]。研究[27]表明，ISR 的泛素化導致 ISR 的降解，從而使胰島素信號通路發生障礙，是導致 T2DM 發生的分子機制。本研究結果顯示，胃轉流術后第 8 周時，糖尿病手術組的 IRS-1 mRNA 的表達水平與糖尿病假手術組和糖尿病對照組相比差異無統計學意義，提示 IRS-1 表達在轉錄水平無差異。然而，筆者所在團隊的前期實驗[9]表明，術后第 8 周時糖尿病手術組 IRS-1 蛋白的表達水平卻明顯高于糖尿病假手術組和糖尿病對照組，提示 IRS-1 在蛋白翻譯水平出現了差異，因此考慮胃轉流術后糖尿病手術組 IRS-1 蛋白表達水平的增加可能主要與其蛋白降解減少有關。而泛素-蛋白酶體系統（ubiquitin-protesome system）被認為是生物體內最為主要的蛋白質選擇性降解方式，因此本實驗前期研究了術后第 8 周時骨骼肌組織的泛素化水平，研究[9]結果已顯示，糖尿病手術組泛素化蛋白水平明顯低于糖尿病假手術組和糖尿病對照組，尤其是在相對分子量為 180×103附近時最為明顯，而 IRS-1 蛋白的分子量恰好在這區域，也就佐證了胃轉流術降低了 IRS-1 蛋白的泛素化，減少了其降解。而本研究關注的 MG53 蛋白，已經被證實是骨骼肌胰島素信號的一個重要負性調控因子[28]，過表達 MG53 蛋白可導致骨骼肌的胰島素抵抗；反之，低表達 MG53 蛋白，可以維持 IRS-1 蛋白及胰島素信號的完整性。同樣，2013 年發表于《Nature》上的研究[7]結果表明，肌肉特異性蛋白 MG53 蛋白的異常高表達是胰島素抵抗和代謝綜合征發生發展的重要原因，第 1 次在整體水平和細胞水平層面證明了胰島素抵抗狀態下骨骼肌 IRS1 蛋白的降解機制，即 MG53 蛋白是 IRS-1 蛋白的 E3 泛素連接酶，靶向作用于 IRS-1 蛋白，使其泛素化后，在蛋白酶體的作用下發生降解，從而使胰島素信號通路受損，導致全身胰島素抵抗。本實驗團隊基于以上關于 MG53 蛋白的研究成果，通過研究胃轉流術后 MG53 蛋白的表達情況，來探討胃轉流術改善骨骼肌胰島素抵抗的可能機制。研究結果顯示，胃轉流術后第 8 周時，糖尿病假手術組及糖尿病對照組的 MG53 蛋白及其 mRNA 的表達水平均高于正常對照組（P<0.05），證明了 MG53 蛋白高表達在 T2DM 發生中有著重要作用；而糖尿病手術組的 MG53 蛋白及其 mRNA 表達水平均降低，明顯低于糖尿病假手術組和糖尿病對照組，差異有統計學意義（P<0.05），表明胃轉流術可以降低 T2DM 大鼠骨骼肌組織中 MG53 蛋白的表達水平，從而減少了 MG53 蛋白介導的 IRS-1蛋白的泛素化降解，這可能是 IRS-1 蛋白表達水平增高的主要原因，從而改善了 GK 大鼠骨骼肌組織的胰島素抵抗，降低了血糖。
通過此次實驗研究以及前期筆者所在團隊前期的實驗結果，可以觀察到，保留胃容積的胃轉流手術對非肥胖型 T2DM 大鼠的降糖作用是確切的，且明顯提高了骨骼肌的胰島素敏感性，改善了骨骼肌的胰島素抵抗。由于我國非肥胖 T2DM 人口眾多，所以保留胃容積的轉流手術既不影響術后飲食量，又改善了血糖，更有臨床意義。因此，外科手術治療糖尿病具有很好的前景，深入研究胃轉流術治療糖尿病的機制，特別是對于非肥胖型 T2DM 的治療機理，更符合我國的現狀，有助于為非肥胖型 T2DM 的治療開辟新的路徑。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：本研究由龔帥、任澤強和張蓬波設計；實驗動物手術操作由張秀忠、張沖和龔帥完成；資料統計和數據分析由吳耐、張易、孟凡超和祁彥韋完成；論文寫作由龔帥完成。
倫理聲明：本研究通過了徐州醫科大學附屬醫院臨床試驗倫理委員會的審批（倫理編號：XYFY2018-KL113）。
胃轉流術治療伴有病理性肥胖的 2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的效果已經得到國內外的認可，但其具體機制還未明確[1-2]。筆者所在團隊的既往研究[3-5]結果已顯示，胃轉流術可以改善肥胖型 T2DM 大鼠的肝臟和脂肪組織的胰島素抵抗。研究[6]報道，胃轉流術也可改善肥胖型 T2DM 大鼠的骨骼肌胰島素抵抗。骨骼肌是機體內最大的代謝器官，在機體的代謝調控中占據非常重要的地位。正常狀態下，骨骼肌對葡萄糖的攝取高達全身的 70%～90%，即便在饑餓時，它對血液中葡萄糖的利用率也達到 20% 左右，由此可見骨骼肌在機體糖代謝過程中占據更為重要的中心地位[7]。有研究[8]表明，骨骼肌發生胰島素抵抗很可能比脂肪和肝臟這兩大代謝中心更早，骨骼肌胰島素抵抗已經成為研究熱點。而筆者所在團隊前期的研究[9]成果證實了胃轉流術對非肥胖型 T2DM 大鼠也有確切的降糖效果，同時改善了骨骼肌的胰島素抵抗，胃轉流術可能通過降低骨骼肌中泛素化蛋白水平，降低胰島素受體底物 1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）蛋白的泛素化降解，從而上調了骨骼肌胰島素信號通路中 IRS-1 蛋白的表達，提高了骨骼肌組織的胰島素敏感性，以達到降糖效果。然而前期實驗僅僅研究了骨骼肌組織中泛素化蛋白的總體變化，并沒有深層次研究能特異性識別 IRS-1 的 E3 泛素連接酶的表達情況，而此次實驗是在前期實驗基礎上，更進一步觀察胃轉流術對非肥胖型 T2DM 大鼠骨骼肌中特異性識別 IRS-1 的 E3 泛素連接酶—膜修復蛋白 mitsugmin53（MG53）蛋白表達的影響，探討胃轉流術治療 T2DM 的可能機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要材料和試劑
雄性 GK 大鼠（一種自發性非肥胖型糖尿病大鼠模型）30 只，清潔級，周齡 8～12 周，體質量 308～334 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司；健康雄性 Wistar 大鼠 8 只，清潔級，周齡 8～12 周，體質量 301～320 g，購自徐州醫科大學動物實驗中心。MG53 抗體和 GAPDH 抗體購自美國 Abcam 公司；總 RNA 提取試劑盒（RNAprep pure Cell/Bacteria Kit）、反轉錄試劑盒（PrimeScript? RT reagent Kit）以及 PCR 試劑盒（EmeraldAmpTM PCR Master Mix）購自北京 Tiangen 公司。IRS-1 基因的引物序列為：上游引物，5′-CGGATACCGATGGCTTCT-3′；下游引物，5′-CTTGTGCCGCCACTTCTT-3；擴增產物長度為 176 bp。MG53 基因的引物序列為：上游引物，5′-GTTTGGGAGGTGTTCCGC-3′；下游引物，5′-CAGGACTGCTACACTCTT-3′；擴增產物長度為 246 bp。GAPDH 基因的引物序列為：上游引物，5′-GTTGGAGGTCGGAGTCAACGG-3′；下游引物：5′-GAGGGATCTCGCTCCTGGAGGA-3′；擴增產物長度為 230 bp。引物均由上海生工生物工程公司合成。山羊抗兔抗體以及山羊抗小鼠抗體由徐州醫科大學腫瘤生物研究所提供。
1.2 實驗方法
1.2.1 動物分組
按隨機數字表法隨機選擇 24 只 GK 大鼠，再按隨機數字表法隨機分為糖尿病手術組、糖尿病假手術組和糖尿病對照組，每組 8 只；其余 6 只備用。8 只 Wistar 大鼠作為正常對照組。
1.2.2 手術方式
4 組大鼠的手術術者以及具體操作過程均與前期實驗[9]相一致。手術過程見圖 1。
圖1
示術中部分手術過程圖
a：大鼠行 3% 戊巴比妥鈉麻醉后固定于手術臺；b：進腹后以紗布保護切口；c：正常胃腸結構的胃十二指腸交界處；d：切斷幽門，縫合關閉十二指腸端；e：距 Treitz 韌帶約 8 cm 處切斷空腸；f：遠端空腸與幽門行端端吻合；g：近端空腸與距胃腸吻合口約 12 cm 處空腸行端側吻合；h：檢查腹腔無活動性出血，逐層關閉腹腔
1.3 測定指標及方法
術后第 8 周時采用頸椎脫臼處死法處死實驗動物，取雙側腓腸肌組織于–80 ℃ 冰箱凍存。采用 Western blot 技術檢測術后第 8 周時各組大鼠骨骼肌組織中 MG53 蛋白的表達水平，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術檢測術后第 8 周時各組骨骼肌組織中 IRS-1 mRNA 和 MG53 mRNA 的表達水平。
1.3.1 Western blot 技術檢測 MG53 蛋白的表達水平
Western blot 法操作同參考文獻[9]。采用 Image J 分析軟件測定 MG53 蛋白和 GAPDH 蛋白條帶的灰度值，MG53 蛋白的表達水平以 MG53 與 GAPDH 條帶灰度值的比值來表示。
1.3.2 RT-PCR 法檢測 IRS-1 mRNA 和 MG53 mRNA 的表達水平
按 Trizol 說明書的方法提取骨骼肌組織的總 RNA，測定 RNA 濃度后，取 2 μg RNA 經逆轉錄酶逆轉錄成 cDNA，進行 PCR 擴增。PCR 反應體系一般為 20 μL：SYBR Master Mix 10 μL，RNase-free 水 7.2 μL，上下游引物各 0.4 μL，逆轉錄產物 2 μL。擴增程序同試劑盒說明書。目的基因的相對表達水平按照 2–ΔΔCt方法計算。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 16.0 軟件對數據進行分析。各組間比較采用方差分析，兩兩比較采用 LSD 法。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 4 組大鼠的圍手術期生存情況
糖尿病手術組和糖尿病假手術組的 8 例大鼠手術均順利完成，無術中死亡者。該 2 組大鼠術后 48 h 內均無死亡，死亡發生在術后 48 h 至 1 周內。糖尿病手術組大鼠死亡 2 只，其中 1 只死于胃腸吻合口漏，另 1 只尸檢時未發現腹腔明顯異常，無腹腔出血，死亡原因不明。糖尿病假手術組死亡1 只，尸檢時未發現腹腔明顯異常，未發現吻合口漏以及腹腔出血，但該大鼠死亡前出現反復腹瀉，為褐色稀便，考慮死亡與術后菌群失調以及細菌移位有關。死亡大鼠以備用 GK 大鼠重新手術來彌補。之后整個實驗觀察期間，未再發生死亡現象。糖尿病對照組和正常對照組大鼠在整個實驗過程中無死亡發生。
2.2 4 組大鼠術后第 8 周時 MG53 蛋白的表達結果
以 Western blot 技術檢測 4 組大鼠術后第 8 周時骨骼肌組織中 MG53 蛋白的表達，結果見圖 2。結果顯示，糖尿病假手術組及糖尿病對照組大鼠的 MG53 蛋白的表達水平均高于正常對照組和糖尿病手術組（P<0.05），但糖尿病手術組和正常對照組間比較、糖尿病假手術組和糖尿病對照組間比較差異均無統計學意義（P>0.05），具體見圖 2a 和圖 2d。
圖2
4 組術后第 8 周時 MG53 蛋白、ISR-1 mRNA 及 MG53 mRNA 的表達水平
a–c：MG53 蛋白（a）、ISR-1 mRNA（b）及 MG53 mRNA（c）的電泳結果；d–f：MG53 蛋白（d）、ISR-1 mRNA（e）及 MG53 mRNA（f）的表達水平結果；1：正常對照組；2：糖尿病對照組；3：糖尿病假手術組；4：糖尿病手術組；與正常對照組比較，*
2.3 4 組大鼠術后第 8 周時 IRS-1 mRNA 的表達結果
以 RT-PCR 技術檢測 4 組大鼠術后第 8 周時骨骼肌組織中 IRS-1 mRNA 的表達水平，其電泳結果見圖 2b，半定量結果見圖 2e。結果顯示，與正常對照組比較，糖尿病手術組、糖尿病假手術組及糖尿病對照組大鼠的 IRS-1 mRNA 的表達水平均較低，差異有統計學意義（P<0.05），但糖尿病手術組、糖尿病假手術組及糖尿病對照組大鼠的 IRS-1 mRNA 的表達水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.4 4 組大鼠術后第 8 周時 MG53 mRNA 的表達結果
以 RT-PCR 技術檢測 4 組大鼠術后第 8 周時骨骼肌組織中 MG53 mRNA 的表達水平，其電泳結果見圖 2c，半定量結果見圖 2f。結果顯示，糖尿病假手術組及糖尿病對照組大鼠的 MG53 mRNA 的表達水平均高于正常對照組和糖尿病手術組（P<0.05），但糖尿病手術組和正常對照組間比較、糖尿病假手術組和糖尿病對照組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
3 討論
胃轉流術治療 T2DM 的具體機制尚不清楚，國內外研究主要提出了兩種假說，包括“前腸假說”和“后腸假說”。“前腸假說”認為，十二指腸和近端空腸被排除出腸-胰島軸可以直接治療糖尿病；“后腸假說”認為，食物快速到達回腸改變了相關胃腸道激素的分泌狀態，從而降低了血糖[10-11]。盡管國內外學者提出了各種各樣的假說，并且實驗的結果也不完全相同，但對胃轉流術改善 T2DM 這個結果是共同一致的。起初，國外專家學者認為，胃轉流術后患者血糖的降低可能是因為術后體質量減輕、脂肪減少，從而增加了胰島素敏感性；但其后諸多研究均證實，術后飲食減少和體質量下降不是改善血糖的主要原因[12-13]。北京武警總醫院[14]給 12 例非肥胖者或輕度肥胖的 T2DM 患者施行胃轉流手術，術后血糖及糖耐量試驗指標均有顯著下降，糖尿病并發癥有所改善。國內王瑜等[15]報道，胃轉流術治療 103 例非肥胖 T2DM 的治愈率為 79.6%。由此可見，對于非肥胖 T2DM 患者，胃轉流術同樣具有良好的降糖效果，且其降糖作用不依賴于體質量的降低及飲食量的減少。因此本研究選取的模型是非肥胖型自發性 T2DM 大鼠，選取的手術方式也是采取保留胃原始容積的轉流手術，即十二指腸空腸旁路術。該術式是一種新型的手術改良術式，目前已應用于臨床，且取得了不錯的效果[16-17]。有研究表明，十二指腸空腸旁路術能夠明顯改善非肥胖糖尿病模型大鼠的糖耐量[18-19]，且不影響其體質量及進食量[20-21]，該術式避免了胃部分切除引起的攝食減少，從而造成的體質量減輕。
筆者所在團隊的前期研究[9]結果已顯示，糖尿病手術組術后前 4 周的體質量明顯低于術前（P<0.05），考慮與胃轉流手術本身的創傷以及營養狀態未恢復有關，而術后 8 周的體質量已恢復至術前（P>0.05），說明采取保留胃容積的轉流手術，對非肥胖的 T2DM 模型在術后 8 周后并不起到明顯減肥的作用，恰恰在術后 8 周，血糖并沒有因為體質量的恢復而重新升高，進一步證明了并不是因為體質量的減輕從而降低了血糖；并且術后第 8 周時糖尿病手術組的空腹血糖已由術前的（9.10±0.98）mmoL/L 降至（5.70±0.91）mmoL/L，穩態模型胰島素抵抗指數（homeostasis model-insulin resistant，HOMA-IR）也由術前的 3.18±0.50 降至 1.96±0.63，且差異均存在統計學意義，可見胃轉流術明顯改善了非肥胖型 T2DM 大鼠的胰島素抵抗，那么它是如何改善胰島素抵抗的呢？
外周胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷是導致 T2DM 的主要原因，其中胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）在胰島素信號轉導中有著重要作用，IRS 蛋白在胞內保持正常的水平和活性是胰島素發揮正常功能的重要條件，IRS 蛋白含量下降，使參與胰島素信號轉導的 IRS 蛋白數量下降，進而影響胰島素信號的傳遞，減弱靶細胞對胰島素的敏感性[22]，從而導致胰島素抵抗。其中，骨骼肌中存在的重要蛋白為 IRS-1 蛋白，且骨骼肌的胰島素抵抗在 T2DM 的發病機制中起到關鍵作用[23]。有研究[24]報道，在 T2DM 的發病早期即出現了骨骼肌的胰島素抵抗。通過筆者所在團隊的前期實驗[9]可以觀察到，胃轉流術后第 8 周時糖尿病手術組骨骼肌組織中 IRS-1 蛋白的表達水平顯著增加，明顯高于糖尿病假手術組和糖尿病對照組，也就是表明了胃轉流術可以上調骨骼肌組織中胰島素信號通路中 IRS-1 蛋白的表達水平，從而提高了胰島素的信號傳導，改善了骨骼肌的胰島素抵抗。那么，它是如何提高 IRS-1 蛋白表達水平的呢？
人們發現，胰島素抵抗的患者或動物模型中，存在大量的“IRS 分子數目”缺失[25-26]。研究[27]表明，ISR 的泛素化導致 ISR 的降解，從而使胰島素信號通路發生障礙，是導致 T2DM 發生的分子機制。本研究結果顯示，胃轉流術后第 8 周時，糖尿病手術組的 IRS-1 mRNA 的表達水平與糖尿病假手術組和糖尿病對照組相比差異無統計學意義，提示 IRS-1 表達在轉錄水平無差異。然而，筆者所在團隊的前期實驗[9]表明，術后第 8 周時糖尿病手術組 IRS-1 蛋白的表達水平卻明顯高于糖尿病假手術組和糖尿病對照組，提示 IRS-1 在蛋白翻譯水平出現了差異，因此考慮胃轉流術后糖尿病手術組 IRS-1 蛋白表達水平的增加可能主要與其蛋白降解減少有關。而泛素-蛋白酶體系統（ubiquitin-protesome system）被認為是生物體內最為主要的蛋白質選擇性降解方式，因此本實驗前期研究了術后第 8 周時骨骼肌組織的泛素化水平，研究[9]結果已顯示，糖尿病手術組泛素化蛋白水平明顯低于糖尿病假手術組和糖尿病對照組，尤其是在相對分子量為 180×103附近時最為明顯，而 IRS-1 蛋白的分子量恰好在這區域，也就佐證了胃轉流術降低了 IRS-1 蛋白的泛素化，減少了其降解。而本研究關注的 MG53 蛋白，已經被證實是骨骼肌胰島素信號的一個重要負性調控因子[28]，過表達 MG53 蛋白可導致骨骼肌的胰島素抵抗；反之，低表達 MG53 蛋白，可以維持 IRS-1 蛋白及胰島素信號的完整性。同樣，2013 年發表于《Nature》上的研究[7]結果表明，肌肉特異性蛋白 MG53 蛋白的異常高表達是胰島素抵抗和代謝綜合征發生發展的重要原因，第 1 次在整體水平和細胞水平層面證明了胰島素抵抗狀態下骨骼肌 IRS1 蛋白的降解機制，即 MG53 蛋白是 IRS-1 蛋白的 E3 泛素連接酶，靶向作用于 IRS-1 蛋白，使其泛素化后，在蛋白酶體的作用下發生降解，從而使胰島素信號通路受損，導致全身胰島素抵抗。本實驗團隊基于以上關于 MG53 蛋白的研究成果，通過研究胃轉流術后 MG53 蛋白的表達情況，來探討胃轉流術改善骨骼肌胰島素抵抗的可能機制。研究結果顯示，胃轉流術后第 8 周時，糖尿病假手術組及糖尿病對照組的 MG53 蛋白及其 mRNA 的表達水平均高于正常對照組（P<0.05），證明了 MG53 蛋白高表達在 T2DM 發生中有著重要作用；而糖尿病手術組的 MG53 蛋白及其 mRNA 表達水平均降低，明顯低于糖尿病假手術組和糖尿病對照組，差異有統計學意義（P<0.05），表明胃轉流術可以降低 T2DM 大鼠骨骼肌組織中 MG53 蛋白的表達水平，從而減少了 MG53 蛋白介導的 IRS-1蛋白的泛素化降解，這可能是 IRS-1 蛋白表達水平增高的主要原因，從而改善了 GK 大鼠骨骼肌組織的胰島素抵抗，降低了血糖。
通過此次實驗研究以及前期筆者所在團隊前期的實驗結果，可以觀察到，保留胃容積的胃轉流手術對非肥胖型 T2DM 大鼠的降糖作用是確切的，且明顯提高了骨骼肌的胰島素敏感性，改善了骨骼肌的胰島素抵抗。由于我國非肥胖 T2DM 人口眾多，所以保留胃容積的轉流手術既不影響術后飲食量，又改善了血糖，更有臨床意義。因此，外科手術治療糖尿病具有很好的前景，深入研究胃轉流術治療糖尿病的機制，特別是對于非肥胖型 T2DM 的治療機理，更符合我國的現狀，有助于為非肥胖型 T2DM 的治療開辟新的路徑。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：本研究由龔帥、任澤強和張蓬波設計；實驗動物手術操作由張秀忠、張沖和龔帥完成；資料統計和數據分析由吳耐、張易、孟凡超和祁彥韋完成；論文寫作由龔帥完成。
倫理聲明：本研究通過了徐州醫科大學附屬醫院臨床試驗倫理委員會的審批（倫理編號：XYFY2018-KL113）。
