引用本文： 姚建鋒, 田利飛, 張曉龍, 孫學軍. 基因芯片檢測 c-Met 表達對結直腸癌侵襲和轉移的機制研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(4): 442-447. doi: 10.7507/1007-9424.201908012 復制
本研究前期發現 c-Met 基因在結直腸癌組織中高表達[1]。前期細胞功能試驗[2]表明，c-Met 與肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）結合后和結直腸癌侵襲、轉移有關，但 c-Met 與 HGF 結合后通過何種機制來影響結直腸癌侵襲、轉移，目前仍不清楚。為了進一步研究該機制，我們在 SW480 細胞中敲低了 c-Met 基因，通過基因芯片篩選差異基因，得到了 399 個上調基因，286 個下調基因，通過生物信息學分析發現，敲低 c-Met 后，HGF 信號通路中很多分子諸如：PIK3CA、AKT2、PIK3CA、MAP2K4、MAP3K7、MEKK、JNK 等表達發生變化，該通路被抑制。有文獻[3-5]報道 AKT2、PIK3CA 及 MAP2K4 這些分子與腫瘤的侵襲、轉移相關，本研究通過 IPA（ingenuity pathway anaylsis）相互作用網絡分析表明，Met 可能與 HGF 通路網絡中上述基因存在相互作用關系；進一步 qPCR 驗證發現 AKT2、PIK3CA 和 MAP2K4 基因表達降低，與芯片結果一致，說明 c-Met 可能通過對 HGF 通路中 AKT2、PIK3CA 和 MAP2K4 的調控影響了結直腸癌的侵襲、轉移。
1 材料與方法
1.1 主要儀器與試劑
1.1.1 芯片信息
人基因表達譜芯片（購自于 Affymetrix 公司）。
1.1.2 主要儀器、試劑
紫外分光光度計 Thremo Nanodrop 2000（Thremo 公司）、生物芯片分析系統 Aglient 2100 Bioanalyzer（Aglient 公司）、基因芯片雜交儀 Genechip Hybridization Oven 645（Affymetrix 公司）、基因芯片洗滌工作站 Genechip Fluidics Station 450（Affymetrix 公司）、基因芯片掃描儀 Genechip Scanner 3000（Affymetrix 公司）、Aglient RNA 6000 納米試劑盒 Aglient RNA 6000 Nano Kit（購自 Thremo 公司）、基因芯片 3′IVT Plus 試劑盒 Genechip 3′IVT Plus Kit（購自 Aglient 公司）、基因芯片雜交清洗染色試劑盒 Genechip Hybridization Wash and Stain Kit（購自 Affymetrix 公司），SW480 細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。
1.2 方法
1.2.1 RNA 抽提
按試劑盒說明書采用 Trizol 法對 SW480 細胞沉淀樣品進行總 RNA 抽提。抽提所得總 RNA 經紫外分光光度計（Nanodrop 2000）和生物芯片分析系統（Aglient Bioanalyzer 2100）質檢，合格樣品進入芯片實驗。其質控標準：Thermo NanoDrop 2000 1.7<A260/A280<2.2；Agilent 2100 Bioanalyzer RIN≥7.0、28S/18S>0.7。其中，A260/A280 表示微量分光光度計測 260 nm/280 nm 吸收值的比值，用于評估蛋白質污染比例；RIN 表示 RNA 的完整性，用于評估 RNA 的完整性；28S/18S 表示 28sRNA 亮度與 18sRNA 亮度比值，28S/18S>0.7 提示加樣孔附近條帶產物中未混有 DNA。
1.2.2 芯片檢測與數據的處理分析
RNA 樣品進行質控合格后，進行芯片檢測，得到的結果進行處理分析，按照基因在實驗組相對于對照組的表達差異倍數（Fold Change）的絕對值|Fold Change|≥1.2，且錯誤發現率（false discovery rate，FDR）<0.05 篩選差異基因。對差異基因進行功能聚類分析，通過 IPA 分析細胞信號通路和相關的差異基因相互作用網絡以及相關基因與上游調控分子間的作用關系。
1.2.3 qPCR 下游基因檢測
綜合以上生信分析，選取被抑制的信號通路中相關基因進行 qPCR 驗證。用 2–ΔΔCt 反映敲低組（敲低 c-Met 后）各基因（AKT2、PIK3CA 和 MAP2K4）樣品相對于對照組（未敲低 c-Met 時）樣品目的基因的相對表達水平，其中，ΔCt=目的基因 Ct 值-內參基因 Ct 值，–ΔΔCt=NC 組 ΔCt 平均值-各樣品 ΔCt 值。
1.3 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件對數據進行分析處理，每組實驗重復 3 次，數據資料的結果用均數±標準差（
±s）表示，組間比較用 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 RNA 質檢結果
質檢結果見表 1，其結果提示 c-Met 敲低組和對照組樣品均合格。
表1
RNA 質檢結果
2.2 芯片數據顯著性差異分析
2.2.1 基因篩選結果
芯片結果表明：敲低 c-Met 后，SW480 細胞中上調基因數目 399 個，下調基因數目 286 個，見圖 1a。
圖1
芯片數據顯著性差異分析結果
a：芯片數據火山圖，橫坐標為差異倍數（以 2 為底的對數變換）；縱坐標為差異的顯著性 FDR（以 10 為底的對數變換）；紅色點為以|Fold Change|≥1.2 且 FDR<0.05 為標準篩選的顯著性差異基因，灰色點為其他無顯著差異的基因；b：示敲低組和對照組樣本層次聚類熱圖
2.2.2 差異基因分析結果
在聚類分析熱圖中，每一列代表 1 個樣本，每一行表示 1 個差異基因；上部樹狀結構是根據差異基因的表達譜生成的所有樣本的聚集或分類情況；左側樹狀結構表示差異基因的表達模式聚集情況；紅色表示基因的表達程度相對上調，綠色表示基因的表達程度相對下調，黑色表示基因的表達沒有顯著變化，灰色表示基因的信號強度未檢出。差異基因分析結果見圖 1b。由圖 1b 可見，c-Met 敲低后，對 SW480 細胞的基因表達水平產生了明顯的影響。
2.3 顯著性差異基因生物信息分析結果
2.3.1 基于 IPA 的經典通路分析結果
圖 2a 展示了差異基因在經典通路中的富集情況，其中，橫坐標為通路名稱，縱坐標為富集的顯著性水平（以 10 為底的負對數變換）；橙色標注表示通路被激活（Z-score>0），藍色標注表示通路被抑制（Z-score<0），橙色和藍色的深淺（或 Z-score 的絕對值）代表激活或抑制的程度。Ratio 表示在此信號通路中差異基因數與該通路中包含的所有基因數的比值。由圖 2a 可見，HGF 信號通路被抑制，Z-score<0。圖 2b 展示了實驗結果中各基因在通路中的表達變化趨勢。由圖 2b 可見，HGF 信號通路被抑制，紅色代表該基因在實驗結果中顯著上調，綠色代表該基因在實驗結果中顯著下調。通過圖 2c 發現，在激活狀態下，Met 與 PIK3CA、AKT2、PIK3CA、MAP2K4、MAP3K7、MEKK 及 JNK 基因上調，而通過圖 2b 發現，敲低 c-Met 后，AKT2、PIK3CA 和 MAP2K4 基因表達下調。
圖2
示基于 IPA 的經典通路（a–c）和基于 IPA 相互作用網絡（d）的顯著性差異基因生物信息分析結果以及 qPCR 檢測結果
a：經典通路富集分析統計圖；b：HGF 經典通路中各分子在實驗結果中的表達變化趨勢；c：激活狀態下 HGF 經典通路中各分子的表達變化趨勢；d：基因相互作用網絡圖；e：qPCR 檢測結果
2.3.2 基于 IPA 的相互作用網絡分析結果
網絡圖展示了 Met 與 HGF 通路相關分子中差異基因之間的相互作用網絡，其中紅色代表基因被激活，綠色代表基因被抑制。由圖 2d 可見，c-Met 敲低后，網絡中 AKT2、PIK3CA 和 MAP2K4 下調。
2.4 qPCR 基因檢測結果
綜合以上生物信息學分析，推測目的基因 c-Met 可能通過調節 HGF 通路中差異基因 AKT2、PIK3CA 及 MAP2K4 影響腫瘤的侵襲、轉移能力。因此本研究選擇了 HGF 通路中上述基因進行 qPCR 驗證。結果發現，敲低組的 AKT2、PIK3CA 和 MAP2K4 基因的 2–ΔΔCt值分別為 0.558±0.040、0.508±0.039 和 0.658±0.128，對照組的 AKT2、PIK3CA 和 MAP2K4 基因的 2–ΔΔCt值分別為 1.000±0.032、1.000±0.035 和 1.003±0.095，提示敲低組的 AKT2、PIK3CA 和 MAP2K4 基因 mRNA 表達水平相對于對照組明顯下調，各基因 mRNA 表達水平 2 組間的差異均有統計學意義（P=0.000、P=7.967E-05、P=0.012），與芯片結果相符（圖 2e）。
3 討論
基因芯片分析方法已廣泛應用于越來越多的基因分析領域[6-7]。以往報道[8-15]證實，c-Met 與人類多種腫瘤關系密切。本研究通過對 c-Met 敲低后 SW480 細胞表達差異的基因進行深入的分析，發現顯著上調基因占總基因數的 1.014%（399/39 345），顯著下調基因占總基因數的 0.727%（286/33 945）。
HGF/c-Met 信號在很多生理過程中發揮著重要作用，該信號異常可導致腫瘤形成或引起腫瘤轉移[16]。Bradley 等[17]研究發現，運用 RNA 干擾技術下調 c-Met 基因的表達,盡管在 HGF 誘導下，轉染后的腫瘤細胞的遷移及侵襲能力仍明顯下降。本研究通過 IPA 分析，發現 c-Met 敲低后，HGF 信號通路發生了變化，其中 HGF 信號通路被抑制，因此推測 c-Met 有可能通過 HGF 通路調節結直腸癌的侵襲、轉移。這與前期功能分析[2]發現 c-Met 敲低后，盡管在 HGF 的調節下，SW480 細胞的侵襲及轉移能力仍被顯著抑制的結果一致。
AKT2 又稱絲氨酸、蘇氨酸激酶 2，是 AKT（蛋白激酶 B）的重要亞型之一。主要介導體內 PI3K/AKT2 信號傳導通路，通過上調 β-整合素、MMP-2 和 MMP-9 蛋白表達，從而促進腫瘤細胞的侵襲和遷移能力。研究[18]表明，許多人類組織中均存在 AKT2 的過度表達。而 AKT2 過度表達能夠使 NIH3T3 細胞發生惡性轉化，其結果與腫瘤的發生、發展更為緊密[19-23]。另有研究[24]表明，結直腸癌中 AKT 通過調控 MTSI 表達抑制腫瘤細胞的增殖和轉移。PIK3CA 是蛋白激酶 PI3K 的催化亞基。生理情況下，PIK3CA 多以非激活的形式存在于人體組織中，突變后基因及其蛋白均可過度表達，PIK3CA 基因突變會導致 PI3K/AKT 信號通路激活，使細胞脫離生長因子的調控而增殖，提高細胞的侵襲和轉移能力[25]。Samuels 等[26]給無胸腺裸鼠分別注射包含野生型和突變型 PIK3CA 細胞克隆，結果發現注射野生型 PIK3CA 細胞的小鼠體內未發現腫瘤生長，而注射突變型 PIK3CA 細胞克隆小鼠體內的不同部位發現了多處腫瘤生長，且存在腫瘤的侵襲和轉移現象。另有研究[27]表明，在包含 PIK3CA 突變的細胞中加入 PI3K 抑制劑或采用小 RNA 干擾（siRNA）敲減腫瘤細胞的 PIK3CA 基因，都能顯著抑制細胞的生長增殖。MAP2K4 又稱絲裂原活化蛋白激酶 4，是絲裂原活化蛋白激酶激活劑家族成員之一，能夠調節絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的激活，使信號通路下游分子 P38MAPK、JNK 等發生激活并促進細胞侵襲。有研究[28]表明，MAP2K4 過表達可增加前列腺癌的轉移，且通過調節熱休克蛋白 27（HSP27）抑制 MAP2K4 的激活可降低前列腺癌的轉移能力。
本研究中，相互作用網絡分析結果表明，HGF 通路中 Met 基因通過與 AKT2、PIK3CA 和 MAP2K4 基因的相互作用發揮功能，且 c-Met 敲低后，上述基因表達下調，推測 c-met 可能通過對上述基因的調控影響了腫瘤的侵襲和轉移。經進一步 qPCR 驗證，Met 敲低后，AKT2、PIK3CA 及 MAP2K4 基因表達下調，證實了該推測。表明 c-Met 可能通過 HGF 通路中對 AKT2、PIK3CA 及 MAP2K4 基因的調控影響結直腸癌的侵襲、轉移。這為進一步研究 c-Met 通過 HGF 通路如何調節結直腸癌的侵襲和轉移提供了思路。
重要聲明
利益沖突聲明：本研究所有作者均聲明無利益沖突。
作者貢獻聲明：孫學軍負責實驗總體設計及管理，姚建鋒負責實驗執行及質量質控；田利飛負責芯片實驗及下游基因檢測；張曉龍負責實驗數據整理及統計分析。
本研究前期發現 c-Met 基因在結直腸癌組織中高表達[1]。前期細胞功能試驗[2]表明，c-Met 與肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）結合后和結直腸癌侵襲、轉移有關，但 c-Met 與 HGF 結合后通過何種機制來影響結直腸癌侵襲、轉移，目前仍不清楚。為了進一步研究該機制，我們在 SW480 細胞中敲低了 c-Met 基因，通過基因芯片篩選差異基因，得到了 399 個上調基因，286 個下調基因，通過生物信息學分析發現，敲低 c-Met 后，HGF 信號通路中很多分子諸如：PIK3CA、AKT2、PIK3CA、MAP2K4、MAP3K7、MEKK、JNK 等表達發生變化，該通路被抑制。有文獻[3-5]報道 AKT2、PIK3CA 及 MAP2K4 這些分子與腫瘤的侵襲、轉移相關，本研究通過 IPA（ingenuity pathway anaylsis）相互作用網絡分析表明，Met 可能與 HGF 通路網絡中上述基因存在相互作用關系；進一步 qPCR 驗證發現 AKT2、PIK3CA 和 MAP2K4 基因表達降低，與芯片結果一致，說明 c-Met 可能通過對 HGF 通路中 AKT2、PIK3CA 和 MAP2K4 的調控影響了結直腸癌的侵襲、轉移。
1 材料與方法
1.1 主要儀器與試劑
1.1.1 芯片信息
人基因表達譜芯片（購自于 Affymetrix 公司）。
1.1.2 主要儀器、試劑
紫外分光光度計 Thremo Nanodrop 2000（Thremo 公司）、生物芯片分析系統 Aglient 2100 Bioanalyzer（Aglient 公司）、基因芯片雜交儀 Genechip Hybridization Oven 645（Affymetrix 公司）、基因芯片洗滌工作站 Genechip Fluidics Station 450（Affymetrix 公司）、基因芯片掃描儀 Genechip Scanner 3000（Affymetrix 公司）、Aglient RNA 6000 納米試劑盒 Aglient RNA 6000 Nano Kit（購自 Thremo 公司）、基因芯片 3′IVT Plus 試劑盒 Genechip 3′IVT Plus Kit（購自 Aglient 公司）、基因芯片雜交清洗染色試劑盒 Genechip Hybridization Wash and Stain Kit（購自 Affymetrix 公司），SW480 細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。
1.2 方法
1.2.1 RNA 抽提
按試劑盒說明書采用 Trizol 法對 SW480 細胞沉淀樣品進行總 RNA 抽提。抽提所得總 RNA 經紫外分光光度計（Nanodrop 2000）和生物芯片分析系統（Aglient Bioanalyzer 2100）質檢，合格樣品進入芯片實驗。其質控標準：Thermo NanoDrop 2000 1.7<A260/A280<2.2；Agilent 2100 Bioanalyzer RIN≥7.0、28S/18S>0.7。其中，A260/A280 表示微量分光光度計測 260 nm/280 nm 吸收值的比值，用于評估蛋白質污染比例；RIN 表示 RNA 的完整性，用于評估 RNA 的完整性；28S/18S 表示 28sRNA 亮度與 18sRNA 亮度比值，28S/18S>0.7 提示加樣孔附近條帶產物中未混有 DNA。
1.2.2 芯片檢測與數據的處理分析
RNA 樣品進行質控合格后，進行芯片檢測，得到的結果進行處理分析，按照基因在實驗組相對于對照組的表達差異倍數（Fold Change）的絕對值|Fold Change|≥1.2，且錯誤發現率（false discovery rate，FDR）<0.05 篩選差異基因。對差異基因進行功能聚類分析，通過 IPA 分析細胞信號通路和相關的差異基因相互作用網絡以及相關基因與上游調控分子間的作用關系。
1.2.3 qPCR 下游基因檢測
綜合以上生信分析，選取被抑制的信號通路中相關基因進行 qPCR 驗證。用 2–ΔΔCt 反映敲低組（敲低 c-Met 后）各基因（AKT2、PIK3CA 和 MAP2K4）樣品相對于對照組（未敲低 c-Met 時）樣品目的基因的相對表達水平，其中，ΔCt=目的基因 Ct 值-內參基因 Ct 值，–ΔΔCt=NC 組 ΔCt 平均值-各樣品 ΔCt 值。
1.3 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件對數據進行分析處理，每組實驗重復 3 次，數據資料的結果用均數±標準差（±s）表示，組間比較用 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 RNA 質檢結果
質檢結果見表 1，其結果提示 c-Met 敲低組和對照組樣品均合格。
表1
RNA 質檢結果
2.2 芯片數據顯著性差異分析
2.2.1 基因篩選結果
芯片結果表明：敲低 c-Met 后，SW480 細胞中上調基因數目 399 個，下調基因數目 286 個，見圖 1a。
圖1
芯片數據顯著性差異分析結果
a：芯片數據火山圖，橫坐標為差異倍數（以 2 為底的對數變換）；縱坐標為差異的顯著性 FDR（以 10 為底的對數變換）；紅色點為以|Fold Change|≥1.2 且 FDR<0.05 為標準篩選的顯著性差異基因，灰色點為其他無顯著差異的基因；b：示敲低組和對照組樣本層次聚類熱圖
2.2.2 差異基因分析結果
在聚類分析熱圖中，每一列代表 1 個樣本，每一行表示 1 個差異基因；上部樹狀結構是根據差異基因的表達譜生成的所有樣本的聚集或分類情況；左側樹狀結構表示差異基因的表達模式聚集情況；紅色表示基因的表達程度相對上調，綠色表示基因的表達程度相對下調，黑色表示基因的表達沒有顯著變化，灰色表示基因的信號強度未檢出。差異基因分析結果見圖 1b。由圖 1b 可見，c-Met 敲低后，對 SW480 細胞的基因表達水平產生了明顯的影響。
2.3 顯著性差異基因生物信息分析結果
2.3.1 基于 IPA 的經典通路分析結果
圖 2a 展示了差異基因在經典通路中的富集情況，其中，橫坐標為通路名稱，縱坐標為富集的顯著性水平（以 10 為底的負對數變換）；橙色標注表示通路被激活（Z-score>0），藍色標注表示通路被抑制（Z-score<0），橙色和藍色的深淺（或 Z-score 的絕對值）代表激活或抑制的程度。Ratio 表示在此信號通路中差異基因數與該通路中包含的所有基因數的比值。由圖 2a 可見，HGF 信號通路被抑制，Z-score<0。圖 2b 展示了實驗結果中各基因在通路中的表達變化趨勢。由圖 2b 可見，HGF 信號通路被抑制，紅色代表該基因在實驗結果中顯著上調，綠色代表該基因在實驗結果中顯著下調。通過圖 2c 發現，在激活狀態下，Met 與 PIK3CA、AKT2、PIK3CA、MAP2K4、MAP3K7、MEKK 及 JNK 基因上調，而通過圖 2b 發現，敲低 c-Met 后，AKT2、PIK3CA 和 MAP2K4 基因表達下調。
圖2
示基于 IPA 的經典通路（a–c）和基于 IPA 相互作用網絡（d）的顯著性差異基因生物信息分析結果以及 qPCR 檢測結果
a：經典通路富集分析統計圖；b：HGF 經典通路中各分子在實驗結果中的表達變化趨勢；c：激活狀態下 HGF 經典通路中各分子的表達變化趨勢；d：基因相互作用網絡圖；e：qPCR 檢測結果
2.3.2 基于 IPA 的相互作用網絡分析結果
網絡圖展示了 Met 與 HGF 通路相關分子中差異基因之間的相互作用網絡，其中紅色代表基因被激活，綠色代表基因被抑制。由圖 2d 可見，c-Met 敲低后，網絡中 AKT2、PIK3CA 和 MAP2K4 下調。
2.4 qPCR 基因檢測結果
綜合以上生物信息學分析，推測目的基因 c-Met 可能通過調節 HGF 通路中差異基因 AKT2、PIK3CA 及 MAP2K4 影響腫瘤的侵襲、轉移能力。因此本研究選擇了 HGF 通路中上述基因進行 qPCR 驗證。結果發現，敲低組的 AKT2、PIK3CA 和 MAP2K4 基因的 2–ΔΔCt值分別為 0.558±0.040、0.508±0.039 和 0.658±0.128，對照組的 AKT2、PIK3CA 和 MAP2K4 基因的 2–ΔΔCt值分別為 1.000±0.032、1.000±0.035 和 1.003±0.095，提示敲低組的 AKT2、PIK3CA 和 MAP2K4 基因 mRNA 表達水平相對于對照組明顯下調，各基因 mRNA 表達水平 2 組間的差異均有統計學意義（P=0.000、P=7.967E-05、P=0.012），與芯片結果相符（圖 2e）。
3 討論
基因芯片分析方法已廣泛應用于越來越多的基因分析領域[6-7]。以往報道[8-15]證實，c-Met 與人類多種腫瘤關系密切。本研究通過對 c-Met 敲低后 SW480 細胞表達差異的基因進行深入的分析，發現顯著上調基因占總基因數的 1.014%（399/39 345），顯著下調基因占總基因數的 0.727%（286/33 945）。
HGF/c-Met 信號在很多生理過程中發揮著重要作用，該信號異常可導致腫瘤形成或引起腫瘤轉移[16]。Bradley 等[17]研究發現，運用 RNA 干擾技術下調 c-Met 基因的表達,盡管在 HGF 誘導下，轉染后的腫瘤細胞的遷移及侵襲能力仍明顯下降。本研究通過 IPA 分析，發現 c-Met 敲低后，HGF 信號通路發生了變化，其中 HGF 信號通路被抑制，因此推測 c-Met 有可能通過 HGF 通路調節結直腸癌的侵襲、轉移。這與前期功能分析[2]發現 c-Met 敲低后，盡管在 HGF 的調節下，SW480 細胞的侵襲及轉移能力仍被顯著抑制的結果一致。
AKT2 又稱絲氨酸、蘇氨酸激酶 2，是 AKT（蛋白激酶 B）的重要亞型之一。主要介導體內 PI3K/AKT2 信號傳導通路，通過上調 β-整合素、MMP-2 和 MMP-9 蛋白表達，從而促進腫瘤細胞的侵襲和遷移能力。研究[18]表明，許多人類組織中均存在 AKT2 的過度表達。而 AKT2 過度表達能夠使 NIH3T3 細胞發生惡性轉化，其結果與腫瘤的發生、發展更為緊密[19-23]。另有研究[24]表明，結直腸癌中 AKT 通過調控 MTSI 表達抑制腫瘤細胞的增殖和轉移。PIK3CA 是蛋白激酶 PI3K 的催化亞基。生理情況下，PIK3CA 多以非激活的形式存在于人體組織中，突變后基因及其蛋白均可過度表達，PIK3CA 基因突變會導致 PI3K/AKT 信號通路激活，使細胞脫離生長因子的調控而增殖，提高細胞的侵襲和轉移能力[25]。Samuels 等[26]給無胸腺裸鼠分別注射包含野生型和突變型 PIK3CA 細胞克隆，結果發現注射野生型 PIK3CA 細胞的小鼠體內未發現腫瘤生長，而注射突變型 PIK3CA 細胞克隆小鼠體內的不同部位發現了多處腫瘤生長，且存在腫瘤的侵襲和轉移現象。另有研究[27]表明，在包含 PIK3CA 突變的細胞中加入 PI3K 抑制劑或采用小 RNA 干擾（siRNA）敲減腫瘤細胞的 PIK3CA 基因，都能顯著抑制細胞的生長增殖。MAP2K4 又稱絲裂原活化蛋白激酶 4，是絲裂原活化蛋白激酶激活劑家族成員之一，能夠調節絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的激活，使信號通路下游分子 P38MAPK、JNK 等發生激活并促進細胞侵襲。有研究[28]表明，MAP2K4 過表達可增加前列腺癌的轉移，且通過調節熱休克蛋白 27（HSP27）抑制 MAP2K4 的激活可降低前列腺癌的轉移能力。
本研究中，相互作用網絡分析結果表明，HGF 通路中 Met 基因通過與 AKT2、PIK3CA 和 MAP2K4 基因的相互作用發揮功能，且 c-Met 敲低后，上述基因表達下調，推測 c-met 可能通過對上述基因的調控影響了腫瘤的侵襲和轉移。經進一步 qPCR 驗證，Met 敲低后，AKT2、PIK3CA 及 MAP2K4 基因表達下調，證實了該推測。表明 c-Met 可能通過 HGF 通路中對 AKT2、PIK3CA 及 MAP2K4 基因的調控影響結直腸癌的侵襲、轉移。這為進一步研究 c-Met 通過 HGF 通路如何調節結直腸癌的侵襲和轉移提供了思路。
重要聲明
利益沖突聲明：本研究所有作者均聲明無利益沖突。
作者貢獻聲明：孫學軍負責實驗總體設計及管理，姚建鋒負責實驗執行及質量質控；田利飛負責芯片實驗及下游基因檢測；張曉龍負責實驗數據整理及統計分析。
