引用本文： 何宇濤, 冉江華. DNA 甲基化在肝臟再生中的研究現狀與展望. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(4): 494-498. doi: 10.7507/1007-9424.201907109 復制
肝細胞作為一種穩定細胞，在受到物理或化學損傷后，它能從細胞增殖周期中的靜止期（G0）轉入 DNA 合成前期（G1）和 DNA 合成期（S 期），從而表現出強大的再生能力來維持肝細胞的生理功能和機體的內在平衡[1]，也正因為如此，肝部分切除術可以作為一種有效的手段治療肝臟良惡性腫瘤、肝外傷、肝膿腫等疾病。有研究[2]表明，肝臟再生障礙的患者術后并發癥（出血、肝功能衰竭、膽汁漏等）發病率和病死率均較高，良好的肝臟再生能力對患者的預后至關重要。肝臟再生是一個涉及多水平、復雜而又精密調控的過程，DNA 甲基化作為表觀遺傳修飾中的一種調控方式就參與其中，它在肝細胞發育、分化、增殖、癌變中都占有舉足輕重的地位。但近年來肝臟再生機制的研究大多集中在轉錄和翻譯水平，DNA 甲基化與肝臟再生關系的研究較為零散。因此，筆者匯總了國內外相關文獻，就 DNA 甲基化與肝臟再生關系的研究現狀作一綜述。
1 基因組甲基化水平與肝臟再生
1.1 肝細胞基因組整體甲基化水平與肝臟再生
DNA 甲基化是生物體內一種重要的表觀遺傳修飾途徑，以啟動子甲基化為例，它可以在不改變 DNA 堿基序列的情況下，通過改變 DNA 與轉錄因子的結合能力和高度螺旋化區域內染色質，抑制基因的轉錄活性[3]。DNA 甲基化的過程為：在 DNA 甲基化轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化下，S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）為甲基供體，將甲基共價結合在 DNA 中的特定序列上，通常是 CpG 二核苷酸中胞嘧啶上的第 5 位碳原子，其產物為 5-甲基胞嘧啶（5-mC）。CpG 在 DNA 中有兩種存在形式，一種是松散地分布在 DNA 中，多呈甲基化狀態；另一種則是高度聚集在某一區域，被稱作 CpG 島。60% CpG 島位于基因啟動子上，這部分 CpG 島大多呈非甲基化狀態，允許相關基因轉錄表達；其余 40% 大多以甲基化狀態分布于基因間區和轉錄區內[4]。
肝癌細胞基因組整體低甲基化，而局部高甲基化現象已成為不爭的事實[5]。但是肝臟再生過程中肝細胞基因組整體甲基化水平學術界目前尚無定論。有研究表明，肝臟再生過程中也存在基因組低甲基化現象，但是與肝癌基因組低甲基化不同的是，這是一個短暫且可逆的過程，如 Kanduc 等[6]在對健康大鼠進行 2/3 肝部分切除術時發現，術后殘余肝臟 5-mC 和 SAM 的總體水平在再生較為旺盛時間段（24～38 h）有明顯降低，之后能恢復到肝切除前水平；在癌變的大鼠肝臟上重復上述實驗，也發現了再生過程中的低甲基化現象。DNA 低甲基化存在兩種機制：① 主動去甲基化。DNA 甲基化維持基因沉默的作用較為穩定，但是當機體受到外界某些刺激之后，主動去甲基化功能蛋白被激活，使 DNA 中的甲基胞嘧啶被胞嘧啶替換，導致甲基化水平降低。② 被動去甲基化。此也稱復制相關的 DNA 去甲基化，這是目前學術界比較認同的去甲基化機制。在 DNA 復制過程中，DNMT1 能夠維持 5-mC 的甲基化狀態，但是當 DNMT1 基因缺失或沉默時，新生成的子鏈就不能被甲基化。據此可推測，肝臟再生過程中基因組低甲基化的原因之一可能是：增殖旺盛時期的肝細胞對 DNMT1 的需求較大，導致了 DNMT1 含量相對不足，從而出現基因組低甲基化現象。現有研究只能表明肝臟再生過程中存在肝細胞基因組低甲基化現象，但更加完整的、動態的甲基化改變暫未被揭示，有待進一步闡明。
1.2 各類肝細胞甲基化水平與肝臟再生
參與再生調控的肝細胞種類繁多，并且不同種類肝細胞間基因組甲基化模式存在明顯差異，因此，近年來肝臟再生甲基化的研究從肝臟整體水平轉入到了細胞水平。G?tze 等[7]發現，肝臟星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）的增殖和活化過程相較于肝實質細胞的增殖過程基因組表現出更低的甲基化水平，且具有特異性的 Spon2 基因低甲基化和 Pten、Smad7、IkBa 基因高甲基化模式。在另一項四氯化碳誘導小鼠肝損傷的實驗[8]中發現，活化的 HSCs 相較于靜止期的 HSCs 的細胞周期中核苷酸代謝相關基因如 Loxl1、Loxl2、Col4a1、Col4a2 等呈現低甲基化且高表達狀態，且靜止期各類肝細胞甲基化模式也同樣具有差異性，如 RNA 代謝相關基因、脂質代謝和轉運蛋白相關基因、染色質組裝相關基因分別在 HSCs、肝竇內皮細胞、肝實質細胞內特異性高甲基化。
值得一提的是，不同甲基化模式的各類肝細胞在肝臟再生過程中功能各異，分工合作，共同調控著肝臟再生。HSCs 在再生起始和終止階段發揮著特殊的調控作用，在肝臟再生早期，活化的 HSCs 產生大量的細胞因子和趨化因子促進肝臟再生，其中就有顯著促細胞分裂、細胞運動及血管生成作用的肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF），HGF 還能誘導骨髓間充質干細胞向類肝細胞分化[9]；在肝臟再生晚期，參與再生終止和組織結構重塑的轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）也大都由活化的 HSCs 產生；HSCs 還能誘導血小板衍生生長因子 β 的表達，從而對肝細胞起到保護作用[10]。而肝竇內皮細胞作為肝臟中數目最多的非實質細胞，在肝臟再生早期通過上調血管內皮生長因子（VEGF）-A 與其受體 VEGFR-1/flt-1、VEGFR-2/flk-1 的表達，促進肝細胞增殖和新血管生成[11]；在肝臟再生中后期，肝竇內皮細胞還可通過 VEGF-A-VEGFR-2-Idl 通路釋放 Wnt2，經 HGF 旁分泌作用介導肝實質細胞的重建[12]。此外，肝臟庫普弗細胞[13]、肝卵圓細胞[14]、Pit 細胞[15]、樹突狀細胞[16]都以不同的調控方式在肝臟再生中發揮作用，但目前對各類肝細胞 DNA 甲基化的研究相對較少。各類肝細胞在肝臟再生中特殊的調控作用與其特異性的甲基化模式之間的聯系還有待進一步研究。
1.3 胚胎甲基化模式與肝臟再生
Górnikiewicz 等[17]利用 MRL/MpJ 小鼠對比 C57BL/6J 小鼠探究肝臟再生的表觀遺傳學基礎時發現，再生能力較強的 MRL/MpJ 小鼠肝細胞基因組甲基化模式與胚胎時期的甲基化模式更為相似，FOXC2、INSIG2 等發育相關基因呈現低甲基化且高表達狀態[18]，這為肝臟再生甲基化研究提供了一個方向——肝臟再生基因組甲基化模式是否與胚胎時期的甲基化模式相似，換句話說，是否會朝著胚胎時期的甲基化模式轉變，目前還暫不知曉。
2 DNA 甲基化調控與肝臟再生
經典理論認為，基因啟動子區域 CpG 島甲基化程度與基因的轉錄呈負相關，此種調控方式在哺乳動物發育過程中已被充分證實[18]。分布于基因間區的 CpG 島，可能與該區域非編碼 RNA 的轉錄和轉座子的活化有關[19]，其甲基化可抑制非編碼 RNA 的轉錄和轉座子的激活；研究[20]還發現，高表達的基因常常在轉錄區內有廣泛的 CpG 位點甲基化，其生物學意義還不太明確。所以目前肝臟再生基因甲基化的研究大多集中在基因啟動子上。
有研究[21]表明，降低白細胞介素 6（interleukin 6，IL-6）基因啟動子甲基化水平能夠上調 IL-6 的表達。IL-6 作為一種多效能細胞因子，在細胞增殖、分化和炎癥反應中發揮著重要的作用。IL-6 在肝臟再生過程中具有強大的細胞保護和促有絲分裂作用，IL-6 通過與其受體結合，使 gp130 蛋白二聚化，二聚化的 gp130 能夠激活胞內磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/Akt、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、JAK/信號轉導及轉錄激活因子 3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）等下游信號，從而調節細胞周期促進肝臟再生。此外，IL-6 還具有強大的促血管生成[22]和抗凋亡作用[23]。因此，IL-6 的表達調控在肝臟再生過程中顯得尤為重要。胎盤間充質干細胞由于其強大的抗炎抗衰老能力，被廣泛用于肝臟損傷的研究和治療中，其機制之一就是通過改變 IL-6、gp130、STAT3、細胞因子信號通路抑制因子 3（SOCS3）的甲基化水平而調控肝臟再生[24]。胎盤間充質干細胞治療肝損傷時，能引起肝細胞 IL-6 和 gp130 基因啟動子甲基化水平明顯降低而 IL-6 和 gp130 表達上調，從而激活下游信號通路，促進肝臟再生；然而，肝臟再生過程中細胞因子信號抑制物 SOCS3 似乎不受啟動子甲基化的調控[25]。STAT3 是 SOCS3 基因的轉錄激活因子，當 JAK/STAT3 信號通路被激活時，SOCS3 也相應地表達增加。SOCS3 通過與活化的 JAK 結合和降解 gp130 而抑制信號通路的下傳，負反饋調控肝臟再生。Guo 等[25]發現，在大鼠 2/3 肝部分切除術后，SOCS3 的表達量會隨著細胞周期的改變而規律地增減，但 SOCS3 基因啟動子甲基化水平卻在整個再生過程中無序地上下波動。除了 SOCS3 不受啟動子甲基化調控能解釋上述現象以外，還有一種理論可以解釋，即 STAT3 和 SOCS3 之間的強大的負反饋環路調控機制掩蓋了潛在的 DNA 甲基化對 SOCS3 的調控。需特別指出的是，在肝癌[26]、食管癌[27]、肺癌[28]和頭頸部惡性腫瘤[29]中均發現了由 SOCS3 基因過度甲基化引起的 SOCS3 表達沉默。因此，在肝臟再生過程中 DNA 甲基化是否調控 SOCS3 的表達還需進一步驗證。
此外，IgG 受體 Fc 部分ⅡA（Fc fragment of IgG receptor ⅡA，FCGR2A）、RAS 相關結構域蛋白 1A 基因（RAS associated domain family 1A gene，RASSF1A）[30]和表皮生長因子[31]基因在肝臟再生過程中高甲基化，c-myc、p53 和 H-RAS 基因低甲基化[32]現象均有文獻報道，其中有啟動子區域 CpG 島甲基化程度與基因轉錄呈負相關的研究[31]；也有啟動子區域單個 CpG 位點與基因轉錄呈正相關的研究[32]。保守估計，肝臟再生過程中大約有 5 000 多個基因出現高甲基化或低甲基化改變，涉及真核起始因子 2B（eukaryotic initiation factor 2B，EIF2）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、整合素、PI3K/Akt 等 40 多種信號通路參與了凋亡、壞死、細胞遷移、增殖等多種病理生理活動[33]。由此可見，DNA 甲基化廣泛地參與到肝臟再生的多個環節中。
3 DNA 甲基化相關蛋白與肝臟再生
3.1 DNMT1 與肝臟再生
DNMT 作為 DNA 甲基化的關鍵酶，存在三種亞型：DNMT1、DNMT3a 和 DNMT3b。DNMT1 對半甲基化的 DNA 具有較高的酶活性，參與維持 DNA 甲基化狀態，在哺乳動物基因組內，其主要定位在細胞分裂周期 S 期的 DNA 復制叉上，將復制產生的半甲基化子鏈進一步甲基化，維持基因組的表觀遺傳；而 DNMT3a 和 DNMT3b 對未甲基化的 DNA 具有較高的酶活性，參與形成新的 DNA 甲基化模式。三類 DNMT 在胚胎發育和細胞增殖過程中均受到細胞周期的嚴密調控[34]。任何改變 DNMT 功能的行為都會影響機體發育并加速其死亡。
體外研究表明，細胞在增殖過程中，DNMT1 基因表達下調或沉默能夠引起基因組甲基化的水平和穩定性降低[35]，導致 DNA 損傷基因、p53 基因、IAP 轉座子的激活和多梳抑制復合物 2（polycomb repressive complex 2，PRC2）蛋白的下調，這些因素的共同作用使細胞出現 DNA 損傷、細胞周期阻滯、衰老和細胞死亡[36-39]。Kaji 等[40]利用 DNMT1 基因敲除的小鼠進行肝部分切除實驗時發現，術后只有少量肝細胞增殖，其余的肝細胞對增殖刺激因子無應答從而轉向衰老和死亡，最終大量的肝祖細胞被激活，取代衰老死亡的肝細胞，術后抑癌基因 p53、TGFβ 和細胞周期抑制物 p16、p21、p27 在 DNMT1 缺陷小鼠肝臟中表達上調，導致了細胞周期停滯和肝細胞凋亡，但在另一方面，這也是一種避免嚴重 DNA 損傷引起肝功能惡化的保護機制；研究還發現，肝祖細胞不受 DNMT1 缺陷的影響，因此肝臟再生后期大量的肝祖細胞能夠取代死亡的肝細胞維持機體自穩。總體上看，DNMT1 缺陷導致了肝臟再生障礙，但這是機體以最佳方式維持肝細胞穩態而導致的結果。
3.2 含植物同源結構域和環指結構域泛素樣蛋白 1（ubiquitin-like plant homeodomain and ring finger domain 1，UHRF1）與肝臟再生
DNMT1 募集到 DNA 復制叉和識別半甲基化 DNA 的過程中，需要 UHRF1 的參與，UHRF1 缺乏將導致 DNMT1 不能有效識別半甲基化 DNA 從而使基因組低甲基化。研究[41]發現，UHRF1 是機體胚胎發育過程中不可或缺的調控蛋白，UHRF1 缺陷的小鼠大多在胚胎發育早期就會死亡。Jacob等[42]還發現，UHRF1 突變的斑馬魚在肝臟發育過程中出現了細胞周期停滯、過度凋亡等增殖抑制現象。Wang 等[43]在小鼠出生之后進行特異性的肝細胞 UHRF1 基因敲除（Uhrf1hepKO）實驗發現，與野生型相比，Uhrf1hepKO 小鼠靜止期肝細胞的基因組表現出低甲基化狀態，但基因的表達水平卻沒有明顯增加，這表明 UHRF1 并不是抑制靜止期肝細胞基因表達的主要原因；在對 Uhrf1hepKO 小鼠進行部分肝切除后，研究人員驚奇地發現，小鼠肝臟再生過程啟動較早，且再生持續時間較長。分析其原因為：UHRF1 缺陷導致基因間區的轉座子過度低甲基化，但表達并不上調，這是由于轉座子存在一種補償性的抑制機制，即當轉座子過度低甲基化時，其他基因啟動子區域的 H3K27me3 會被補償性的轉移到轉座子上抑制其表達 ，H3K27me3 是三甲基化的組蛋白 H3，具有基因沉默作用[44]。也正因如此，其他基因啟動子上的 H3K27me3 相對較少，某些增殖相關的轉錄因子如 E2F[45]才能夠有效地結合到啟動子上促進肝臟再生。UHRF1 缺陷促進肝臟再生揭示了一種全新的 H3K27me3 介導的 DNA 甲基化調控模式，也為研究肝臟再生障礙的治療方法提供了嶄新的思路。
4 小結與展望
DNA 甲基化是目前研究最深入的表觀遺傳調控機制之一，但在肝臟再生領域，DNA 甲基化的研究還只是起步階段。雖然 DNA 甲基化的調控機制尚未闡明，但越來越多的實驗已表明 DNA 甲基化對肝臟再生是至關重要的。隨著近年來表觀遺傳學研究的進一步深入以及相關治療藥物的不斷涌現，DNA 甲基化水平的干預治療有望給實施肝部分切除術、肝移植等肝臟手術患者帶來良好的預后。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：何宇濤起草文章；冉江華采集數據及對論文進行指導。
肝細胞作為一種穩定細胞，在受到物理或化學損傷后，它能從細胞增殖周期中的靜止期（G0）轉入 DNA 合成前期（G1）和 DNA 合成期（S 期），從而表現出強大的再生能力來維持肝細胞的生理功能和機體的內在平衡[1]，也正因為如此，肝部分切除術可以作為一種有效的手段治療肝臟良惡性腫瘤、肝外傷、肝膿腫等疾病。有研究[2]表明，肝臟再生障礙的患者術后并發癥（出血、肝功能衰竭、膽汁漏等）發病率和病死率均較高，良好的肝臟再生能力對患者的預后至關重要。肝臟再生是一個涉及多水平、復雜而又精密調控的過程，DNA 甲基化作為表觀遺傳修飾中的一種調控方式就參與其中，它在肝細胞發育、分化、增殖、癌變中都占有舉足輕重的地位。但近年來肝臟再生機制的研究大多集中在轉錄和翻譯水平，DNA 甲基化與肝臟再生關系的研究較為零散。因此，筆者匯總了國內外相關文獻，就 DNA 甲基化與肝臟再生關系的研究現狀作一綜述。
1 基因組甲基化水平與肝臟再生
1.1 肝細胞基因組整體甲基化水平與肝臟再生
DNA 甲基化是生物體內一種重要的表觀遺傳修飾途徑，以啟動子甲基化為例，它可以在不改變 DNA 堿基序列的情況下，通過改變 DNA 與轉錄因子的結合能力和高度螺旋化區域內染色質，抑制基因的轉錄活性[3]。DNA 甲基化的過程為：在 DNA 甲基化轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化下，S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）為甲基供體，將甲基共價結合在 DNA 中的特定序列上，通常是 CpG 二核苷酸中胞嘧啶上的第 5 位碳原子，其產物為 5-甲基胞嘧啶（5-mC）。CpG 在 DNA 中有兩種存在形式，一種是松散地分布在 DNA 中，多呈甲基化狀態；另一種則是高度聚集在某一區域，被稱作 CpG 島。60% CpG 島位于基因啟動子上，這部分 CpG 島大多呈非甲基化狀態，允許相關基因轉錄表達；其余 40% 大多以甲基化狀態分布于基因間區和轉錄區內[4]。
肝癌細胞基因組整體低甲基化，而局部高甲基化現象已成為不爭的事實[5]。但是肝臟再生過程中肝細胞基因組整體甲基化水平學術界目前尚無定論。有研究表明，肝臟再生過程中也存在基因組低甲基化現象，但是與肝癌基因組低甲基化不同的是，這是一個短暫且可逆的過程，如 Kanduc 等[6]在對健康大鼠進行 2/3 肝部分切除術時發現，術后殘余肝臟 5-mC 和 SAM 的總體水平在再生較為旺盛時間段（24～38 h）有明顯降低，之后能恢復到肝切除前水平；在癌變的大鼠肝臟上重復上述實驗，也發現了再生過程中的低甲基化現象。DNA 低甲基化存在兩種機制：① 主動去甲基化。DNA 甲基化維持基因沉默的作用較為穩定，但是當機體受到外界某些刺激之后，主動去甲基化功能蛋白被激活，使 DNA 中的甲基胞嘧啶被胞嘧啶替換，導致甲基化水平降低。② 被動去甲基化。此也稱復制相關的 DNA 去甲基化，這是目前學術界比較認同的去甲基化機制。在 DNA 復制過程中，DNMT1 能夠維持 5-mC 的甲基化狀態，但是當 DNMT1 基因缺失或沉默時，新生成的子鏈就不能被甲基化。據此可推測，肝臟再生過程中基因組低甲基化的原因之一可能是：增殖旺盛時期的肝細胞對 DNMT1 的需求較大，導致了 DNMT1 含量相對不足，從而出現基因組低甲基化現象。現有研究只能表明肝臟再生過程中存在肝細胞基因組低甲基化現象，但更加完整的、動態的甲基化改變暫未被揭示，有待進一步闡明。
1.2 各類肝細胞甲基化水平與肝臟再生
參與再生調控的肝細胞種類繁多，并且不同種類肝細胞間基因組甲基化模式存在明顯差異，因此，近年來肝臟再生甲基化的研究從肝臟整體水平轉入到了細胞水平。G?tze 等[7]發現，肝臟星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）的增殖和活化過程相較于肝實質細胞的增殖過程基因組表現出更低的甲基化水平，且具有特異性的 Spon2 基因低甲基化和 Pten、Smad7、IkBa 基因高甲基化模式。在另一項四氯化碳誘導小鼠肝損傷的實驗[8]中發現，活化的 HSCs 相較于靜止期的 HSCs 的細胞周期中核苷酸代謝相關基因如 Loxl1、Loxl2、Col4a1、Col4a2 等呈現低甲基化且高表達狀態，且靜止期各類肝細胞甲基化模式也同樣具有差異性，如 RNA 代謝相關基因、脂質代謝和轉運蛋白相關基因、染色質組裝相關基因分別在 HSCs、肝竇內皮細胞、肝實質細胞內特異性高甲基化。
值得一提的是，不同甲基化模式的各類肝細胞在肝臟再生過程中功能各異，分工合作，共同調控著肝臟再生。HSCs 在再生起始和終止階段發揮著特殊的調控作用，在肝臟再生早期，活化的 HSCs 產生大量的細胞因子和趨化因子促進肝臟再生，其中就有顯著促細胞分裂、細胞運動及血管生成作用的肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF），HGF 還能誘導骨髓間充質干細胞向類肝細胞分化[9]；在肝臟再生晚期，參與再生終止和組織結構重塑的轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）也大都由活化的 HSCs 產生；HSCs 還能誘導血小板衍生生長因子 β 的表達，從而對肝細胞起到保護作用[10]。而肝竇內皮細胞作為肝臟中數目最多的非實質細胞，在肝臟再生早期通過上調血管內皮生長因子（VEGF）-A 與其受體 VEGFR-1/flt-1、VEGFR-2/flk-1 的表達，促進肝細胞增殖和新血管生成[11]；在肝臟再生中后期，肝竇內皮細胞還可通過 VEGF-A-VEGFR-2-Idl 通路釋放 Wnt2，經 HGF 旁分泌作用介導肝實質細胞的重建[12]。此外，肝臟庫普弗細胞[13]、肝卵圓細胞[14]、Pit 細胞[15]、樹突狀細胞[16]都以不同的調控方式在肝臟再生中發揮作用，但目前對各類肝細胞 DNA 甲基化的研究相對較少。各類肝細胞在肝臟再生中特殊的調控作用與其特異性的甲基化模式之間的聯系還有待進一步研究。
1.3 胚胎甲基化模式與肝臟再生
Górnikiewicz 等[17]利用 MRL/MpJ 小鼠對比 C57BL/6J 小鼠探究肝臟再生的表觀遺傳學基礎時發現，再生能力較強的 MRL/MpJ 小鼠肝細胞基因組甲基化模式與胚胎時期的甲基化模式更為相似，FOXC2、INSIG2 等發育相關基因呈現低甲基化且高表達狀態[18]，這為肝臟再生甲基化研究提供了一個方向——肝臟再生基因組甲基化模式是否與胚胎時期的甲基化模式相似，換句話說，是否會朝著胚胎時期的甲基化模式轉變，目前還暫不知曉。
2 DNA 甲基化調控與肝臟再生
經典理論認為，基因啟動子區域 CpG 島甲基化程度與基因的轉錄呈負相關，此種調控方式在哺乳動物發育過程中已被充分證實[18]。分布于基因間區的 CpG 島，可能與該區域非編碼 RNA 的轉錄和轉座子的活化有關[19]，其甲基化可抑制非編碼 RNA 的轉錄和轉座子的激活；研究[20]還發現，高表達的基因常常在轉錄區內有廣泛的 CpG 位點甲基化，其生物學意義還不太明確。所以目前肝臟再生基因甲基化的研究大多集中在基因啟動子上。
有研究[21]表明，降低白細胞介素 6（interleukin 6，IL-6）基因啟動子甲基化水平能夠上調 IL-6 的表達。IL-6 作為一種多效能細胞因子，在細胞增殖、分化和炎癥反應中發揮著重要的作用。IL-6 在肝臟再生過程中具有強大的細胞保護和促有絲分裂作用，IL-6 通過與其受體結合，使 gp130 蛋白二聚化，二聚化的 gp130 能夠激活胞內磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/Akt、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、JAK/信號轉導及轉錄激活因子 3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）等下游信號，從而調節細胞周期促進肝臟再生。此外，IL-6 還具有強大的促血管生成[22]和抗凋亡作用[23]。因此，IL-6 的表達調控在肝臟再生過程中顯得尤為重要。胎盤間充質干細胞由于其強大的抗炎抗衰老能力，被廣泛用于肝臟損傷的研究和治療中，其機制之一就是通過改變 IL-6、gp130、STAT3、細胞因子信號通路抑制因子 3（SOCS3）的甲基化水平而調控肝臟再生[24]。胎盤間充質干細胞治療肝損傷時，能引起肝細胞 IL-6 和 gp130 基因啟動子甲基化水平明顯降低而 IL-6 和 gp130 表達上調，從而激活下游信號通路，促進肝臟再生；然而，肝臟再生過程中細胞因子信號抑制物 SOCS3 似乎不受啟動子甲基化的調控[25]。STAT3 是 SOCS3 基因的轉錄激活因子，當 JAK/STAT3 信號通路被激活時，SOCS3 也相應地表達增加。SOCS3 通過與活化的 JAK 結合和降解 gp130 而抑制信號通路的下傳，負反饋調控肝臟再生。Guo 等[25]發現，在大鼠 2/3 肝部分切除術后，SOCS3 的表達量會隨著細胞周期的改變而規律地增減，但 SOCS3 基因啟動子甲基化水平卻在整個再生過程中無序地上下波動。除了 SOCS3 不受啟動子甲基化調控能解釋上述現象以外，還有一種理論可以解釋，即 STAT3 和 SOCS3 之間的強大的負反饋環路調控機制掩蓋了潛在的 DNA 甲基化對 SOCS3 的調控。需特別指出的是，在肝癌[26]、食管癌[27]、肺癌[28]和頭頸部惡性腫瘤[29]中均發現了由 SOCS3 基因過度甲基化引起的 SOCS3 表達沉默。因此，在肝臟再生過程中 DNA 甲基化是否調控 SOCS3 的表達還需進一步驗證。
此外，IgG 受體 Fc 部分ⅡA（Fc fragment of IgG receptor ⅡA，FCGR2A）、RAS 相關結構域蛋白 1A 基因（RAS associated domain family 1A gene，RASSF1A）[30]和表皮生長因子[31]基因在肝臟再生過程中高甲基化，c-myc、p53 和 H-RAS 基因低甲基化[32]現象均有文獻報道，其中有啟動子區域 CpG 島甲基化程度與基因轉錄呈負相關的研究[31]；也有啟動子區域單個 CpG 位點與基因轉錄呈正相關的研究[32]。保守估計，肝臟再生過程中大約有 5 000 多個基因出現高甲基化或低甲基化改變，涉及真核起始因子 2B（eukaryotic initiation factor 2B，EIF2）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、整合素、PI3K/Akt 等 40 多種信號通路參與了凋亡、壞死、細胞遷移、增殖等多種病理生理活動[33]。由此可見，DNA 甲基化廣泛地參與到肝臟再生的多個環節中。
3 DNA 甲基化相關蛋白與肝臟再生
3.1 DNMT1 與肝臟再生
DNMT 作為 DNA 甲基化的關鍵酶，存在三種亞型：DNMT1、DNMT3a 和 DNMT3b。DNMT1 對半甲基化的 DNA 具有較高的酶活性，參與維持 DNA 甲基化狀態，在哺乳動物基因組內，其主要定位在細胞分裂周期 S 期的 DNA 復制叉上，將復制產生的半甲基化子鏈進一步甲基化，維持基因組的表觀遺傳；而 DNMT3a 和 DNMT3b 對未甲基化的 DNA 具有較高的酶活性，參與形成新的 DNA 甲基化模式。三類 DNMT 在胚胎發育和細胞增殖過程中均受到細胞周期的嚴密調控[34]。任何改變 DNMT 功能的行為都會影響機體發育并加速其死亡。
體外研究表明，細胞在增殖過程中，DNMT1 基因表達下調或沉默能夠引起基因組甲基化的水平和穩定性降低[35]，導致 DNA 損傷基因、p53 基因、IAP 轉座子的激活和多梳抑制復合物 2（polycomb repressive complex 2，PRC2）蛋白的下調，這些因素的共同作用使細胞出現 DNA 損傷、細胞周期阻滯、衰老和細胞死亡[36-39]。Kaji 等[40]利用 DNMT1 基因敲除的小鼠進行肝部分切除實驗時發現，術后只有少量肝細胞增殖，其余的肝細胞對增殖刺激因子無應答從而轉向衰老和死亡，最終大量的肝祖細胞被激活，取代衰老死亡的肝細胞，術后抑癌基因 p53、TGFβ 和細胞周期抑制物 p16、p21、p27 在 DNMT1 缺陷小鼠肝臟中表達上調，導致了細胞周期停滯和肝細胞凋亡，但在另一方面，這也是一種避免嚴重 DNA 損傷引起肝功能惡化的保護機制；研究還發現，肝祖細胞不受 DNMT1 缺陷的影響，因此肝臟再生后期大量的肝祖細胞能夠取代死亡的肝細胞維持機體自穩。總體上看，DNMT1 缺陷導致了肝臟再生障礙，但這是機體以最佳方式維持肝細胞穩態而導致的結果。
3.2 含植物同源結構域和環指結構域泛素樣蛋白 1（ubiquitin-like plant homeodomain and ring finger domain 1，UHRF1）與肝臟再生
DNMT1 募集到 DNA 復制叉和識別半甲基化 DNA 的過程中，需要 UHRF1 的參與，UHRF1 缺乏將導致 DNMT1 不能有效識別半甲基化 DNA 從而使基因組低甲基化。研究[41]發現，UHRF1 是機體胚胎發育過程中不可或缺的調控蛋白，UHRF1 缺陷的小鼠大多在胚胎發育早期就會死亡。Jacob等[42]還發現，UHRF1 突變的斑馬魚在肝臟發育過程中出現了細胞周期停滯、過度凋亡等增殖抑制現象。Wang 等[43]在小鼠出生之后進行特異性的肝細胞 UHRF1 基因敲除（Uhrf1hepKO）實驗發現，與野生型相比，Uhrf1hepKO 小鼠靜止期肝細胞的基因組表現出低甲基化狀態，但基因的表達水平卻沒有明顯增加，這表明 UHRF1 并不是抑制靜止期肝細胞基因表達的主要原因；在對 Uhrf1hepKO 小鼠進行部分肝切除后，研究人員驚奇地發現，小鼠肝臟再生過程啟動較早，且再生持續時間較長。分析其原因為：UHRF1 缺陷導致基因間區的轉座子過度低甲基化，但表達并不上調，這是由于轉座子存在一種補償性的抑制機制，即當轉座子過度低甲基化時，其他基因啟動子區域的 H3K27me3 會被補償性的轉移到轉座子上抑制其表達 ，H3K27me3 是三甲基化的組蛋白 H3，具有基因沉默作用[44]。也正因如此，其他基因啟動子上的 H3K27me3 相對較少，某些增殖相關的轉錄因子如 E2F[45]才能夠有效地結合到啟動子上促進肝臟再生。UHRF1 缺陷促進肝臟再生揭示了一種全新的 H3K27me3 介導的 DNA 甲基化調控模式，也為研究肝臟再生障礙的治療方法提供了嶄新的思路。
4 小結與展望
DNA 甲基化是目前研究最深入的表觀遺傳調控機制之一，但在肝臟再生領域，DNA 甲基化的研究還只是起步階段。雖然 DNA 甲基化的調控機制尚未闡明，但越來越多的實驗已表明 DNA 甲基化對肝臟再生是至關重要的。隨著近年來表觀遺傳學研究的進一步深入以及相關治療藥物的不斷涌現，DNA 甲基化水平的干預治療有望給實施肝部分切除術、肝移植等肝臟手術患者帶來良好的預后。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：何宇濤起草文章；冉江華采集數據及對論文進行指導。