引用本文： 王磊, 陳曦, 顏登國, 梁正子, 曹飛龍, 甄運寰, 李國勝, 程海玉. 結直腸癌微環境中細胞因子的表達及其與CD16a mRNA 表達的相關性研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(3): 291-297. doi: 10.7507/1007-9424.201907092 復制
腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）是指腫瘤所處的特殊生活環境，主要包括：腫瘤細胞、間質細胞、免疫細胞、腫瘤外基質、細胞因子等，它們相互作用，通過多種機制形成免疫抑制區域，介導腫瘤逃逸[1]。微環境中腫瘤細胞、基質細胞、免疫細胞等均可釋放細胞因子，形成一個細胞因子調節網，協同調節或抑制腫瘤免疫。因此，微環境中細胞因子譜的變化可以反映微環境的免疫情況。
CD16a（FCγRⅢA）為低親和力的 IgG 受體，是一種表達于多種免疫效應細胞表面的跨膜蛋白，通過與人 IgG1 和 IgG3 的 Fc 段結合，誘導免疫效應細胞的抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用（antibody-dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC）[2]，發揮直接殺傷作用或者促進 γ-干擾素（interferone-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、基質金屬蛋白酶等細胞因子的產生，影響細胞免疫功能的發揮[3-4]。它是細胞免疫的重要結合位點，前期實驗[5]發現，CD16a 在有肝轉移患者的原發腫瘤組織中的表達水平明顯低于無肝轉移者，推測局部 CD16a 的表達下調引起了局部免疫功能的減弱，而導致結直腸癌的發生和發展。本研究利用流式細胞術微球陣列法（CBA 法）檢驗結直腸癌組織中輔助性 T 淋巴細胞（helper T lymphocyte，Th）的細胞因子水平，包括 Th1 細胞因子 ［白細胞介素（interleukin，IL）-2、IL-12 和 IFN-γ］、Th2 細胞因子（IL-4、IL-6 和 IL-10）、TNF-α 和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在內的細胞因子譜的變化，了解微環境的免疫抑制情況；并利用 RT-PCR 技術檢測結直腸癌組織中 CD16a mRNA 的表達變化，初步探討 CD16a mRNA 表達與 TME 變化的關系。
1 材料與方法
1.1 研究材料
納入標準：① 所選病例術后均經病理學檢查確診為結直腸腺癌（包括黏液腺癌和印戒細胞癌）；② 術前均未行化療、放療及生物治療。排除標準：① 術前接受放化療及生物治療者；② 多源性結直腸癌和復發性結直腸癌；③ 患者系未成年人。前瞻性收集貴州醫科大學附屬醫院肛腸外科于 2015 年 6 月至 2016 年 12 月期間收治的 42 例行手術切除的結直腸癌患者的癌組織及癌旁組織（距離癌組織以遠 10 cm）進行試驗。42 例患者中，男 22 例，女 20 例；年齡 24～89 歲，中位年齡為 63 歲；腫瘤部位：結腸 13 例，直腸 29 例；病理分型：腺癌 38 例，黏液腺癌 3 例，印戒細胞癌 1 例；淋巴結轉移陽性 19 例，陰性 23 例；TNM 分期：Ⅰ期 12 例，Ⅱ期 10 例，Ⅲ期 10 例，Ⅳ期 10 例。
1.2 主要試劑及設備
RNA 提取試劑盒（全式金）：TransZol Up Plus RNA Kit；RNA 逆轉錄試劑盒（全式金）：EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix；熒光定量 PCR 試劑盒（全式金）：TransStart Tip Green qPCR SuperMix；熒光染料：4S Green Plus 無核酸染料；CD16a 及 GAPDH 內參引物。上述產品均購自生工生物工程（上海）有限公司。流式細胞多因子檢測試劑盒：LEGEND-plexTM 系美國 BioLegend 公司產品。
1.3 方法
1.3.1 CBA 法測定結直腸癌組織及癌旁組織中細胞因子的表達
取待測標本組織，稱重（精確到 0.01 g），漂洗拭干，按質量體積比 1∶4 取 pH=7.4 的 PBS 緩沖液勻漿，低溫 3 000 r/min 離心 10～15 min（r=208 mm），取上清液，棄下面沉淀。全程低溫環境操作。嚴格按照流式細胞因子檢測試劑盒說明書進行標準品制備及后續實驗。標準品最高濃度 C7 的理論濃度為 10 000 pg/mL，后以 1∶4 的比例稀釋到 C1，C1 的理論濃度為 2.4 pg/mL。緩沖液作為最低濃度的標準品 C0，為 0 pg/mL。
1.3.2 RT-PCR 法測定結直腸癌組織中 CD16a mRNA 的表達
設計的 CD16a 引物擴增產物長度為 74 bp，引物序列為：上游引物，5′-TCCAAAAGCCACACTCAAAGAC-3′；下游引物，5′-CTGAAGACACATTTTTACTCCCAAAC-3′。內參基因選擇 GAPDH，GAPDH 引物擴增產物長度為 138 bp，引物序列為：上游引物，5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′；下游引物，5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′。兩種引物的設計及合成均由生工生物工程（上海）有限公司完成。
按試劑盒說明提取總 RNA，進行電泳鑒定后，逆轉錄合成 cDNA，按 RT-PCR 試劑盒說明書進行 RT-PCR 擴增。PCR 反應條件：① 變性：94 ℃30 s；② 94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，重復 45 個循環。PCR 反應體系見試劑盒說明書。PCR 后進行溶解分析，溫度為 60～95 ℃。每個樣本重復檢測 3 次，取平均值。
1.4 統計學方法
CD16a mRNA 的相對表達水平采用 2–△△CT[6]方法計算，因此與細胞因子進行相關性分析時，利用癌旁組織的細胞因子表達水平將癌組織中細胞因子的表達進行轉化：細胞因子的相對表達水平=癌組織中的表達水平/癌旁組織中的表達水平。采用 SPSS 24.0 統計軟件進行分析，對數據進行正態分布檢驗，如果符合正態分布，采用配對或成組 t 檢驗；如果不符合正態分布或不滿足參數檢驗條件，采用非參數 Wilcoxon 符號秩和檢驗、Mann-Whitney U 檢驗和 Kruskal-wallis H 檢驗進行差異性分析。相關性分析采用 Spearman 秩相關分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 結直腸癌組織中 8 種細胞因子的表達水平
2.1.1 標準繪制
測得 C7～C0 中 8 種細胞因子的實際標準濃度后繪制標準曲線如圖 1。結果可見，8 種細胞因子的標準曲線擬合優度 R2值范圍為 0.988～0.998，表明標準曲線的擬合優度佳。
圖1
示 8 種細胞因子的標準曲線圖
a：IL-2；b：IL-4；c：IL-6；d：IL-10；e：IL-12；f：TNF-α；g：IFN-γ；h：VEGF；
2.1.2 結直腸癌組織及癌旁組織 8 種細胞因子的表達水平
結直腸癌組織中 IL-6、TNF-α 和 VEGF 的表達水平高于癌旁組織（P<0.05），而 IL-2、IL-4、IL-10、IL-12 和 IFN-γ 在 2 種組織中的表達差異均無統計學意義（P>0.05），見表 1。
表1
結直腸癌組織與癌旁組織中 8 種細胞因子的表達水平（
，pg/mL，n=42）
2.1.3 結直腸癌組織中 8 種細胞因子的表達水平與臨床病理學特征的關系
不同年齡、性別、腫瘤部位、N 分期、TNM 分期和分化程度患者的 8 種細胞因子的表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）；此外，不同 CEA 水平組患者 IL-6 和 VEGF 的表達水平不同，CEA<5.0 ng/mL 組的 IL-6 和 VEGF 水平較高，但其他 6 項指標的差異均無統計學意義（P>0.05），具體結果見表 2。
表2
結直腸癌組織中 8 種細胞因子的表達水平與臨床病理學特征的關系（
，pg/mL）
2.2 結直腸癌組織中 CD16a mRNA 的表達水平
CD16a 和 GAPDH 基因的擴增曲線呈倒 S 型，擴增曲線拐點清楚，曲線指數期的斜率兩者基本一致，斜率大，擴增效率高（圖 2a）。溶解曲線為單一峰，溶解溫度均一，未見第二峰，提示無非特異性擴增（圖 2b 和2c）。RNA 提取物的電泳結果表明，28S 和 18S 條帶清晰，28S 條帶亮度約是 18S 條帶的 2 倍（圖 2d），表明RNA 提取基本完整，無明顯降解。PCR 擴增產物電泳圖結果表明，GAPDH 和 CD16a mRNA 的條帶清晰；CD16a 基因片段約為2 000 bp，GAPDH 片段在 1 200～2 000 bp 之間（圖 2e），與預期片段大小相符，表示無非特異性擴增。結直腸癌組織中 CD16a mRNA 的相對表達水平為 3.48±1.0。
圖2
示 CD16a 和 GAPDH 基因的擴增曲線、溶解曲線和瓊脂凝膠電泳結果
a：擴增曲線，Rn 表示熒光強度，ΔRn 表示每個測量點相對基礎熒光的熒光強度；b 和 c：CD16a（b）和 GAPDH（c）的溶解曲線；d：RNA 提取物的電泳圖；e：PCR 擴增產物的電泳圖
2.3 結直腸癌組織中 CD16a mRNA 的表達水平與細胞因子表達水平的相關性分析
結直腸癌組織中 IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α 和 VEGF 的表達水平與 CD16a mRNA 的表達水平無明顯相關性（P>0.05），但 IL-6 的表達水平與 CD16a mRNA 的表達水平呈負相關（P<0.05）。具體見表 3。
表3
結直腸癌組織中 8 種細胞因子的表達水平與 CD16a mRNA 表達水平的相關性分析（n=42）
3 討論
正常情況下，機體免疫功能處于穩定狀態，不會過強或者過弱而導致疾病的發生，輔助性 T 細胞在其中起著重要作用。初始 Th0 細胞經過誘導分化形成 Th1 細胞及 Th2 細胞，它們通過不同的細胞因子，介導不同的免疫應答。Th1 細胞因子（IL-2、IFN-γ 和 IL-12）可以增強免疫細胞的細胞毒作用，介導細胞免疫應答，增強免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷能力；Th2 細胞因子（IL-4、IL-6 和 IL-10）主要促進抗體產生，介導體液免疫。在腫瘤免疫方面，可以直接抑制 Th1 細胞因子的產生來下調腫瘤的特異性免疫應答，從而抑制免疫效應細胞的活化[7]。Th1 細胞及 Th2 細胞在免疫過程中相互調節和制約，形成動態平衡，機體的抗腫瘤免疫以 Th1 細胞介導的細胞免疫為主，當 Th1/Th2 平衡失調、Th1 向 Th2 細胞偏移，則會導致機體細胞免疫功能嚴重減弱，促使腫瘤細胞能逃避機體免疫系統的攻擊，出現腫瘤逃逸現象，導致腫瘤細胞大量增殖。
本研究中，雖然 IL-6 在結直腸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織（P<0.05），但 Th1 細胞和 Th2 細胞的主要細胞因子，包括 IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-4 及 IL-10 在結直腸癌組織與癌旁組織間的差異并無統計學意義（P>0.05）。總體來看，在 TME 中未發現明顯的 Th1/Th2 細胞偏移現象，這與之前的研究結果[8]有所出入。這可能與微環境中腫瘤浸潤細胞及癌細胞同樣分泌相關細胞因子有關。
TNF-α 是典型的炎性細胞因子，主要由巨噬細胞和腫瘤細胞產生，其生物學活性較為廣泛，既可誘導腫瘤細胞凋亡，被認為是腫瘤抑制性細胞因子[9]，同時可使腫瘤細胞增殖和分化。很多研究[10-12]發現，TNF-α 是將炎癥與癌癥進行關聯的腫瘤促進劑，能夠激活癌基因，導致細胞 DNA 損傷和腫瘤轉移，在結直腸癌的侵襲轉移中起主要作用，晚期結直腸癌中無論血漿還是腫瘤組織其局部 TNF-α 的表達水平均顯著升高。VEGF 在微環境中因缺氧環境而被誘導表達上調，與血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）—VEGFR-1 和 VEGFR-2 結合而促進血管網絡形成，來促進腫瘤的形成和轉移[13]；并且在 TME 中，VEGF 還能誘導髓源性抑制細胞（MDSC）增殖，從而抑制免疫功能[14]。IL-6 除了可以促進腫瘤細胞的增殖外，它還可以通過促進血管生成[15]、促進 DNA 錯配修復缺陷[16]、促進 MDSC 蓄積[17]、限制 CD4+Th1 細胞發育[18]等機制促進腫瘤的發生和發展，IL-6 通過調節促凋亡因子 Bcl 相關 X 蛋白和 DNA 修復蛋白 Ku70/86 的表達，以及分子間的相互作用而促進結腸癌細胞的增殖。總的來說，IL-6、TNF-α 和 VEGF 的表達情況反映了 TME 中的免疫抑制現象。本研究結果顯示，結直腸癌組織中 IL-6、TNF-α 和 VEGF 的表達水平高于癌旁組織，說明結直腸癌腫瘤局部微環境中存在免疫抑制現象。
目前的研究結果并未發現免疫抑制的嚴重程度與腫瘤的進展如腫瘤分期以及有無淋巴結轉移有關。臨床病理因素對微環境中細胞因子的影響分析結果顯示，除了 IL-6 與 VEGF 的表達水平在不同水平 CEA 組中表現出差異性外，其余均未見顯著差異。CEA 作為一種胚胎性抗原，與腫瘤細胞免疫、黏附及凋亡有關，且與腫瘤的分期等有關，在低分化及Ⅲ/Ⅳ期結直腸癌患者的外周血中其表達水平明顯升高；腫瘤局部 CEA 表達有導致腫瘤細胞浸潤脈管、發生淋巴及血液轉移的危險[19-20]。本研究結果顯示，術前血清 CEA 正常組患者的 IL-6 和 VEGF 的表達水平高于 CEA 升高組。但鑒于結直腸癌局部腫瘤組織中均有 CEA 表達而僅有 40%～50% 的結直腸癌患者血清 CEA 升高[21-22]，且對于腫瘤局部 CEA 釋放進入血循環中的機制目前不是很清楚，因此，血清 CEA 與腫瘤局部微環境中細胞因子表達之間的相互作用機制還不明確。有研究[23-24]顯示，腫瘤局部 VEGF 的表達水平與血清 CEA 水平無明顯相關性，而血清 CEA 水平與 IL-6 的表達水平呈正相關。另外，單獨的 CEA 水平并不能描述腫瘤的進展狀態，而需要通過連續的檢測來判斷，部分 CEA 水平正常的結直腸癌可能具有快速進展的傾向。
CD16a 作為表達于免疫效應細胞表面的重要結合位點，在細胞免疫上起積極作用。體外研究[25-26]表明，高表達 CD16a 的免疫細胞聯合單克隆抗體比普通免疫細胞聯合單克隆抗體，其 ADCC 作用、腫瘤殺傷能力及 IFN-γ 的釋放水平均有增強。利用糖工程增加單克隆抗體對 CD16a 的親和力后，免疫細胞產生 IFN-γ 的能力也增加[27]。也有研究[28]表明，在肝 Kupffer 細胞中下調 CD16a 的表達以后，Kupffer 細胞對肝癌細胞的殺傷能力明顯下降。筆者團隊的前期實驗[5]發現，CD16a 在有肝轉移的結直腸癌患者的原發腫瘤組織中的表達水平明顯低于無肝轉移者。由此可以看出，CD16a 的局部表達下調會導致細胞免疫功能減弱，導致腫瘤進展。本實驗結果表明，結直腸癌組織中 CD16a mRNA 的表達水平與 IL-6 的表達水平呈負相關；IL-6 在微環境中主要表現出免疫抑制作用，且結直腸癌組織中 IL-6 的表達水平也明顯高于癌旁組織。可以認為，從細胞因子角度看，TME 中 CD16a mRNA 的表達變化與免疫抑制形成有關，但是并未表明因果關系。它們可能相互影響、共同作用，導致微環境中免疫抑制逐漸加深，加速腫瘤進展。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：王磊，負責流式細胞術微球陣列法檢測；陳曦，負責實時熒光定量 PCR 法檢測；顏登國，負責課題設計；梁正子，負責標本及臨床資料整理；曹飛龍，負責結果的統計處理；甄運寰，負責流式細胞術實驗準備；李國勝，負責實時熒光定量 PCR 的實驗準備；程海玉，負責臨床資料收集。
倫理聲明：本研究已通過貴州醫科大學附屬醫院的倫理審核批準 ［批準文號：2016 倫審第（26）號］。
腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）是指腫瘤所處的特殊生活環境，主要包括：腫瘤細胞、間質細胞、免疫細胞、腫瘤外基質、細胞因子等，它們相互作用，通過多種機制形成免疫抑制區域，介導腫瘤逃逸[1]。微環境中腫瘤細胞、基質細胞、免疫細胞等均可釋放細胞因子，形成一個細胞因子調節網，協同調節或抑制腫瘤免疫。因此，微環境中細胞因子譜的變化可以反映微環境的免疫情況。
CD16a（FCγRⅢA）為低親和力的 IgG 受體，是一種表達于多種免疫效應細胞表面的跨膜蛋白，通過與人 IgG1 和 IgG3 的 Fc 段結合，誘導免疫效應細胞的抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用（antibody-dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC）[2]，發揮直接殺傷作用或者促進 γ-干擾素（interferone-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、基質金屬蛋白酶等細胞因子的產生，影響細胞免疫功能的發揮[3-4]。它是細胞免疫的重要結合位點，前期實驗[5]發現，CD16a 在有肝轉移患者的原發腫瘤組織中的表達水平明顯低于無肝轉移者，推測局部 CD16a 的表達下調引起了局部免疫功能的減弱，而導致結直腸癌的發生和發展。本研究利用流式細胞術微球陣列法（CBA 法）檢驗結直腸癌組織中輔助性 T 淋巴細胞（helper T lymphocyte，Th）的細胞因子水平，包括 Th1 細胞因子 ［白細胞介素（interleukin，IL）-2、IL-12 和 IFN-γ］、Th2 細胞因子（IL-4、IL-6 和 IL-10）、TNF-α 和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在內的細胞因子譜的變化，了解微環境的免疫抑制情況；并利用 RT-PCR 技術檢測結直腸癌組織中 CD16a mRNA 的表達變化，初步探討 CD16a mRNA 表達與 TME 變化的關系。
1 材料與方法
1.1 研究材料
納入標準：① 所選病例術后均經病理學檢查確診為結直腸腺癌（包括黏液腺癌和印戒細胞癌）；② 術前均未行化療、放療及生物治療。排除標準：① 術前接受放化療及生物治療者；② 多源性結直腸癌和復發性結直腸癌；③ 患者系未成年人。前瞻性收集貴州醫科大學附屬醫院肛腸外科于 2015 年 6 月至 2016 年 12 月期間收治的 42 例行手術切除的結直腸癌患者的癌組織及癌旁組織（距離癌組織以遠 10 cm）進行試驗。42 例患者中，男 22 例，女 20 例；年齡 24～89 歲，中位年齡為 63 歲；腫瘤部位：結腸 13 例，直腸 29 例；病理分型：腺癌 38 例，黏液腺癌 3 例，印戒細胞癌 1 例；淋巴結轉移陽性 19 例，陰性 23 例；TNM 分期：Ⅰ期 12 例，Ⅱ期 10 例，Ⅲ期 10 例，Ⅳ期 10 例。
1.2 主要試劑及設備
RNA 提取試劑盒（全式金）：TransZol Up Plus RNA Kit；RNA 逆轉錄試劑盒（全式金）：EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix；熒光定量 PCR 試劑盒（全式金）：TransStart Tip Green qPCR SuperMix；熒光染料：4S Green Plus 無核酸染料；CD16a 及 GAPDH 內參引物。上述產品均購自生工生物工程（上海）有限公司。流式細胞多因子檢測試劑盒：LEGEND-plexTM 系美國 BioLegend 公司產品。
1.3 方法
1.3.1 CBA 法測定結直腸癌組織及癌旁組織中細胞因子的表達
取待測標本組織，稱重（精確到 0.01 g），漂洗拭干，按質量體積比 1∶4 取 pH=7.4 的 PBS 緩沖液勻漿，低溫 3 000 r/min 離心 10～15 min（r=208 mm），取上清液，棄下面沉淀。全程低溫環境操作。嚴格按照流式細胞因子檢測試劑盒說明書進行標準品制備及后續實驗。標準品最高濃度 C7 的理論濃度為 10 000 pg/mL，后以 1∶4 的比例稀釋到 C1，C1 的理論濃度為 2.4 pg/mL。緩沖液作為最低濃度的標準品 C0，為 0 pg/mL。
1.3.2 RT-PCR 法測定結直腸癌組織中 CD16a mRNA 的表達
設計的 CD16a 引物擴增產物長度為 74 bp，引物序列為：上游引物，5′-TCCAAAAGCCACACTCAAAGAC-3′；下游引物，5′-CTGAAGACACATTTTTACTCCCAAAC-3′。內參基因選擇 GAPDH，GAPDH 引物擴增產物長度為 138 bp，引物序列為：上游引物，5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′；下游引物，5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′。兩種引物的設計及合成均由生工生物工程（上海）有限公司完成。
按試劑盒說明提取總 RNA，進行電泳鑒定后，逆轉錄合成 cDNA，按 RT-PCR 試劑盒說明書進行 RT-PCR 擴增。PCR 反應條件：① 變性：94 ℃30 s；② 94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，重復 45 個循環。PCR 反應體系見試劑盒說明書。PCR 后進行溶解分析，溫度為 60～95 ℃。每個樣本重復檢測 3 次，取平均值。
1.4 統計學方法
CD16a mRNA 的相對表達水平采用 2–△△CT[6]方法計算，因此與細胞因子進行相關性分析時，利用癌旁組織的細胞因子表達水平將癌組織中細胞因子的表達進行轉化：細胞因子的相對表達水平=癌組織中的表達水平/癌旁組織中的表達水平。采用 SPSS 24.0 統計軟件進行分析，對數據進行正態分布檢驗，如果符合正態分布，采用配對或成組 t 檢驗；如果不符合正態分布或不滿足參數檢驗條件，采用非參數 Wilcoxon 符號秩和檢驗、Mann-Whitney U 檢驗和 Kruskal-wallis H 檢驗進行差異性分析。相關性分析采用 Spearman 秩相關分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 結直腸癌組織中 8 種細胞因子的表達水平
2.1.1 標準繪制
測得 C7～C0 中 8 種細胞因子的實際標準濃度后繪制標準曲線如圖 1。結果可見，8 種細胞因子的標準曲線擬合優度 R2值范圍為 0.988～0.998，表明標準曲線的擬合優度佳。
圖1
示 8 種細胞因子的標準曲線圖
a：IL-2；b：IL-4；c：IL-6；d：IL-10；e：IL-12；f：TNF-α；g：IFN-γ；h：VEGF；
2.1.2 結直腸癌組織及癌旁組織 8 種細胞因子的表達水平
結直腸癌組織中 IL-6、TNF-α 和 VEGF 的表達水平高于癌旁組織（P<0.05），而 IL-2、IL-4、IL-10、IL-12 和 IFN-γ 在 2 種組織中的表達差異均無統計學意義（P>0.05），見表 1。
表1
結直腸癌組織與癌旁組織中 8 種細胞因子的表達水平（，pg/mL，n=42）
2.1.3 結直腸癌組織中 8 種細胞因子的表達水平與臨床病理學特征的關系
不同年齡、性別、腫瘤部位、N 分期、TNM 分期和分化程度患者的 8 種細胞因子的表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）；此外，不同 CEA 水平組患者 IL-6 和 VEGF 的表達水平不同，CEA<5.0 ng/mL 組的 IL-6 和 VEGF 水平較高，但其他 6 項指標的差異均無統計學意義（P>0.05），具體結果見表 2。
表2
結直腸癌組織中 8 種細胞因子的表達水平與臨床病理學特征的關系（，pg/mL）
2.2 結直腸癌組織中 CD16a mRNA 的表達水平
CD16a 和 GAPDH 基因的擴增曲線呈倒 S 型，擴增曲線拐點清楚，曲線指數期的斜率兩者基本一致，斜率大，擴增效率高（圖 2a）。溶解曲線為單一峰，溶解溫度均一，未見第二峰，提示無非特異性擴增（圖 2b 和2c）。RNA 提取物的電泳結果表明，28S 和 18S 條帶清晰，28S 條帶亮度約是 18S 條帶的 2 倍（圖 2d），表明RNA 提取基本完整，無明顯降解。PCR 擴增產物電泳圖結果表明，GAPDH 和 CD16a mRNA 的條帶清晰；CD16a 基因片段約為2 000 bp，GAPDH 片段在 1 200～2 000 bp 之間（圖 2e），與預期片段大小相符，表示無非特異性擴增。結直腸癌組織中 CD16a mRNA 的相對表達水平為 3.48±1.0。
圖2
示 CD16a 和 GAPDH 基因的擴增曲線、溶解曲線和瓊脂凝膠電泳結果
a：擴增曲線，Rn 表示熒光強度，ΔRn 表示每個測量點相對基礎熒光的熒光強度；b 和 c：CD16a（b）和 GAPDH（c）的溶解曲線；d：RNA 提取物的電泳圖；e：PCR 擴增產物的電泳圖
2.3 結直腸癌組織中 CD16a mRNA 的表達水平與細胞因子表達水平的相關性分析
結直腸癌組織中 IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α 和 VEGF 的表達水平與 CD16a mRNA 的表達水平無明顯相關性（P>0.05），但 IL-6 的表達水平與 CD16a mRNA 的表達水平呈負相關（P<0.05）。具體見表 3。
表3
結直腸癌組織中 8 種細胞因子的表達水平與 CD16a mRNA 表達水平的相關性分析（n=42）
3 討論
正常情況下，機體免疫功能處于穩定狀態，不會過強或者過弱而導致疾病的發生，輔助性 T 細胞在其中起著重要作用。初始 Th0 細胞經過誘導分化形成 Th1 細胞及 Th2 細胞，它們通過不同的細胞因子，介導不同的免疫應答。Th1 細胞因子（IL-2、IFN-γ 和 IL-12）可以增強免疫細胞的細胞毒作用，介導細胞免疫應答，增強免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷能力；Th2 細胞因子（IL-4、IL-6 和 IL-10）主要促進抗體產生，介導體液免疫。在腫瘤免疫方面，可以直接抑制 Th1 細胞因子的產生來下調腫瘤的特異性免疫應答，從而抑制免疫效應細胞的活化[7]。Th1 細胞及 Th2 細胞在免疫過程中相互調節和制約，形成動態平衡，機體的抗腫瘤免疫以 Th1 細胞介導的細胞免疫為主，當 Th1/Th2 平衡失調、Th1 向 Th2 細胞偏移，則會導致機體細胞免疫功能嚴重減弱，促使腫瘤細胞能逃避機體免疫系統的攻擊，出現腫瘤逃逸現象，導致腫瘤細胞大量增殖。
本研究中，雖然 IL-6 在結直腸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織（P<0.05），但 Th1 細胞和 Th2 細胞的主要細胞因子，包括 IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-4 及 IL-10 在結直腸癌組織與癌旁組織間的差異并無統計學意義（P>0.05）。總體來看，在 TME 中未發現明顯的 Th1/Th2 細胞偏移現象，這與之前的研究結果[8]有所出入。這可能與微環境中腫瘤浸潤細胞及癌細胞同樣分泌相關細胞因子有關。
TNF-α 是典型的炎性細胞因子，主要由巨噬細胞和腫瘤細胞產生，其生物學活性較為廣泛，既可誘導腫瘤細胞凋亡，被認為是腫瘤抑制性細胞因子[9]，同時可使腫瘤細胞增殖和分化。很多研究[10-12]發現，TNF-α 是將炎癥與癌癥進行關聯的腫瘤促進劑，能夠激活癌基因，導致細胞 DNA 損傷和腫瘤轉移，在結直腸癌的侵襲轉移中起主要作用，晚期結直腸癌中無論血漿還是腫瘤組織其局部 TNF-α 的表達水平均顯著升高。VEGF 在微環境中因缺氧環境而被誘導表達上調，與血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）—VEGFR-1 和 VEGFR-2 結合而促進血管網絡形成，來促進腫瘤的形成和轉移[13]；并且在 TME 中，VEGF 還能誘導髓源性抑制細胞（MDSC）增殖，從而抑制免疫功能[14]。IL-6 除了可以促進腫瘤細胞的增殖外，它還可以通過促進血管生成[15]、促進 DNA 錯配修復缺陷[16]、促進 MDSC 蓄積[17]、限制 CD4+Th1 細胞發育[18]等機制促進腫瘤的發生和發展，IL-6 通過調節促凋亡因子 Bcl 相關 X 蛋白和 DNA 修復蛋白 Ku70/86 的表達，以及分子間的相互作用而促進結腸癌細胞的增殖。總的來說，IL-6、TNF-α 和 VEGF 的表達情況反映了 TME 中的免疫抑制現象。本研究結果顯示，結直腸癌組織中 IL-6、TNF-α 和 VEGF 的表達水平高于癌旁組織，說明結直腸癌腫瘤局部微環境中存在免疫抑制現象。
目前的研究結果并未發現免疫抑制的嚴重程度與腫瘤的進展如腫瘤分期以及有無淋巴結轉移有關。臨床病理因素對微環境中細胞因子的影響分析結果顯示，除了 IL-6 與 VEGF 的表達水平在不同水平 CEA 組中表現出差異性外，其余均未見顯著差異。CEA 作為一種胚胎性抗原，與腫瘤細胞免疫、黏附及凋亡有關，且與腫瘤的分期等有關，在低分化及Ⅲ/Ⅳ期結直腸癌患者的外周血中其表達水平明顯升高；腫瘤局部 CEA 表達有導致腫瘤細胞浸潤脈管、發生淋巴及血液轉移的危險[19-20]。本研究結果顯示，術前血清 CEA 正常組患者的 IL-6 和 VEGF 的表達水平高于 CEA 升高組。但鑒于結直腸癌局部腫瘤組織中均有 CEA 表達而僅有 40%～50% 的結直腸癌患者血清 CEA 升高[21-22]，且對于腫瘤局部 CEA 釋放進入血循環中的機制目前不是很清楚，因此，血清 CEA 與腫瘤局部微環境中細胞因子表達之間的相互作用機制還不明確。有研究[23-24]顯示，腫瘤局部 VEGF 的表達水平與血清 CEA 水平無明顯相關性，而血清 CEA 水平與 IL-6 的表達水平呈正相關。另外，單獨的 CEA 水平并不能描述腫瘤的進展狀態，而需要通過連續的檢測來判斷，部分 CEA 水平正常的結直腸癌可能具有快速進展的傾向。
CD16a 作為表達于免疫效應細胞表面的重要結合位點，在細胞免疫上起積極作用。體外研究[25-26]表明，高表達 CD16a 的免疫細胞聯合單克隆抗體比普通免疫細胞聯合單克隆抗體，其 ADCC 作用、腫瘤殺傷能力及 IFN-γ 的釋放水平均有增強。利用糖工程增加單克隆抗體對 CD16a 的親和力后，免疫細胞產生 IFN-γ 的能力也增加[27]。也有研究[28]表明，在肝 Kupffer 細胞中下調 CD16a 的表達以后，Kupffer 細胞對肝癌細胞的殺傷能力明顯下降。筆者團隊的前期實驗[5]發現，CD16a 在有肝轉移的結直腸癌患者的原發腫瘤組織中的表達水平明顯低于無肝轉移者。由此可以看出，CD16a 的局部表達下調會導致細胞免疫功能減弱，導致腫瘤進展。本實驗結果表明，結直腸癌組織中 CD16a mRNA 的表達水平與 IL-6 的表達水平呈負相關；IL-6 在微環境中主要表現出免疫抑制作用，且結直腸癌組織中 IL-6 的表達水平也明顯高于癌旁組織。可以認為，從細胞因子角度看，TME 中 CD16a mRNA 的表達變化與免疫抑制形成有關，但是并未表明因果關系。它們可能相互影響、共同作用，導致微環境中免疫抑制逐漸加深，加速腫瘤進展。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：王磊，負責流式細胞術微球陣列法檢測；陳曦，負責實時熒光定量 PCR 法檢測；顏登國，負責課題設計；梁正子，負責標本及臨床資料整理；曹飛龍，負責結果的統計處理；甄運寰，負責流式細胞術實驗準備；李國勝，負責實時熒光定量 PCR 的實驗準備；程海玉，負責臨床資料收集。
倫理聲明：本研究已通過貴州醫科大學附屬醫院的倫理審核批準 ［批準文號：2016 倫審第（26）號］。
