引用本文： 鹿彬, 張鵬, 張延濤, 張啟文. NF-κBp65 蛋白和自噬相關因子 Beclin1 及 p62 在甲狀腺癌中的表達及臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(11): 1304-1310. doi: 10.7507/1007-9424.201906051 復制
甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌的高發類型，約占甲狀腺癌的 85%，發病機制目前尚未完全明確[1]。盡管近年來診療手段有了很大進展，但由于其容易發生淋巴結轉移，預后依然較差[2]。自噬是細胞適應內外部環境變化的能動過程，細胞內部分胞漿、蛋白質和變性壞死的細胞器與自噬泡中的溶酶體融合形成自噬溶酶體，并降解產生氨基酸和核苷酸供細胞再利用的循環過程，也被稱為Ⅱ型程序性死亡，屬于細胞正常的功能，這一功能在進化過程中高度保守[3]。研究[4]表明，自噬在腫瘤細胞生長、發育、成熟及死亡過程發揮著不同的作用。據文獻[5]報道，核因子 NF-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）與腫瘤細胞的發生、發展密切相關，在多種實體瘤中呈異常高表達。此外，NF-κBp65 通過調節多條信號轉導通路參與了細胞的自噬過程[6]。目前，自噬與 NF-κBp65 是否相互作用共同促進 PTC 合并頸部淋巴結轉移的發展尚不清楚。因此本研究擬分析 NF-κBp65 和自噬相關蛋白 Beclin1 和 p62 在 PTC 組織中的表達，并探討其臨床意義。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集 2013 年 3 月至 2015 年 2 月期間筆者所在醫院收治的 160 例經病理學檢查證實為 PTC 患者的腫瘤組織標本及其癌旁組織標本，同時收集上述患者中伴有頸部淋巴結轉移組織標本 90 例。納入標準：①經病理學檢查確診為 PTC 的患者；② 所有入選患者在術前均未進行放化療和其他治療；③ 3 年隨訪資料完整。排除標準：伴隨有其他惡性腫瘤的患者。160 例 PTC 患者中男 56 例，女 104 例；年齡 40～79 歲，中位年齡 48.8 歲。按照國際抗癌聯盟 TNM 分期標準 2009 版[7]：Ⅰ+Ⅱ期患者 78 例，Ⅲ+Ⅳ期患者 82 例；腫瘤直徑<1 cm 患者 70 例，≥1 cm 患者 90 例；組織學分級：高分化患者 52 例，中分化患者 64 例，低分化患者 44 例。所有組織標本均用 10% 中性甲醛固定，然后常規石蠟包埋，用于后續免疫組化法檢測。本組 PTC 患者均以電話、門診等方式進行了隨訪，隨訪截止時間為 2018 年 3 月 20 日，總生存時間（total survival time，OS）為從手術至隨訪結束或者死亡時間止。
1.2 主要抗體和試劑盒
兔抗人 NF-κBp65 多克隆抗體、兔抗人 Beclin1 單克隆抗體和 p62 單克隆抗體采購自北京奧維亞生物技術有限公司，鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptomyces anti-biotin protein-peroxidase，SP）試劑盒購自美國 Abcam 公司，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒采購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
1.3 免疫組織化學檢測
取納入研究的組織石蠟標本進行切片，片厚 4 μm，將切片放入水浴 40℃、4 min、進行展開，然后置于 60℃ 烘箱中進行烘片 30 min。采用二甲苯進行脫蠟 20 min，然后采用梯度乙醇進行水化，再加入 3% 雙氧水，室溫 10 min，從而阻斷內源性過氧化物酶的活性；再對 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 蛋白進行高溫高壓組織修復，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）進行沖洗，加入 5% 羊血孵育 30 min，除去封閉液，加入一抗，置于 4℃ 冰箱過夜，PBS 代替一抗作為陰性對照，次日取出使用 PBS 沖洗，每張切片滴加二抗，室溫下孵育 30 min，PBS 沖洗 5 次，每次 3 min，加入 DAB 顯色水、使用 PBS 沖洗終止顯色，使用水沖洗，鹽酸乙醇分化，乙醇脫水干燥，于光學顯微鏡下進行觀察。
1.4 NF-κBp65、Beclin1 和 p62 表達陽性判定標準
光學顯微鏡下觀察制備好的切片，陽性表達為細胞內出現棕黃色顆粒。由兩名病理科醫師獨立進行評估，每張切片隨機選取 5 個高倍鏡視野（×400）在光鏡下觀察，通過染色的強度和陽性細胞數 2 個總分評分判定是否陽性。染色強度計分：無著色計 0 分，淡黃色計 1 分，棕黃或棕褐色計 2 分；陽性細胞數計分：無陽性細胞計 0 分，< 25% 計 1 分，25%～50% 計 2 分，51%～75% 計 3 分，>75% 計 4 分。兩者結果相乘>3 即為陽性，≤3 則為陰性[8]。
1.5 統計學方法
采用 SPSS16.0 統計學軟件進行統計學分析。分類資料用百分比表示，采用 χ2 檢驗或 Fisher 檢驗進行分析；等級變量之間的相關性采用 Spearman 相關分析；采用 Graphpad prism 5 軟件繪制生存曲線，生存分析應用 Kaplan-Meier 方法，Cox 回歸比例風險模型分析預后影響因素。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 NF-κBp65、Beclin1 和 p62 在不 同組織中表達的檢測結果
NF-κBp65、Beclin1 和 p62 在不同組織中表達的免疫組織化學染色結果見圖 1。PTC 組織和轉移淋巴結組織中 NF-κBp65 及 p62 表達陽性率均明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義（P<0.05），但 PTC 組織和轉移淋巴結組織中 NF-κBp65 及 p62 表達陽性率比較差異無統計學意義（P>0.05）。PTC 組織和轉移淋巴結組織中 Beclin1 表達陽性率明顯低于癌旁組織，差異有統計學意義（P<0.05），而 PTC 組織和轉移淋巴結組織中 Beclin1 表達陽性率比較差異無統計學意義（P>0.05）。具體見表 1。
圖1
示免疫組織化學法檢測 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 在不同組織中的表達（IHC ×200）
a：NF-κBp65 在癌旁組織中陰性表達；b：NF-κBp65 在轉移淋巴結組織中陽性表達；c：NF-κBp65 在 PTC 組織中陽性表達；d：Beclin1 在癌旁組織中陰性表達；e：Beclin1 在轉移淋巴結組織中陽性表達；f：Beclin1 在 PTC 組織中陽性表達；g：p62 在癌旁組織中陰性表達；h：p62 在轉移淋巴結組織中陽性表達；i：p62 在 PTC 組織中陽性表達
表1
NF-κBp65、Beclin1 及 p62 在不同組織中的表達結果［例（%）］
2.2 PTC 組織中 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 表達與其臨床病理特征的關系
結果見表 2。由表 2 可見：PTC 組織中 NF-κBp65 的表達與其臨床病理特征均無關（P>0.05）。PTC 組織中 Beclin1 及 p62 在不同性別、年齡及腫瘤直徑 PTC 患者中的表達陽性率比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。p62 在不同分化程度 PTC 患者中的表達情況比較，差異有統計學意義（P<0.05），其中，p62 表達陽性率隨腫瘤分化程度升高而降低。Beclin1 在不同腫瘤分化程度 PTC 患者中的表達情況比較，差異無統計學意義（P>0.05）；在Ⅲ+Ⅳ期和有淋巴結轉移者中其 Beclin1 表達陽性率分別低于Ⅰ+Ⅱ期和無淋巴轉移者（P<0.05），而 p62 的表達則與之相反。
表2
PTC 組織中 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 的表達與其臨床病理特征的關系［例（%）］
2.3 NF-κBp65、Beclin1 和 p62 表達的相關性分析結果
Spearman 相關分析顯示，PTC 組織中，Beclin1 和 p62 的表達呈負相關關系（r=–0.656，P<0.01），PTC 組織中 NF-κBp65 與 Beclin1 和 p62 的表達無明顯相關性（r=0.042，r=0.116，P>0.05）；在轉移淋巴結組織中，Beclin1 和 p62 的表達也呈負相關關系（r=–0.562，P<0.01），NF-κBp65 與 Beclin1 和 p62 的表達無明顯相關性（r=0.071，r=0.136，P>0.05）。
2.4 PTC 組織中 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 的 表達對預后的影響
160 例患者隨訪 3 年，死亡 44 例，3 年生存率為 72.50%（116/160）。PTC 組織中 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 表達陽性及陰性者的生存曲線見圖 2。PTC 組織中 p62 表達陽性者 3 年生存率為 65.52%（76/116），低于表達陰性者的 90.91%（40/44），差異有統計學意義（χ2=34.351，P=0.000）；NF-κBp65 及 Beclin1 表達陽性患者的 3 年生存率分別為 67.69%（88/130）和 94.12%（32/34），與 NF-κBp65 及 Beclin1 表達陰性患者的 93.33%（28/30）、66.67%（84/126）比較，明顯降低或增高，差異均具有統計學意義（χ2=8.038、χ2=10.120，P<0.05）。
圖2
示 NF-κBp65（a）、Beclin1（b）及 p62（c）表達陽性/陰性患者的生存曲線
2.5 PTC 患者預后影 響因素的 COX 比例風險模型分析結果
單因素分析結果（表 3）顯示 TNM 分期、淋巴結轉移是 PTC 預后的影響因素。以患者預后的生存情況為因變量，采用 COX 比例風險回歸模型分析 PTC 患者 TNM 分期、淋巴結轉移、NF-κBp65、Beclin1 及 p62 的表達對其預后的影響，結果顯示：TNM 分期、淋巴結轉移、NF-κBp65 及 Beclin1 為 PTC 預后的獨立危險因素，Beclin1 為保護因素（表 4）。
表3
PTC 患者預后影響因素的單因素分析
表4
PTC 患者預后影響因素的 Cox 比例風險模型分析結果
3 討論
PTC 是甲狀腺惡性腫瘤中最為常見的類型，多發于中青年女性，且容易較早發生淋巴結轉移，對患者生命安全造成嚴重威脅。研究[9]表明，有多個癌基因及抑癌基因參與了 PTC 的發生發展，深入探討相關蛋白的表達有利于進一步明確腫瘤的發病機制，同時可提高臨床分子診斷的準確性，有助于改善患者預后[10]。
細胞死亡根據形態學表型不同分為Ⅰ、Ⅱ 和 Ⅲ 3 種類型，分別指凋亡、自噬性細胞死亡和細胞壞死[11]。自噬廣泛存在于細胞的生理活動中，正常細胞通過自噬可以清除胞內廢物，維持細胞內環境及基因組的穩定，同時也是一種細胞對抗營養缺乏、電離輻射等不良環境的防御機制，在抑制炎癥或腫瘤的生長過程中也起到重要的作用[12]。然而有研究[13]表明，自噬活性受到損傷后對于細胞病變和腫瘤的進展起到促進作用。微環境決定了自噬在腫瘤發展中的作用，在腫瘤細胞中自噬相關蛋白會出現異常表達，自噬相關蛋白的表達成為研究腫瘤發生及抑制腫瘤發展的熱點。
Beclin1 稱之為 BECN1 基因，位于人類染色體 17q21，定位于高爾基體，能夠參與自噬體和 PI3K 復合物的形成。文獻[14]報道稱 Beclin1 參與多種腫瘤的發生和發展，其中在前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌組織中因 Beclin1 基因突變而蛋白表達量降低。本研究發現，PTC 組織及轉移的淋巴結組織中 Beclin1 的表達陽性率低于癌旁組織，提示 Beclin1 可能參與 PTC 的發生、發展。TNM 分期和淋巴結轉移是評估 PTC 惡性程度的重要指標，本研究結果顯示，Ⅲ+Ⅳ期和有淋巴結轉移者中其 Beclin1 表達陽性率分別低于Ⅰ+Ⅱ期和無淋巴轉移者（P<0.05），提示 Beclin1 低表達和 PTC 的生物學行為存在關系。通過進一步生存分析顯示：Beclin1 表達陽性和陰性患者其 3 年生存率也存在明顯差異，COX 比例風險模型結果顯示 Beclin1 是 PTC 患者預后的保護因素，提示 Beclin1 的表達和 PTC 患者預后存在一定關系，但只檢測 Beclin1 不能很好地反映預后情況。
p62 是一種自噬底物連接蛋白，具有多個結構域，可結合泛素化修飾的待降解蛋白，并將其運輸到自噬泡中降解[15]。細胞質中的 p62 在正常細胞自噬過程中不斷被降解，而自噬功能出現缺陷或失活后，會導致 p62 蛋白在細胞質中累積，所以 p62 可以作為反映細胞自噬活性的標志性蛋白[16]。有研究[17]表明，p62 濃度增加會促進活性氧的累積，進而導致細胞內質網發生應激反應和 DNA 損傷。此外，NF-κB 信號通路及下游基因的表達也會受到 p62 積累的影響而導致促腫瘤炎癥反應上調。自噬通過降低細胞內 p62 的水平是抑制腫瘤形成的機制之一[18]。Beclin1 是在哺乳動物中第一個被發現的調節自噬抑癌基因，而 p62 可使 Beclin1 和 Bcl-2 分離，釋放出 Beclin1 而促進自噬活性[19]。本研究發現，PTC 組織及轉移的淋巴結組織中 p62 的表達陽性率高于癌旁組織，提示 p62 可能參與了 PTC 的發生和發展；進一步分析顯示，PTC 組織中 p62 的表達陽性率隨著 TNM 分期和分化程度的降低而增加，有淋巴結轉移患者 p62 表達陽性率亦增加明顯，提示 p62 高表達能夠間接反映 PTC 惡性生物學行為。相關性分析結果顯示，PTC 組織及轉移淋巴結組織中 p62 的表達與 Beclin1 表達呈負相關關系，隨訪結果顯示 p62 表達陽性患者的 3 年生存率明顯低于表達陰性患者，COX 分析結果顯示 p62 高表達可作為評估 PTC 預后的獨立危險因素。
NF-κBp65 是由原癌基因表達，其能夠使 Beclin1 磷酸化而抑制自噬活性，NF-κBp65 還可根據其具有的激酶非依賴活性促進細胞存活[8,20-21]。研究[22-24]表明，NF-κBp65 在多種實體瘤中均呈高表達狀態。本研究結果與之類似，在 PTC 組織和轉移淋巴結組織中 NF-κBp65 表達陽性率高于癌旁組織，提示 NF-κBp65 與 PTC 的發生發展關系密切；進一步結果顯示 NF-κBp65 表達與 PTC 患者臨床病理特征均不存在相關性，但 NF-κBp65 表達陽性者的 3 年生存率低于表達陰性者，其差異具有統計學意義，這可能與納入的臨床樣本量較少有關。本研究發現，NF-κBp65 表達與自噬相關蛋白 Beclin1 和 p62 的表達無相關性，可能是由于自噬的調節與 NF-κBp65 磷酸化水平有關，而總 NF-κBp65 蛋白表達水平不能反映磷酸化程度，因而呈現與自噬相關性不顯著。但本研究發現 NF-κBp65 也可作為 PTC 患者預后的獨立預測因素。
綜上所述，NF-κBp65 和 p62 蛋白在 PTC 組織及其淋巴結轉移組織中呈高表達，而 Beclin1 呈低表達，三者可作為 PTC 患者預后的獨立預測因素；此外，Beclin1 及 p62 與 PTC 生物學行為有關，可能成為 PTC 診斷的潛在指標。
重要聲明
利益沖突聲明：無任何利益沖突。
作者貢獻聲明：鹿彬和張鵬：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；張啟文：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；張延濤：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改。
倫理聲明：本研究通過了濟南市人民醫院倫理委員會的審批。
甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌的高發類型，約占甲狀腺癌的 85%，發病機制目前尚未完全明確[1]。盡管近年來診療手段有了很大進展，但由于其容易發生淋巴結轉移，預后依然較差[2]。自噬是細胞適應內外部環境變化的能動過程，細胞內部分胞漿、蛋白質和變性壞死的細胞器與自噬泡中的溶酶體融合形成自噬溶酶體，并降解產生氨基酸和核苷酸供細胞再利用的循環過程，也被稱為Ⅱ型程序性死亡，屬于細胞正常的功能，這一功能在進化過程中高度保守[3]。研究[4]表明，自噬在腫瘤細胞生長、發育、成熟及死亡過程發揮著不同的作用。據文獻[5]報道，核因子 NF-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）與腫瘤細胞的發生、發展密切相關，在多種實體瘤中呈異常高表達。此外，NF-κBp65 通過調節多條信號轉導通路參與了細胞的自噬過程[6]。目前，自噬與 NF-κBp65 是否相互作用共同促進 PTC 合并頸部淋巴結轉移的發展尚不清楚。因此本研究擬分析 NF-κBp65 和自噬相關蛋白 Beclin1 和 p62 在 PTC 組織中的表達，并探討其臨床意義。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集 2013 年 3 月至 2015 年 2 月期間筆者所在醫院收治的 160 例經病理學檢查證實為 PTC 患者的腫瘤組織標本及其癌旁組織標本，同時收集上述患者中伴有頸部淋巴結轉移組織標本 90 例。納入標準：①經病理學檢查確診為 PTC 的患者；② 所有入選患者在術前均未進行放化療和其他治療；③ 3 年隨訪資料完整。排除標準：伴隨有其他惡性腫瘤的患者。160 例 PTC 患者中男 56 例，女 104 例；年齡 40～79 歲，中位年齡 48.8 歲。按照國際抗癌聯盟 TNM 分期標準 2009 版[7]：Ⅰ+Ⅱ期患者 78 例，Ⅲ+Ⅳ期患者 82 例；腫瘤直徑<1 cm 患者 70 例，≥1 cm 患者 90 例；組織學分級：高分化患者 52 例，中分化患者 64 例，低分化患者 44 例。所有組織標本均用 10% 中性甲醛固定，然后常規石蠟包埋，用于后續免疫組化法檢測。本組 PTC 患者均以電話、門診等方式進行了隨訪，隨訪截止時間為 2018 年 3 月 20 日，總生存時間（total survival time，OS）為從手術至隨訪結束或者死亡時間止。
1.2 主要抗體和試劑盒
兔抗人 NF-κBp65 多克隆抗體、兔抗人 Beclin1 單克隆抗體和 p62 單克隆抗體采購自北京奧維亞生物技術有限公司，鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptomyces anti-biotin protein-peroxidase，SP）試劑盒購自美國 Abcam 公司，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒采購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
1.3 免疫組織化學檢測
取納入研究的組織石蠟標本進行切片，片厚 4 μm，將切片放入水浴 40℃、4 min、進行展開，然后置于 60℃ 烘箱中進行烘片 30 min。采用二甲苯進行脫蠟 20 min，然后采用梯度乙醇進行水化，再加入 3% 雙氧水，室溫 10 min，從而阻斷內源性過氧化物酶的活性；再對 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 蛋白進行高溫高壓組織修復，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）進行沖洗，加入 5% 羊血孵育 30 min，除去封閉液，加入一抗，置于 4℃ 冰箱過夜，PBS 代替一抗作為陰性對照，次日取出使用 PBS 沖洗，每張切片滴加二抗，室溫下孵育 30 min，PBS 沖洗 5 次，每次 3 min，加入 DAB 顯色水、使用 PBS 沖洗終止顯色，使用水沖洗，鹽酸乙醇分化，乙醇脫水干燥，于光學顯微鏡下進行觀察。
1.4 NF-κBp65、Beclin1 和 p62 表達陽性判定標準
光學顯微鏡下觀察制備好的切片，陽性表達為細胞內出現棕黃色顆粒。由兩名病理科醫師獨立進行評估，每張切片隨機選取 5 個高倍鏡視野（×400）在光鏡下觀察，通過染色的強度和陽性細胞數 2 個總分評分判定是否陽性。染色強度計分：無著色計 0 分，淡黃色計 1 分，棕黃或棕褐色計 2 分；陽性細胞數計分：無陽性細胞計 0 分，< 25% 計 1 分，25%～50% 計 2 分，51%～75% 計 3 分，>75% 計 4 分。兩者結果相乘>3 即為陽性，≤3 則為陰性[8]。
1.5 統計學方法
采用 SPSS16.0 統計學軟件進行統計學分析。分類資料用百分比表示，采用 χ2 檢驗或 Fisher 檢驗進行分析；等級變量之間的相關性采用 Spearman 相關分析；采用 Graphpad prism 5 軟件繪制生存曲線，生存分析應用 Kaplan-Meier 方法，Cox 回歸比例風險模型分析預后影響因素。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 NF-κBp65、Beclin1 和 p62 在不 同組織中表達的檢測結果
NF-κBp65、Beclin1 和 p62 在不同組織中表達的免疫組織化學染色結果見圖 1。PTC 組織和轉移淋巴結組織中 NF-κBp65 及 p62 表達陽性率均明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義（P<0.05），但 PTC 組織和轉移淋巴結組織中 NF-κBp65 及 p62 表達陽性率比較差異無統計學意義（P>0.05）。PTC 組織和轉移淋巴結組織中 Beclin1 表達陽性率明顯低于癌旁組織，差異有統計學意義（P<0.05），而 PTC 組織和轉移淋巴結組織中 Beclin1 表達陽性率比較差異無統計學意義（P>0.05）。具體見表 1。
圖1
示免疫組織化學法檢測 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 在不同組織中的表達（IHC ×200）
a：NF-κBp65 在癌旁組織中陰性表達；b：NF-κBp65 在轉移淋巴結組織中陽性表達；c：NF-κBp65 在 PTC 組織中陽性表達；d：Beclin1 在癌旁組織中陰性表達；e：Beclin1 在轉移淋巴結組織中陽性表達；f：Beclin1 在 PTC 組織中陽性表達；g：p62 在癌旁組織中陰性表達；h：p62 在轉移淋巴結組織中陽性表達；i：p62 在 PTC 組織中陽性表達
表1
NF-κBp65、Beclin1 及 p62 在不同組織中的表達結果［例（%）］
2.2 PTC 組織中 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 表達與其臨床病理特征的關系
結果見表 2。由表 2 可見：PTC 組織中 NF-κBp65 的表達與其臨床病理特征均無關（P>0.05）。PTC 組織中 Beclin1 及 p62 在不同性別、年齡及腫瘤直徑 PTC 患者中的表達陽性率比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。p62 在不同分化程度 PTC 患者中的表達情況比較，差異有統計學意義（P<0.05），其中，p62 表達陽性率隨腫瘤分化程度升高而降低。Beclin1 在不同腫瘤分化程度 PTC 患者中的表達情況比較，差異無統計學意義（P>0.05）；在Ⅲ+Ⅳ期和有淋巴結轉移者中其 Beclin1 表達陽性率分別低于Ⅰ+Ⅱ期和無淋巴轉移者（P<0.05），而 p62 的表達則與之相反。
表2
PTC 組織中 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 的表達與其臨床病理特征的關系［例（%）］
2.3 NF-κBp65、Beclin1 和 p62 表達的相關性分析結果
Spearman 相關分析顯示，PTC 組織中，Beclin1 和 p62 的表達呈負相關關系（r=–0.656，P<0.01），PTC 組織中 NF-κBp65 與 Beclin1 和 p62 的表達無明顯相關性（r=0.042，r=0.116，P>0.05）；在轉移淋巴結組織中，Beclin1 和 p62 的表達也呈負相關關系（r=–0.562，P<0.01），NF-κBp65 與 Beclin1 和 p62 的表達無明顯相關性（r=0.071，r=0.136，P>0.05）。
2.4 PTC 組織中 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 的 表達對預后的影響
160 例患者隨訪 3 年，死亡 44 例，3 年生存率為 72.50%（116/160）。PTC 組織中 NF-κBp65、Beclin1 及 p62 表達陽性及陰性者的生存曲線見圖 2。PTC 組織中 p62 表達陽性者 3 年生存率為 65.52%（76/116），低于表達陰性者的 90.91%（40/44），差異有統計學意義（χ2=34.351，P=0.000）；NF-κBp65 及 Beclin1 表達陽性患者的 3 年生存率分別為 67.69%（88/130）和 94.12%（32/34），與 NF-κBp65 及 Beclin1 表達陰性患者的 93.33%（28/30）、66.67%（84/126）比較，明顯降低或增高，差異均具有統計學意義（χ2=8.038、χ2=10.120，P<0.05）。
圖2
示 NF-κBp65（a）、Beclin1（b）及 p62（c）表達陽性/陰性患者的生存曲線
2.5 PTC 患者預后影 響因素的 COX 比例風險模型分析結果
單因素分析結果（表 3）顯示 TNM 分期、淋巴結轉移是 PTC 預后的影響因素。以患者預后的生存情況為因變量，采用 COX 比例風險回歸模型分析 PTC 患者 TNM 分期、淋巴結轉移、NF-κBp65、Beclin1 及 p62 的表達對其預后的影響，結果顯示：TNM 分期、淋巴結轉移、NF-κBp65 及 Beclin1 為 PTC 預后的獨立危險因素，Beclin1 為保護因素（表 4）。
表3
PTC 患者預后影響因素的單因素分析
表4
PTC 患者預后影響因素的 Cox 比例風險模型分析結果
3 討論
PTC 是甲狀腺惡性腫瘤中最為常見的類型，多發于中青年女性，且容易較早發生淋巴結轉移，對患者生命安全造成嚴重威脅。研究[9]表明，有多個癌基因及抑癌基因參與了 PTC 的發生發展，深入探討相關蛋白的表達有利于進一步明確腫瘤的發病機制，同時可提高臨床分子診斷的準確性，有助于改善患者預后[10]。
細胞死亡根據形態學表型不同分為Ⅰ、Ⅱ 和 Ⅲ 3 種類型，分別指凋亡、自噬性細胞死亡和細胞壞死[11]。自噬廣泛存在于細胞的生理活動中，正常細胞通過自噬可以清除胞內廢物，維持細胞內環境及基因組的穩定，同時也是一種細胞對抗營養缺乏、電離輻射等不良環境的防御機制，在抑制炎癥或腫瘤的生長過程中也起到重要的作用[12]。然而有研究[13]表明，自噬活性受到損傷后對于細胞病變和腫瘤的進展起到促進作用。微環境決定了自噬在腫瘤發展中的作用，在腫瘤細胞中自噬相關蛋白會出現異常表達，自噬相關蛋白的表達成為研究腫瘤發生及抑制腫瘤發展的熱點。
Beclin1 稱之為 BECN1 基因，位于人類染色體 17q21，定位于高爾基體，能夠參與自噬體和 PI3K 復合物的形成。文獻[14]報道稱 Beclin1 參與多種腫瘤的發生和發展，其中在前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌組織中因 Beclin1 基因突變而蛋白表達量降低。本研究發現，PTC 組織及轉移的淋巴結組織中 Beclin1 的表達陽性率低于癌旁組織，提示 Beclin1 可能參與 PTC 的發生、發展。TNM 分期和淋巴結轉移是評估 PTC 惡性程度的重要指標，本研究結果顯示，Ⅲ+Ⅳ期和有淋巴結轉移者中其 Beclin1 表達陽性率分別低于Ⅰ+Ⅱ期和無淋巴轉移者（P<0.05），提示 Beclin1 低表達和 PTC 的生物學行為存在關系。通過進一步生存分析顯示：Beclin1 表達陽性和陰性患者其 3 年生存率也存在明顯差異，COX 比例風險模型結果顯示 Beclin1 是 PTC 患者預后的保護因素，提示 Beclin1 的表達和 PTC 患者預后存在一定關系，但只檢測 Beclin1 不能很好地反映預后情況。
p62 是一種自噬底物連接蛋白，具有多個結構域，可結合泛素化修飾的待降解蛋白，并將其運輸到自噬泡中降解[15]。細胞質中的 p62 在正常細胞自噬過程中不斷被降解，而自噬功能出現缺陷或失活后，會導致 p62 蛋白在細胞質中累積，所以 p62 可以作為反映細胞自噬活性的標志性蛋白[16]。有研究[17]表明，p62 濃度增加會促進活性氧的累積，進而導致細胞內質網發生應激反應和 DNA 損傷。此外，NF-κB 信號通路及下游基因的表達也會受到 p62 積累的影響而導致促腫瘤炎癥反應上調。自噬通過降低細胞內 p62 的水平是抑制腫瘤形成的機制之一[18]。Beclin1 是在哺乳動物中第一個被發現的調節自噬抑癌基因，而 p62 可使 Beclin1 和 Bcl-2 分離，釋放出 Beclin1 而促進自噬活性[19]。本研究發現，PTC 組織及轉移的淋巴結組織中 p62 的表達陽性率高于癌旁組織，提示 p62 可能參與了 PTC 的發生和發展；進一步分析顯示，PTC 組織中 p62 的表達陽性率隨著 TNM 分期和分化程度的降低而增加，有淋巴結轉移患者 p62 表達陽性率亦增加明顯，提示 p62 高表達能夠間接反映 PTC 惡性生物學行為。相關性分析結果顯示，PTC 組織及轉移淋巴結組織中 p62 的表達與 Beclin1 表達呈負相關關系，隨訪結果顯示 p62 表達陽性患者的 3 年生存率明顯低于表達陰性患者，COX 分析結果顯示 p62 高表達可作為評估 PTC 預后的獨立危險因素。
NF-κBp65 是由原癌基因表達，其能夠使 Beclin1 磷酸化而抑制自噬活性，NF-κBp65 還可根據其具有的激酶非依賴活性促進細胞存活[8,20-21]。研究[22-24]表明，NF-κBp65 在多種實體瘤中均呈高表達狀態。本研究結果與之類似，在 PTC 組織和轉移淋巴結組織中 NF-κBp65 表達陽性率高于癌旁組織，提示 NF-κBp65 與 PTC 的發生發展關系密切；進一步結果顯示 NF-κBp65 表達與 PTC 患者臨床病理特征均不存在相關性，但 NF-κBp65 表達陽性者的 3 年生存率低于表達陰性者，其差異具有統計學意義，這可能與納入的臨床樣本量較少有關。本研究發現，NF-κBp65 表達與自噬相關蛋白 Beclin1 和 p62 的表達無相關性，可能是由于自噬的調節與 NF-κBp65 磷酸化水平有關，而總 NF-κBp65 蛋白表達水平不能反映磷酸化程度，因而呈現與自噬相關性不顯著。但本研究發現 NF-κBp65 也可作為 PTC 患者預后的獨立預測因素。
綜上所述，NF-κBp65 和 p62 蛋白在 PTC 組織及其淋巴結轉移組織中呈高表達，而 Beclin1 呈低表達，三者可作為 PTC 患者預后的獨立預測因素；此外，Beclin1 及 p62 與 PTC 生物學行為有關，可能成為 PTC 診斷的潛在指標。
重要聲明
利益沖突聲明：無任何利益沖突。
作者貢獻聲明：鹿彬和張鵬：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；張啟文：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；張延濤：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改。
倫理聲明：本研究通過了濟南市人民醫院倫理委員會的審批。
