引用本文： 余伍勇, 張文鋒, 程瑤, 龔建平. PI3K/AKT 通路和 S1PR2 在急性梗阻性膽管炎誘導大鼠全身炎癥反應中的作用. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(11): 1278-1283. doi: 10.7507/1007-9424.201906019 復制
急性梗阻性膽管炎（acute obstructive cholangitis，AOC）是肝膽外科常見疾病，病因主要是膽總管結石、新生物、膽總管狹窄等造成膽汁引流不暢，導致細菌及細菌產物脂多糖等反流入血，從而誘發全身炎癥反應[1]。磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/AKT 通路參與單核巨噬細胞誘導的炎癥反應[1-3]，且巨噬細胞中鞘氨醇-1-磷酸受體2（sphingosine 1-phosphate receptor 2，S1PR2）的表達水平與膿毒癥的嚴重程度呈正相關[4]；在高糖培養條件下，S1PR2 可通過抑制 PI3K/AKT 激活抑制內皮細胞的功能[5]。但是 PI3K/AKT 通路下游主要作用靶點一直未有定論。在 AOC 模型中，PI3K/AKT 通路和 S1PR2 是否發生作用，目前鮮有報道。因此，本研究將探索在 AOC 模型大鼠中，外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中 PI3K/AKT 通路和 S1PR2 激活情況以及其對 AOC 大鼠全身炎癥反應的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
SD 大鼠（6 周齡，160～200 g，雄性）購于重慶醫科大學動物實驗中心 ［生產許可證號：SCXK（渝）2018-0003；使用許可證號：SYXK（渝）2018-0003］。大鼠飼養在獨立通氣籠盒動物房中，可自由進食和飲水。所有實驗操作均符合動物倫理學相關規定。
1.2 主要材料
脂多糖（L5293）購買于美國 Sigma 公司。PI3K 抑制劑 LY294002（產品目錄號：S1105）購買于美國 Selleck Chemicals 公司。大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）ELISA 試劑盒（產品目錄號分別為：EK0526、EK0412）、兔抗 β-actin 抗體（產品目錄號：BM0626）、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔 IgG（產品目錄號：BA1050）和 RIPA 裂解液（產品目錄號：AR0102）均購買于武漢博士德科技公司。大鼠 PBMCs 分離液試劑盒（產品目錄號：LDS1080）購買于天津市灝洋生物制品科技有限責任公司。BCA 蛋白濃度測定試劑盒（產品目錄號：KGP902）和超敏型 ECL 化學發光試劑盒（產品目錄號：KGP1127）均購于江蘇凱基生物技術公司。兔抗磷酸化 PI3K 抗體（產品目錄號：ab182651）和 AKT 抗體（產品目錄號：ab131443）均購買于美國 Abcam 公司。兔抗 S1PR2 抗體（產品目錄號：PA5-72868）購買于美國 Thermo Fisher 公司。
1.3 體外實驗
1.3.1 PBMCs 的分離與培養
SD 大鼠乙醚吸入麻醉后，經眼眶靜脈叢取外周血。取 1.5 mL 的抗凝血加入 1.5 mL 的樣品稀釋液，混勻后在稀釋液底部加入 3 mL 的分離液。PBMCs 分離參照試劑盒說明書操作。水平離心機 500×g 離心 30 min，分層后取第二層白細胞層加入 10 mL 清洗液繼續 250×g 離心 10 min，重復 2 遍。最后所得到的細胞沉渣可繼續用來培養。
1.3.2 LY294002 處理體外 PBMCs
一部分 PBMCs 體外培養 12 h 后，加入脂多糖（500 ng/mL）刺激 PBMCs 后繼續培養 0.5、1.0、2.0 h，然后收集細胞上清及提取細胞總蛋白，檢測 PI3K/AKT-S1PR2 激活情況和細胞因子 TNF-α 和 IL-6 的水平，以確定脂多糖對 PBMCs 的刺激效果。一部分 PBMCs 體外培養 12 h 后，按不同處理分為 4 組：空白對照組，PBMCs 中只加入 PBS；LY294002 單獨刺激組，用 LY294002（50 μmol/L）直接刺激 PBMCs；脂多糖單獨刺激組，加入脂多糖（500 ng/mL）直接刺激 PBMCs；LY294002 和脂多糖共同刺激組，加入 LY294002（50 μmol/L）處理 1 h 后再加入脂多糖（500 ng/mL）刺激 PBMCs 2 h。分別在 2 h 后收集各組細胞上清和總蛋白，檢測 PI3K/AKT-S1PR2 激活情況和細胞因子 TNF-α 和 IL-6 的水平。
1.3.3 蛋白印跡法檢測 PI3K、AKT 磷酸化和 S1PR2 蛋白表達
分離的 PBMCs（1×106個）用 100 μL的 RIPA 裂解液提取總蛋白，采用 BCA 法檢測蛋白濃度和定量；然后 10% 的 SDS-PAGE 垂直電泳（100 V，120 min）；接著進行轉膜（250 mA，110 min）；再利用 5% 脫脂奶粉室溫封閉 PVDF 膜 2 h；一抗 4 ℃孵育 16 h 以上；PVDF 膜洗滌后，加 HRP 標記的山羊抗兔 IgG 抗體室溫孵育 1.5 h 后利用 ECL 法進行顯影。對蛋白進行半定量分析，即目的條帶灰度值與相應 β-actin 條帶灰度值的比值，即為目的蛋白相對表達量。
1.3.4 采用 ELISA 法檢測 TNF-α 和 IL-6 水平
采用市售 ELISA 試劑盒測定，所有的操作均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。
1.4 體內實驗
1.4.1 動物分組與處理
取 60 只 SD 大鼠進行編號，通過隨機數生成器將 SD 大鼠隨機分為 4 組：① 假手術組，即大鼠吸入麻醉后，常規備皮、消毒、鋪巾、開腹，然后關腹；② 假手術+LY294002 處理組，即大鼠進行假手術后腹腔注射 LY294002 10 mg/（kg·d）處理；③ AOC 模型組，即大鼠常規開腹后，暴露膽總管下端并結扎后經腹腔注射脂多糖 20 mg/（kg·d）處理；④ AOC 模型+LY294002 處理組，即大鼠在暴露膽總管下端并結扎后經腹腔注射脂多糖 20 mg/（kg·d）的同時腹腔注射 LY29400210 mg/（kg·d）處理。LY294002 安全有效劑量參考 Cheng 等[6]的報道。
1.4.2 大鼠生存情況觀察
每組隨機取 10 只大鼠用于觀察每天生存情況，觀察時間為 7 d。
1.4.3 大鼠血清中炎性因子和肝功能檢測
每組隨機取 5 只大鼠檢測炎性因子和肝功能。各組大鼠飼養 2 d 后，收集大鼠血清以檢測肝功能和炎性因子，然后人道處死，同時收集肝組織以進行組織學觀察。炎性因子檢測采用 ELISA 法，方法參見 1.3.4；肝功能檢測采用美國貝克曼全自動生化分析儀檢測。
1.4.4 蛋白印跡法檢測 PI3K、AKT 磷酸化和 S1PR2 蛋白表達
方法參見 1.3.3。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 18.0 統計軟件對數據進行分析。計量資料采用以均數±標準差（
±s）表示。LY294002 及脂多糖處理組數據采用 2×2 的析因設計分析，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），2 組間比較采用獨立樣本 t 檢驗。檢驗水準 α=0.050。
2 結果
2.1 體外培養的 PBMCs 中 PI3K、AKT 磷酸化水平和 S1PR2 蛋白表達水平對脂多糖誘導的炎癥反應的影響
脂多糖刺激 PBMCs 0、0.5、1.0、2.0 h 時，隨著刺激時間的延長，PI3K 和 AKT 磷酸化水平和 S1PR2 蛋白表達水平逐漸增強或升高（P<0.050），見圖1a 及表1；上清液中 TNF-α 和 IL-6 的水平也明顯升高（P<0.050），見表1。
圖1
示脂多糖促進 PBMCs 和 LY294002 抑制脂多糖誘導的 PBMCs 中 PI3K/AKT-S1PR2 激活情況及對全身炎癥反應和肝組織的影響
a：脂多糖刺激 PBMCs 不同時相時 PI3K 和 AKT 磷酸化水平和 S1PR2 蛋白表達情況；b：不同措施處理后 PBMCs 中 PI3K 和 AKT 磷酸化水平和 S1PR2 蛋白表達情況（1 組：空白對照組；2 組：LY294002 單獨刺激組；3 組：脂多糖單獨刺激組；4 組：LY294002 和脂多糖共同刺激組）；c：各組大鼠生存情況（C：假手術組；LY：假手術+LY294002 處理組；AOC：AOC 模型組；LA：AOC 模型+LY294002 處理組）；d：各組大鼠 PBMCs 中蛋白表達情況（C：假手術組；LY：假手術+LY294002 處理組；AOC：AOC 模型組；LA：AOC 模型+LY294002 處理組）；e–h：假手術組（e）、假手術+LY294002 處理組（f）、AOC 模型組（g）及 AOC 模型+LY294002 處理組（h）的肝臟組織病理學改變（HE ×400）
表1
脂多糖刺激 PBMCs 不同時相時 PBMCs 中 PI3K/AKT-S1PR2 激活情況和細胞因子 TNF-α 和 IL-6 的水平（
）
LY294002 和脂多糖共同刺激組 PI3K 和 AKT 磷酸化水平及 S1PR2 蛋白表達水平較單獨用脂多糖刺激組明顯減弱或降低（P<0.050），見圖1b 及表2；上清中 TNF-α 和 IL-6 的水平明顯低于單獨用脂多糖刺激組（P<0.050），見表2。
表2
LY294002 抑制脂多糖誘導的 PBMCs 中 PI3K、AKT 的磷酸化水平和 S1PR2 蛋白表達水平以及脂多糖誘導的炎癥反應（
）
2.2 LY294002 對 AOC 模型大鼠全身炎癥反應、肝功能及 PI3K、AKT 磷酸化水平和 S1PR2 蛋白表達水平的影響
2.2.1 各組大鼠生存情況
AOC 模型組大鼠在第 5 天時生存率為 0，而假手術+LY294002 處理組大鼠在第 2～5 天時的生存率均高于 AOC 模型組大鼠，第 5 天時大鼠的生存率為 20%，假手術組和 AOC 模型+LY294002 處理組大鼠 7 d 內生存率為 100%，見圖1c。
2.2.2 各組大鼠 TNF-α 和 IL-6 的水平情況
AOC 模型+LY294002 處理組大鼠血清中 TNF-α 和 IL-6 的水平均明顯低于 AOC 模型組大鼠（P<0.050），但高于假手術組（P<0.050）及假手術+LY294002 處理組（P<0.050），見表3。
表3
LY294002 抑制脂多糖誘導的大鼠 PBMCs 中 PI3K、AKT 磷酸化水平和 S1PR2 蛋白表達水平及炎癥反應和肝功能變化（
）
2.2.3 AOC 大鼠 PBMCs 中 PI3K、AKT 磷酸化水平和 S1PR2 蛋白表達情況
結果見圖1d 及表3。從表 3 可見，AOC 模型+LY294002 處理組大鼠 PBMCs 中 PI3K、AKT 磷酸化水平和 S1PR2 蛋白表達水平均明顯低于 AOC 模型組（P<0.050），但高于假手術組（P<0.050）及假手術+LY294002 處理組（P<0.050）。
2.2.4 大鼠肝組織及肝功能情況
AOC 模型+LY294002 處理組大鼠第 2 天時肝組織的炎癥細胞聚集和肝細胞壞死明顯少于 AOC 模型組，但多于假手術組及假手術+LY294002 處理組（圖1e–1h）。AOC 模型+LY294002 處理組肝功能指標 ALT、AST 和 TBIL 水平均明顯低于 AOC 模型組（P<0.050），但高于假手術組（P<0.050）及假手術+LY294002 處理組（P<0.050），見表3。
3 討論
PI3K/AKT 通路在細胞周期、凋亡、增殖和分化過程中均發揮著不可忽視的作用，也是細胞信號傳導和放大的重要途徑之一，通過感受外界刺激或者環境變化誘導細胞作出適應性改變[7-9]。Chang 等[10]報道，溶血磷脂酰膽堿通過激活內皮細胞中 PI3K/AKT 通路，促進 IL-8 等促炎因子分泌；抑制 PI3K 磷酸化后，可降低 IL-8 水平并緩解溶血磷脂酰膽堿誘導的細胞毒性和凋亡。Zheng 等[11]報道，骨關節炎小鼠模型中，軟骨細胞中 PI3K/AKT 通路被激活，促進 IL-1β、TNF-α 等促炎因子分泌；抑制 PI3K/AKT 活性后，通過抑制核轉錄因子 κB 激活，可緩解關節軟骨破壞和滑膜炎。Liu 等[12]報道，外源性硫化氫可磷酸化激活 PI3K/AKT 通路，降低膿毒癥小鼠血清心肌酶水平以及炎癥因子的分泌水平。以上這些研究結果提示，抑制 PI3K/AKT 活性可降低炎癥相關疾病中免疫細胞分泌炎癥因子的能力。此外，Shearn 等[13]發現，原發性膽管炎合并炎性腸炎患者的肝組織中 AKT 的磷酸化水平較健康人顯著升高；Wang 等[14]報道抑制 AKT 等磷酸化后，可減輕膽總管結扎模型小鼠中肝損傷。這些研究結果提示，PI3K/AKT 的活性還與膽汁淤積性膽管炎誘導的肝損傷密切相關。在本研究中發現，PBMCs 中 PI3K/AKT 被磷酸化激活且促進炎癥因子 TNF-α 和 IL-6 的分泌，利用 PI3K 抑制劑 LY294002 抑制 PI3K/AKT 活性后炎癥因子 TNF-α 和 IL-6 分泌下降，同時可延長大鼠的生存時間，抑制肝臟炎癥和壞死。結果提示，PI3K/AKT 通路在免疫細胞介導的炎癥反應中可能發揮著關鍵的調節作用，其通過哪種途徑參與炎癥因子分泌，尚需深入研究。
S1PR2 是單核巨噬細胞感受炎癥刺激的重要細胞信使，也是參與膽汁酸代謝重要的細胞表面受體之一[15-17]。巨噬細胞中 S1PR2 的表達程度與膿毒血癥的嚴重程度呈正相關[2]，且有文獻[18]報道 S1PR2 通過激活 PI3K/AKT 通路誘導核轉錄因子 κB 激活、促進 TNF-α 等炎癥因子分泌。Cui 等[19]報道，S1PR2 通過抑制一氧化氮合酶表達，從而抑制機體過敏性休克反應；而 Hsu 等[20]發現，抑制 S1PR2 后，可通過抑制 PI3K、核轉錄因子 κB 和絲裂原活化蛋白激酶的活性，降低放線共生放線桿菌誘導小鼠骨髓細胞分泌 TNF-α、IL-6 等炎癥因子水平；Song 等[21]發現抑制 S1PR2 后，降低了巨噬細胞的吞噬作用，并提高了大腸桿菌誘導的膿毒血癥小鼠的存活率。這些研究結果提示，PI3K/AKT 通路與 S1PR2 關系密切，均與細菌感染、膿毒血癥等急性炎癥疾病密切相關。此外，S1PR2 在肝臟中高表達，結合膽汁酸可提高肝細胞中 S1PR2 的表達[22]；且選擇性拮抗 S1PR2 可降低膽總管結扎后小鼠門靜脈的壓力[23]。可見，S1PR2 參與膽總管閉塞和膽汁淤積等疾病的病理生理過程。而 Yang 等[24]報道 S1PR2/3 通過激活 toxin/PI3K/Rac1 通路，促進膽總管結扎后誘導的肝損傷和炎癥因子分泌，并加重小鼠的全身炎癥反應；Wang 等[14]報道利用 S1PR2/3 抑制劑 JTE-013 可通過抑制 AKT 和細胞外信號調節激酶 1/2 的活性，可減輕膽總管結扎后膽汁淤積誘導的肝損傷；Xiao 等[25]報道長鏈非編碼 RNA H19 通過抑制膽管結扎模型小鼠中 S1PR2 和鞘氨醇激酶 2 的表達，降低膽管結扎誘導的膽管細胞增殖與肝纖維化。在本研究中，S1PR2 在體外 AOC 模型的 PBMCs 均高表達，且與 PI3K/AKT 通路激活密切相關；抑制 PBMCs 的 PI3K 和 AKT 磷酸化后，S1PR2 表達下降，同時降低細胞和大鼠血清中炎癥因子的水平，從而延長大鼠的生存時間和降低肝臟的炎癥壞死程度。結合文獻報道和本研究結果提示，抑制 PBMCs 中 PI3K/AKT 通路的活化，可通過降低 S1PR2 的表達，抑制 AOC 誘導的大鼠全身炎癥反應。
總之，在 AOC 大鼠模型中，PBMCs 的 PI3K/AKT 通路被激活，可促進 S1PR2 表達，從而誘導炎癥因子的分泌和誘導大鼠全身炎癥反。利用 PI3K 抑制劑 LY294002 抑制 PI3K/AKT 磷酸化后，可下調 S1PR2 的表達，抑制大鼠的全身炎癥反應，從而延長大鼠的生存時間和降低肝臟的炎癥壞死程度。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：余伍勇負責具體動物實驗的實施、數據收集和整理等工作；張文鋒負責具體的實驗設計、細胞實驗的實施和論文撰寫工作；程瑤協助數據整理、收集以及統計方法的指導；龔建平教授提出實驗的研究思路并在論文撰寫、修改過程中提出建議。
倫理聲明：本研究通過了重慶醫科大學倫理委員會審批（倫理編號：審第（2018）-103 號）。
急性梗阻性膽管炎（acute obstructive cholangitis，AOC）是肝膽外科常見疾病，病因主要是膽總管結石、新生物、膽總管狹窄等造成膽汁引流不暢，導致細菌及細菌產物脂多糖等反流入血，從而誘發全身炎癥反應[1]。磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/AKT 通路參與單核巨噬細胞誘導的炎癥反應[1-3]，且巨噬細胞中鞘氨醇-1-磷酸受體2（sphingosine 1-phosphate receptor 2，S1PR2）的表達水平與膿毒癥的嚴重程度呈正相關[4]；在高糖培養條件下，S1PR2 可通過抑制 PI3K/AKT 激活抑制內皮細胞的功能[5]。但是 PI3K/AKT 通路下游主要作用靶點一直未有定論。在 AOC 模型中，PI3K/AKT 通路和 S1PR2 是否發生作用，目前鮮有報道。因此，本研究將探索在 AOC 模型大鼠中，外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中 PI3K/AKT 通路和 S1PR2 激活情況以及其對 AOC 大鼠全身炎癥反應的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
SD 大鼠（6 周齡，160～200 g，雄性）購于重慶醫科大學動物實驗中心 ［生產許可證號：SCXK（渝）2018-0003；使用許可證號：SYXK（渝）2018-0003］。大鼠飼養在獨立通氣籠盒動物房中，可自由進食和飲水。所有實驗操作均符合動物倫理學相關規定。
1.2 主要材料
脂多糖（L5293）購買于美國 Sigma 公司。PI3K 抑制劑 LY294002（產品目錄號：S1105）購買于美國 Selleck Chemicals 公司。大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）ELISA 試劑盒（產品目錄號分別為：EK0526、EK0412）、兔抗 β-actin 抗體（產品目錄號：BM0626）、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔 IgG（產品目錄號：BA1050）和 RIPA 裂解液（產品目錄號：AR0102）均購買于武漢博士德科技公司。大鼠 PBMCs 分離液試劑盒（產品目錄號：LDS1080）購買于天津市灝洋生物制品科技有限責任公司。BCA 蛋白濃度測定試劑盒（產品目錄號：KGP902）和超敏型 ECL 化學發光試劑盒（產品目錄號：KGP1127）均購于江蘇凱基生物技術公司。兔抗磷酸化 PI3K 抗體（產品目錄號：ab182651）和 AKT 抗體（產品目錄號：ab131443）均購買于美國 Abcam 公司。兔抗 S1PR2 抗體（產品目錄號：PA5-72868）購買于美國 Thermo Fisher 公司。
1.3 體外實驗
1.3.1 PBMCs 的分離與培養
SD 大鼠乙醚吸入麻醉后，經眼眶靜脈叢取外周血。取 1.5 mL 的抗凝血加入 1.5 mL 的樣品稀釋液，混勻后在稀釋液底部加入 3 mL 的分離液。PBMCs 分離參照試劑盒說明書操作。水平離心機 500×g 離心 30 min，分層后取第二層白細胞層加入 10 mL 清洗液繼續 250×g 離心 10 min，重復 2 遍。最后所得到的細胞沉渣可繼續用來培養。
1.3.2 LY294002 處理體外 PBMCs
一部分 PBMCs 體外培養 12 h 后，加入脂多糖（500 ng/mL）刺激 PBMCs 后繼續培養 0.5、1.0、2.0 h，然后收集細胞上清及提取細胞總蛋白，檢測 PI3K/AKT-S1PR2 激活情況和細胞因子 TNF-α 和 IL-6 的水平，以確定脂多糖對 PBMCs 的刺激效果。一部分 PBMCs 體外培養 12 h 后，按不同處理分為 4 組：空白對照組，PBMCs 中只加入 PBS；LY294002 單獨刺激組，用 LY294002（50 μmol/L）直接刺激 PBMCs；脂多糖單獨刺激組，加入脂多糖（500 ng/mL）直接刺激 PBMCs；LY294002 和脂多糖共同刺激組，加入 LY294002（50 μmol/L）處理 1 h 后再加入脂多糖（500 ng/mL）刺激 PBMCs 2 h。分別在 2 h 后收集各組細胞上清和總蛋白，檢測 PI3K/AKT-S1PR2 激活情況和細胞因子 TNF-α 和 IL-6 的水平。
1.3.3 蛋白印跡法檢測 PI3K、AKT 磷酸化和 S1PR2 蛋白表達
分離的 PBMCs（1×106個）用 100 μL的 RIPA 裂解液提取總蛋白，采用 BCA 法檢測蛋白濃度和定量；然后 10% 的 SDS-PAGE 垂直電泳（100 V，120 min）；接著進行轉膜（250 mA，110 min）；再利用 5% 脫脂奶粉室溫封閉 PVDF 膜 2 h；一抗 4 ℃孵育 16 h 以上；PVDF 膜洗滌后，加 HRP 標記的山羊抗兔 IgG 抗體室溫孵育 1.5 h 后利用 ECL 法進行顯影。對蛋白進行半定量分析，即目的條帶灰度值與相應 β-actin 條帶灰度值的比值，即為目的蛋白相對表達量。
1.3.4 采用 ELISA 法檢測 TNF-α 和 IL-6 水平
采用市售 ELISA 試劑盒測定，所有的操作均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。
1.4 體內實驗
1.4.1 動物分組與處理
取 60 只 SD 大鼠進行編號，通過隨機數生成器將 SD 大鼠隨機分為 4 組：① 假手術組，即大鼠吸入麻醉后，常規備皮、消毒、鋪巾、開腹，然后關腹；② 假手術+LY294002 處理組，即大鼠進行假手術后腹腔注射 LY294002 10 mg/（kg·d）處理；③ AOC 模型組，即大鼠常規開腹后，暴露膽總管下端并結扎后經腹腔注射脂多糖 20 mg/（kg·d）處理；④ AOC 模型+LY294002 處理組，即大鼠在暴露膽總管下端并結扎后經腹腔注射脂多糖 20 mg/（kg·d）的同時腹腔注射 LY29400210 mg/（kg·d）處理。LY294002 安全有效劑量參考 Cheng 等[6]的報道。
1.4.2 大鼠生存情況觀察
每組隨機取 10 只大鼠用于觀察每天生存情況，觀察時間為 7 d。
1.4.3 大鼠血清中炎性因子和肝功能檢測
每組隨機取 5 只大鼠檢測炎性因子和肝功能。各組大鼠飼養 2 d 后，收集大鼠血清以檢測肝功能和炎性因子，然后人道處死，同時收集肝組織以進行組織學觀察。炎性因子檢測采用 ELISA 法，方法參見 1.3.4；肝功能檢測采用美國貝克曼全自動生化分析儀檢測。
1.4.4 蛋白印跡法檢測 PI3K、AKT 磷酸化和 S1PR2 蛋白表達
方法參見 1.3.3。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 18.0 統計軟件對數據進行分析。計量資料采用以均數±標準差（±s）表示。LY294002 及脂多糖處理組數據采用 2×2 的析因設計分析，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），2 組間比較采用獨立樣本 t 檢驗。檢驗水準 α=0.050。
2 結果
2.1 體外培養的 PBMCs 中 PI3K、AKT 磷酸化水平和 S1PR2 蛋白表達水平對脂多糖誘導的炎癥反應的影響
脂多糖刺激 PBMCs 0、0.5、1.0、2.0 h 時，隨著刺激時間的延長，PI3K 和 AKT 磷酸化水平和 S1PR2 蛋白表達水平逐漸增強或升高（P<0.050），見圖1a 及表1；上清液中 TNF-α 和 IL-6 的水平也明顯升高（P<0.050），見表1。
圖1
示脂多糖促進 PBMCs 和 LY294002 抑制脂多糖誘導的 PBMCs 中 PI3K/AKT-S1PR2 激活情況及對全身炎癥反應和肝組織的影響
a：脂多糖刺激 PBMCs 不同時相時 PI3K 和 AKT 磷酸化水平和 S1PR2 蛋白表達情況；b：不同措施處理后 PBMCs 中 PI3K 和 AKT 磷酸化水平和 S1PR2 蛋白表達情況（1 組：空白對照組；2 組：LY294002 單獨刺激組；3 組：脂多糖單獨刺激組；4 組：LY294002 和脂多糖共同刺激組）；c：各組大鼠生存情況（C：假手術組；LY：假手術+LY294002 處理組；AOC：AOC 模型組；LA：AOC 模型+LY294002 處理組）；d：各組大鼠 PBMCs 中蛋白表達情況（C：假手術組；LY：假手術+LY294002 處理組；AOC：AOC 模型組；LA：AOC 模型+LY294002 處理組）；e–h：假手術組（e）、假手術+LY294002 處理組（f）、AOC 模型組（g）及 AOC 模型+LY294002 處理組（h）的肝臟組織病理學改變（HE ×400）
表1
脂多糖刺激 PBMCs 不同時相時 PBMCs 中 PI3K/AKT-S1PR2 激活情況和細胞因子 TNF-α 和 IL-6 的水平（）
LY294002 和脂多糖共同刺激組 PI3K 和 AKT 磷酸化水平及 S1PR2 蛋白表達水平較單獨用脂多糖刺激組明顯減弱或降低（P<0.050），見圖1b 及表2；上清中 TNF-α 和 IL-6 的水平明顯低于單獨用脂多糖刺激組（P<0.050），見表2。
表2
LY294002 抑制脂多糖誘導的 PBMCs 中 PI3K、AKT 的磷酸化水平和 S1PR2 蛋白表達水平以及脂多糖誘導的炎癥反應（）
2.2 LY294002 對 AOC 模型大鼠全身炎癥反應、肝功能及 PI3K、AKT 磷酸化水平和 S1PR2 蛋白表達水平的影響
2.2.1 各組大鼠生存情況
AOC 模型組大鼠在第 5 天時生存率為 0，而假手術+LY294002 處理組大鼠在第 2～5 天時的生存率均高于 AOC 模型組大鼠，第 5 天時大鼠的生存率為 20%，假手術組和 AOC 模型+LY294002 處理組大鼠 7 d 內生存率為 100%，見圖1c。
2.2.2 各組大鼠 TNF-α 和 IL-6 的水平情況
AOC 模型+LY294002 處理組大鼠血清中 TNF-α 和 IL-6 的水平均明顯低于 AOC 模型組大鼠（P<0.050），但高于假手術組（P<0.050）及假手術+LY294002 處理組（P<0.050），見表3。
表3
LY294002 抑制脂多糖誘導的大鼠 PBMCs 中 PI3K、AKT 磷酸化水平和 S1PR2 蛋白表達水平及炎癥反應和肝功能變化（）
2.2.3 AOC 大鼠 PBMCs 中 PI3K、AKT 磷酸化水平和 S1PR2 蛋白表達情況
結果見圖1d 及表3。從表 3 可見，AOC 模型+LY294002 處理組大鼠 PBMCs 中 PI3K、AKT 磷酸化水平和 S1PR2 蛋白表達水平均明顯低于 AOC 模型組（P<0.050），但高于假手術組（P<0.050）及假手術+LY294002 處理組（P<0.050）。
2.2.4 大鼠肝組織及肝功能情況
AOC 模型+LY294002 處理組大鼠第 2 天時肝組織的炎癥細胞聚集和肝細胞壞死明顯少于 AOC 模型組，但多于假手術組及假手術+LY294002 處理組（圖1e–1h）。AOC 模型+LY294002 處理組肝功能指標 ALT、AST 和 TBIL 水平均明顯低于 AOC 模型組（P<0.050），但高于假手術組（P<0.050）及假手術+LY294002 處理組（P<0.050），見表3。
3 討論
PI3K/AKT 通路在細胞周期、凋亡、增殖和分化過程中均發揮著不可忽視的作用，也是細胞信號傳導和放大的重要途徑之一，通過感受外界刺激或者環境變化誘導細胞作出適應性改變[7-9]。Chang 等[10]報道，溶血磷脂酰膽堿通過激活內皮細胞中 PI3K/AKT 通路，促進 IL-8 等促炎因子分泌；抑制 PI3K 磷酸化后，可降低 IL-8 水平并緩解溶血磷脂酰膽堿誘導的細胞毒性和凋亡。Zheng 等[11]報道，骨關節炎小鼠模型中，軟骨細胞中 PI3K/AKT 通路被激活，促進 IL-1β、TNF-α 等促炎因子分泌；抑制 PI3K/AKT 活性后，通過抑制核轉錄因子 κB 激活，可緩解關節軟骨破壞和滑膜炎。Liu 等[12]報道，外源性硫化氫可磷酸化激活 PI3K/AKT 通路，降低膿毒癥小鼠血清心肌酶水平以及炎癥因子的分泌水平。以上這些研究結果提示，抑制 PI3K/AKT 活性可降低炎癥相關疾病中免疫細胞分泌炎癥因子的能力。此外，Shearn 等[13]發現，原發性膽管炎合并炎性腸炎患者的肝組織中 AKT 的磷酸化水平較健康人顯著升高；Wang 等[14]報道抑制 AKT 等磷酸化后，可減輕膽總管結扎模型小鼠中肝損傷。這些研究結果提示，PI3K/AKT 的活性還與膽汁淤積性膽管炎誘導的肝損傷密切相關。在本研究中發現，PBMCs 中 PI3K/AKT 被磷酸化激活且促進炎癥因子 TNF-α 和 IL-6 的分泌，利用 PI3K 抑制劑 LY294002 抑制 PI3K/AKT 活性后炎癥因子 TNF-α 和 IL-6 分泌下降，同時可延長大鼠的生存時間，抑制肝臟炎癥和壞死。結果提示，PI3K/AKT 通路在免疫細胞介導的炎癥反應中可能發揮著關鍵的調節作用，其通過哪種途徑參與炎癥因子分泌，尚需深入研究。
S1PR2 是單核巨噬細胞感受炎癥刺激的重要細胞信使，也是參與膽汁酸代謝重要的細胞表面受體之一[15-17]。巨噬細胞中 S1PR2 的表達程度與膿毒血癥的嚴重程度呈正相關[2]，且有文獻[18]報道 S1PR2 通過激活 PI3K/AKT 通路誘導核轉錄因子 κB 激活、促進 TNF-α 等炎癥因子分泌。Cui 等[19]報道，S1PR2 通過抑制一氧化氮合酶表達，從而抑制機體過敏性休克反應；而 Hsu 等[20]發現，抑制 S1PR2 后，可通過抑制 PI3K、核轉錄因子 κB 和絲裂原活化蛋白激酶的活性，降低放線共生放線桿菌誘導小鼠骨髓細胞分泌 TNF-α、IL-6 等炎癥因子水平；Song 等[21]發現抑制 S1PR2 后，降低了巨噬細胞的吞噬作用，并提高了大腸桿菌誘導的膿毒血癥小鼠的存活率。這些研究結果提示，PI3K/AKT 通路與 S1PR2 關系密切，均與細菌感染、膿毒血癥等急性炎癥疾病密切相關。此外，S1PR2 在肝臟中高表達，結合膽汁酸可提高肝細胞中 S1PR2 的表達[22]；且選擇性拮抗 S1PR2 可降低膽總管結扎后小鼠門靜脈的壓力[23]。可見，S1PR2 參與膽總管閉塞和膽汁淤積等疾病的病理生理過程。而 Yang 等[24]報道 S1PR2/3 通過激活 toxin/PI3K/Rac1 通路，促進膽總管結扎后誘導的肝損傷和炎癥因子分泌，并加重小鼠的全身炎癥反應；Wang 等[14]報道利用 S1PR2/3 抑制劑 JTE-013 可通過抑制 AKT 和細胞外信號調節激酶 1/2 的活性，可減輕膽總管結扎后膽汁淤積誘導的肝損傷；Xiao 等[25]報道長鏈非編碼 RNA H19 通過抑制膽管結扎模型小鼠中 S1PR2 和鞘氨醇激酶 2 的表達，降低膽管結扎誘導的膽管細胞增殖與肝纖維化。在本研究中，S1PR2 在體外 AOC 模型的 PBMCs 均高表達，且與 PI3K/AKT 通路激活密切相關；抑制 PBMCs 的 PI3K 和 AKT 磷酸化后，S1PR2 表達下降，同時降低細胞和大鼠血清中炎癥因子的水平，從而延長大鼠的生存時間和降低肝臟的炎癥壞死程度。結合文獻報道和本研究結果提示，抑制 PBMCs 中 PI3K/AKT 通路的活化，可通過降低 S1PR2 的表達，抑制 AOC 誘導的大鼠全身炎癥反應。
總之，在 AOC 大鼠模型中，PBMCs 的 PI3K/AKT 通路被激活，可促進 S1PR2 表達，從而誘導炎癥因子的分泌和誘導大鼠全身炎癥反。利用 PI3K 抑制劑 LY294002 抑制 PI3K/AKT 磷酸化后，可下調 S1PR2 的表達，抑制大鼠的全身炎癥反應，從而延長大鼠的生存時間和降低肝臟的炎癥壞死程度。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：余伍勇負責具體動物實驗的實施、數據收集和整理等工作；張文鋒負責具體的實驗設計、細胞實驗的實施和論文撰寫工作；程瑤協助數據整理、收集以及統計方法的指導；龔建平教授提出實驗的研究思路并在論文撰寫、修改過程中提出建議。
倫理聲明：本研究通過了重慶醫科大學倫理委員會審批（倫理編號：審第（2018）-103 號）。
