引用本文： 馮寧, 朱瑞萍, 程瑤, 林峰, 薛帆, 崔佑剛, 張旭, 馬洋, 劉文志. Lgr5 和 Ki-67 蛋白在胃癌組織中的表達研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(11): 1293-1297. doi: 10.7507/1007-9424.201905077 復制
胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其預后差，患者早期檢出率低、出現癥狀后多為中晚期，治療效果較差。惡性侵襲和轉移仍是目前胃癌預后不良的主要原因，但傳統的以手術為主輔以化療的治療方式仍不能明顯改善患者的預后，所以針對胃癌細胞的惡性侵襲及轉移相關機制的探索仍為研究的熱點。既往的研究中，Lgr5（富含亮氨酸重復序列的 G 蛋白偶聯受體 5）被認為是腸癌的腫瘤干細胞標志物，Ki-67 被證實其與細胞增殖活性密切相關。幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，HP）感染已被證實與胃潰瘍、胃癌的發生有密切關系，但其是否與其他蛋白及基因突變等有協同作用目前尚未定論。因此，本研究檢測了 Lgr5 和 Ki-67 蛋白在胃癌組織中的表達情況，并評估 Lgr5 及 Ki-67 表達與胃癌細胞生物學活性之間的關系，為胃癌的侵襲進展調控機制提供新的研究靶點，亦為胃癌臨床綜合治療及預后評估提供新的思路和手段。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
收集大連大學附屬中山醫院胃腸外科 2011～2013 年期間手術切除的胃腺癌標本 69 例，同時收集其中相應標本的正常胃黏膜組織（距離癌組織 5 cm 的組織）30 例作為對照。所有患者均為首次手術，術前未進行放、化療等治療，組織均經病理檢查確認。69 例胃癌患者中男 49 例，女 20 例；年齡 36～90 歲、（66±10）歲。分化程度：高分化 3 例，中分化 20 例，低分化 30 例，未分化 16 例。TNM 分期按照第 8 版胃癌 TNM 分期。HP 陽性 41 例，陰性 28 例。
1.2 免疫組織化學染色方法檢測 Lgr5 及 Ki-67 蛋白在組織中的表達
1.2.1 主要試劑
一抗抗 Lgr5 抗體（產品編號為 TA502948）和抗 Ki-67 抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司、鼠抗人單克隆抗體、0.1 mL；二抗即用型 SABC-POD（小鼠/兔 IgG）試劑盒和 DAB 顯色劑均購自武漢博士德生物技術有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、實驗耗材等均來自大連大學附屬中山醫院中心實驗室。
1.2.2 方法
① 采用標準的 SABC 法檢測 Lgr5 和 Ki-67 蛋白表達情況。組織標本常規經 4% 甲醛溶液固定，行常規石蠟包埋，連續切片 4 μm。嚴格按照說明書進行操作：脫蠟、脫水、滅活、抗原修復、封閉工作液、加一抗、二抗、DAB 顯色、封片等。陽性對照用已知的陽性組織，用 PBS 代替一抗作為陰性對照。② 采用快速尿素酶法檢測 HP 的感染情況。
1.2.3 結果判定
① Lgr5 蛋白表達以細胞漿和（或）細胞膜出現黃色和（或）棕黃色顆粒判斷為陽性表達，根據著色程度和陽性細胞百分比進行半定量評分，按細胞著色程度評分，無色為 0 分、淺黃色為 1 分、黃色為 2 分、棕黃色為 3 分，按陽性細胞數所占的百分比計分：陽性細胞數<5%為 0 分，5%～25%為 1 分、25%～50%為 2 分、50%～75% 為 3 分，>75%為 4 分進行判斷賦值。通過著色程度評分與陽性細胞百分比分值進行相乘為最終表達計分，為 0～12 分，其中 0 分為不表達（–）、1～4 分為弱陽性表達（+）、5～8 分為中等陽性表達（++）、9～12 分為強陽性表達（+++）。陽性表達包括（+）～（+++）。② Ki-67 蛋白表達以細胞核染成黃色和（或）棕黃色為陽性表達，按照陽性細胞數<10%為不表達（–）、10%～50%為弱陽性表達（+）、50%～75%為中等陽性表達（++），>75%為強陽性表達（+++）分組。陽性表達包括（+）～（+++）。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 25 軟件對數據進行統計分析。計數資料及四格表資料比較采用卡方（χ2）檢驗。兩等級變量相關性分析采用 Spearman 等級相關進行分析。檢驗水準 α=0.050。
2 結果
2.1 Lgr5 及 Ki-67 蛋白在組織中的表達
Lgr5 蛋白表達在胃癌組織中主要定位于細胞質中（有部分表達定位于細胞膜中）呈黃色或棕黃色彌漫性表達（圖 1a），其在正常胃黏膜組織中也有部分表達（圖 1b）；Ki-67 蛋白表達在胃癌組織中主要定位于細胞核中呈棕黃色及棕褐色表達（圖 1c），其在正常胃黏膜組織中也有部分表達（圖 1d）。Lgr5 和 Ki-67 蛋白在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達陽性情況見表 1，二者在胃癌組織中均較其在正常胃黏膜組織中高（Lgr5 蛋白：87.0%（60/69）比 16.7%（5/30），χ2=45.81，P<0.001；Ki-67 蛋白：79.7%（55/69）比 36.7%（11/30），χ2=17.43，P<0.001）。
圖1
示 Lgr5 及 Ki-67 蛋白在胃癌組織及正常胃黏膜組織中的表達情況（SABC 法 ×400）
a：Lgr5 蛋白在胃癌組織中的表達；b：Lgr5 蛋白在正常胃黏膜組織中的表達；c：Ki-67 蛋白在胃癌組織中的表達；d：Ki-67 蛋白在正常胃黏膜組織中的表達
表1
Lgr5 及 Ki-67 蛋白在不同組織中的表達結果（例）
2.2 Lgr5 及 Ki-67 蛋白在胃癌組織中的表達與胃癌患者的臨床病理特征的關系
結果見表 2。從表 2 可見，Lgr5 及 Ki-67 蛋白在胃癌組織中的表達均與胃癌的分化程度、淋巴結轉移及 HP 感染有關，即在低-未分化、N1～N3 期及 HP 感染陽性胃癌組織中的蛋白表達陽性率明顯高于高-中分化、N0 期及 HP 感染陰性患者（P<0.050），Lgr5 蛋白表達還與胃癌浸潤深度有關，而 Ki-67 蛋白表達與此無關。Lgr5 及 Ki-67 蛋白表達與胃癌患者的性別和遠處轉移均無關（P>0.050）。
表2
胃癌組織中 Lgr5 和 Ki-67 蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的關系（例）
2.3 胃癌組織中 Lgr5 蛋白表達與 Ki-67 蛋白表達的關系
經 Spearman 相關性分析顯示，Lgr5 蛋白表達與 Ki-67 蛋白表達呈明顯的正相關（rs=0.340，P=0.004），結果見表 3。
表3
胃癌組織中 Lgr5 蛋白的表達與 Ki-67 蛋白表達的相關性分析（例）
3 討論
目前胃癌在我國早期發現率低、病情進展快、預后差，胃癌術后惡性侵襲和轉移仍是其預后較差的主要原因。因此，針對胃癌組織的侵襲、轉移、復發等機制的探索仍為目前研究的熱點。
隨著研究的不斷深入，有研究者[1]認為癌干細胞也稱腫瘤干細胞在腫瘤發生、進展過程中發揮著作用。腫瘤干細胞是一種具有自我更新、抗化療藥物及抵抗放射線特性的細胞，能夠導致術后腫瘤的復發、化療后腫瘤進展以及最終死亡。因此，目前研究的重點是將殺死已增殖成熟的腫瘤細胞轉移至通過其特定標志物檢測及特異性靶向治療消滅腫瘤干細胞。本研究亦著眼于探索胃癌可能的腫瘤干細胞標志物及可能用于胃癌術后風險評估的標志物。
3.1 Lgr5 蛋白的表達及其與胃癌臨床病理特征的關系分析
Lgr5 蛋白是富含亮氨酸重復序列 G 蛋白偶聯受體 5，它是 G 蛋白偶聯受體家族的成員之一。Lgr5 蛋白廣泛分布于人體各種組織中，在大腦、毛囊、乳腺、胃腸道、生殖器官等均有表達[1-4]。Lgr5 結構特點為其多肽鏈的細胞外區有 17 個富含亮氨酸的重復序列，N 端和 C 端富含半胱氨酸序列以及高度保守的 7 次 α 螺旋跨膜區。目前已經證實 Lgr5 蛋白廣泛表達于小腸和結腸黏膜的腺隱窩基底部的柱狀細胞中，它可作為結直腸癌的干細胞標志物[1-8]。在結直腸癌的研究[8-16]中證實了 Lgr5 作為 Wnt 信號通路下游的靶向基因，能夠增強 Wnt/β-catenin 信號通路，而作為結腸癌干細胞標志物的 Lgr5 蛋白在結腸癌中大量表達并與結腸癌的發生、轉移、復發以及與患者的預后等密切相關。在本研究中發現，Lgr5 蛋白在胃癌組織中的表達陽性率明顯高于其在相應的正常胃黏膜組織（P<0.050），且發現 Lgr5 蛋白表達陽性率在 T3+T4 期、N1～N3 期及低-未分化胃癌組織中明顯高于 T1+T2 期、N0 期及高-中分化患者（P<0.050），結果提示，Lgr5 蛋白表達可能參與了腫瘤組織的局部浸潤、淋巴結轉移過程并與腫瘤惡生程度有關，但其實際作用機制尚需要進一步探索研究。在本研究中未發現 Lgr5 蛋白表達與胃癌 M 分期有關（P=0.486），分析其原因可能與納入樣本量有關，M1 期病例數僅有 5 例，后期還需增大 M1 期患者的樣本量以明確 Lgr5 蛋白的表達與腫瘤遠處轉移的相關性。本實驗并未發現 Lgr5 蛋白表達與 HP 感染之間的明確相關性（P=5.939）。
3.2 Ki-67 蛋白的表達及其與胃癌臨床病理特征的關系
“正常胃黏膜—腺瘤（息肉）—腺癌”的發展模式是公認的胃癌發生學說，該學說強調在不同的發展階段有不同的癌基因或抑癌基因等因素參與。作為一種細胞周期相關的核抗原 Ki-67 蛋白是目前臨床應用最廣泛的細胞增殖活性標志物，可用來判斷腫瘤細胞增殖活性、腫瘤復發、轉移等諸多生物學特性以及判斷患者預后，其具有非常重要的意義[17-20]。最初 Ki-67 蛋白由 Gerdes 等[17]于 1983 年首先發現，它是一種大分子量的蛋白質，其富含多個 PEST 序列及磷酸化位點。Ki-67 蛋白半衰期短，在細胞中能夠快速降解，已證實其與細胞增殖活性密切相關，故其已經被廣泛地用于判斷乳腺癌、肺癌、前列腺癌等的增生活性，其在胃腸腫瘤中也被廣泛應用[18-25]。本研究中發現，Ki-67 蛋白陽性表達定位在細胞核，呈棕黃色及棕褐色，這與文獻[17-23]報道是一致的。在本研究中觀察到，在正常胃黏膜中 Ki-67 蛋白有少量表達，而在胃癌中 Ki-67 蛋白表達明顯增強，且二者之間的表達陽性率比較差異有統計學意義，結果提示，在“正常胃黏膜—腺瘤（息肉）—腺癌”的轉變過程中，細胞增殖活性逐漸增強。本研究還發現，胃癌組織中 Ki-67 蛋白表達與腫瘤淋巴結轉移及腫瘤分化程度有關，即有淋巴結轉移者及分化較低者 Ki-67 表達陽性率越高，結果提示 Ki-67 在胃癌的發展及淋巴結轉移過程中可能具有重要的意義，Ki-67 蛋白一定程度上也可提示患者的預后情況。本研究還發現 Ki-67 蛋白表達與 HP 感染之間存在關聯（P=0.044），提示 HP 感染在參與胃癌發生及發展過程中可能影響了 Ki-67 蛋白的表達，其具體機制還需進一步的研究揭示。
3.3 Lgr5 蛋白與 Ki-67 蛋白的關聯
在本研究中發現 Lgr5 和 Ki-67 蛋白在胃癌組織中表達陽性率均較高，二者在腫瘤發生及發展過程中是否起協同作用呢？本研究結果發現，二者在胃癌中的表達陽性率呈明顯的正相關關系（rs=0.340，P=0.004），結果提示，二者可能在胃癌的發生及發展過程中起協同作用。
本研究結果提示，作為胃癌干細胞表面標志物的 Lgr5 蛋白以及反映細胞增殖活性的標志物Ki-67，二者均在胃癌組織中的表達陽性率較高且與腫瘤的分化程度和淋巴結轉移有密切的關系，二者可能共同參與了胃癌的發生、發展及轉移過程，并且可能與 HP 感染具有協同作用，可能為胃癌的治療提供新的途徑及思路，但仍需大樣本的隨機對照研究進一步證實并發掘其在胃癌中的相互關系和作用機制。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：馮寧負責研究的具體實施與數據分析、論文撰寫；劉文志負責實驗醞釀和設計；朱瑞萍、程瑤負責標本切片、免疫組化染色；林峰、薛帆、張旭、崔佑剛、馬洋負責病本收集、病例資料隨訪。
倫理聲明：本研究通過了大連大學附屬中山醫院倫理委員會審批。
胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其預后差，患者早期檢出率低、出現癥狀后多為中晚期，治療效果較差。惡性侵襲和轉移仍是目前胃癌預后不良的主要原因，但傳統的以手術為主輔以化療的治療方式仍不能明顯改善患者的預后，所以針對胃癌細胞的惡性侵襲及轉移相關機制的探索仍為研究的熱點。既往的研究中，Lgr5（富含亮氨酸重復序列的 G 蛋白偶聯受體 5）被認為是腸癌的腫瘤干細胞標志物，Ki-67 被證實其與細胞增殖活性密切相關。幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，HP）感染已被證實與胃潰瘍、胃癌的發生有密切關系，但其是否與其他蛋白及基因突變等有協同作用目前尚未定論。因此，本研究檢測了 Lgr5 和 Ki-67 蛋白在胃癌組織中的表達情況，并評估 Lgr5 及 Ki-67 表達與胃癌細胞生物學活性之間的關系，為胃癌的侵襲進展調控機制提供新的研究靶點，亦為胃癌臨床綜合治療及預后評估提供新的思路和手段。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
收集大連大學附屬中山醫院胃腸外科 2011～2013 年期間手術切除的胃腺癌標本 69 例，同時收集其中相應標本的正常胃黏膜組織（距離癌組織 5 cm 的組織）30 例作為對照。所有患者均為首次手術，術前未進行放、化療等治療，組織均經病理檢查確認。69 例胃癌患者中男 49 例，女 20 例；年齡 36～90 歲、（66±10）歲。分化程度：高分化 3 例，中分化 20 例，低分化 30 例，未分化 16 例。TNM 分期按照第 8 版胃癌 TNM 分期。HP 陽性 41 例，陰性 28 例。
1.2 免疫組織化學染色方法檢測 Lgr5 及 Ki-67 蛋白在組織中的表達
1.2.1 主要試劑
一抗抗 Lgr5 抗體（產品編號為 TA502948）和抗 Ki-67 抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司、鼠抗人單克隆抗體、0.1 mL；二抗即用型 SABC-POD（小鼠/兔 IgG）試劑盒和 DAB 顯色劑均購自武漢博士德生物技術有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、實驗耗材等均來自大連大學附屬中山醫院中心實驗室。
1.2.2 方法
① 采用標準的 SABC 法檢測 Lgr5 和 Ki-67 蛋白表達情況。組織標本常規經 4% 甲醛溶液固定，行常規石蠟包埋，連續切片 4 μm。嚴格按照說明書進行操作：脫蠟、脫水、滅活、抗原修復、封閉工作液、加一抗、二抗、DAB 顯色、封片等。陽性對照用已知的陽性組織，用 PBS 代替一抗作為陰性對照。② 采用快速尿素酶法檢測 HP 的感染情況。
1.2.3 結果判定
① Lgr5 蛋白表達以細胞漿和（或）細胞膜出現黃色和（或）棕黃色顆粒判斷為陽性表達，根據著色程度和陽性細胞百分比進行半定量評分，按細胞著色程度評分，無色為 0 分、淺黃色為 1 分、黃色為 2 分、棕黃色為 3 分，按陽性細胞數所占的百分比計分：陽性細胞數<5%為 0 分，5%～25%為 1 分、25%～50%為 2 分、50%～75% 為 3 分，>75%為 4 分進行判斷賦值。通過著色程度評分與陽性細胞百分比分值進行相乘為最終表達計分，為 0～12 分，其中 0 分為不表達（–）、1～4 分為弱陽性表達（+）、5～8 分為中等陽性表達（++）、9～12 分為強陽性表達（+++）。陽性表達包括（+）～（+++）。② Ki-67 蛋白表達以細胞核染成黃色和（或）棕黃色為陽性表達，按照陽性細胞數<10%為不表達（–）、10%～50%為弱陽性表達（+）、50%～75%為中等陽性表達（++），>75%為強陽性表達（+++）分組。陽性表達包括（+）～（+++）。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 25 軟件對數據進行統計分析。計數資料及四格表資料比較采用卡方（χ2）檢驗。兩等級變量相關性分析采用 Spearman 等級相關進行分析。檢驗水準 α=0.050。
2 結果
2.1 Lgr5 及 Ki-67 蛋白在組織中的表達
Lgr5 蛋白表達在胃癌組織中主要定位于細胞質中（有部分表達定位于細胞膜中）呈黃色或棕黃色彌漫性表達（圖 1a），其在正常胃黏膜組織中也有部分表達（圖 1b）；Ki-67 蛋白表達在胃癌組織中主要定位于細胞核中呈棕黃色及棕褐色表達（圖 1c），其在正常胃黏膜組織中也有部分表達（圖 1d）。Lgr5 和 Ki-67 蛋白在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達陽性情況見表 1，二者在胃癌組織中均較其在正常胃黏膜組織中高（Lgr5 蛋白：87.0%（60/69）比 16.7%（5/30），χ2=45.81，P<0.001；Ki-67 蛋白：79.7%（55/69）比 36.7%（11/30），χ2=17.43，P<0.001）。
圖1
示 Lgr5 及 Ki-67 蛋白在胃癌組織及正常胃黏膜組織中的表達情況（SABC 法 ×400）
a：Lgr5 蛋白在胃癌組織中的表達；b：Lgr5 蛋白在正常胃黏膜組織中的表達；c：Ki-67 蛋白在胃癌組織中的表達；d：Ki-67 蛋白在正常胃黏膜組織中的表達
表1
Lgr5 及 Ki-67 蛋白在不同組織中的表達結果（例）
2.2 Lgr5 及 Ki-67 蛋白在胃癌組織中的表達與胃癌患者的臨床病理特征的關系
結果見表 2。從表 2 可見，Lgr5 及 Ki-67 蛋白在胃癌組織中的表達均與胃癌的分化程度、淋巴結轉移及 HP 感染有關，即在低-未分化、N1～N3 期及 HP 感染陽性胃癌組織中的蛋白表達陽性率明顯高于高-中分化、N0 期及 HP 感染陰性患者（P<0.050），Lgr5 蛋白表達還與胃癌浸潤深度有關，而 Ki-67 蛋白表達與此無關。Lgr5 及 Ki-67 蛋白表達與胃癌患者的性別和遠處轉移均無關（P>0.050）。
表2
胃癌組織中 Lgr5 和 Ki-67 蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的關系（例）
2.3 胃癌組織中 Lgr5 蛋白表達與 Ki-67 蛋白表達的關系
經 Spearman 相關性分析顯示，Lgr5 蛋白表達與 Ki-67 蛋白表達呈明顯的正相關（rs=0.340，P=0.004），結果見表 3。
表3
胃癌組織中 Lgr5 蛋白的表達與 Ki-67 蛋白表達的相關性分析（例）
3 討論
目前胃癌在我國早期發現率低、病情進展快、預后差，胃癌術后惡性侵襲和轉移仍是其預后較差的主要原因。因此，針對胃癌組織的侵襲、轉移、復發等機制的探索仍為目前研究的熱點。
隨著研究的不斷深入，有研究者[1]認為癌干細胞也稱腫瘤干細胞在腫瘤發生、進展過程中發揮著作用。腫瘤干細胞是一種具有自我更新、抗化療藥物及抵抗放射線特性的細胞，能夠導致術后腫瘤的復發、化療后腫瘤進展以及最終死亡。因此，目前研究的重點是將殺死已增殖成熟的腫瘤細胞轉移至通過其特定標志物檢測及特異性靶向治療消滅腫瘤干細胞。本研究亦著眼于探索胃癌可能的腫瘤干細胞標志物及可能用于胃癌術后風險評估的標志物。
3.1 Lgr5 蛋白的表達及其與胃癌臨床病理特征的關系分析
Lgr5 蛋白是富含亮氨酸重復序列 G 蛋白偶聯受體 5，它是 G 蛋白偶聯受體家族的成員之一。Lgr5 蛋白廣泛分布于人體各種組織中，在大腦、毛囊、乳腺、胃腸道、生殖器官等均有表達[1-4]。Lgr5 結構特點為其多肽鏈的細胞外區有 17 個富含亮氨酸的重復序列，N 端和 C 端富含半胱氨酸序列以及高度保守的 7 次 α 螺旋跨膜區。目前已經證實 Lgr5 蛋白廣泛表達于小腸和結腸黏膜的腺隱窩基底部的柱狀細胞中，它可作為結直腸癌的干細胞標志物[1-8]。在結直腸癌的研究[8-16]中證實了 Lgr5 作為 Wnt 信號通路下游的靶向基因，能夠增強 Wnt/β-catenin 信號通路，而作為結腸癌干細胞標志物的 Lgr5 蛋白在結腸癌中大量表達并與結腸癌的發生、轉移、復發以及與患者的預后等密切相關。在本研究中發現，Lgr5 蛋白在胃癌組織中的表達陽性率明顯高于其在相應的正常胃黏膜組織（P<0.050），且發現 Lgr5 蛋白表達陽性率在 T3+T4 期、N1～N3 期及低-未分化胃癌組織中明顯高于 T1+T2 期、N0 期及高-中分化患者（P<0.050），結果提示，Lgr5 蛋白表達可能參與了腫瘤組織的局部浸潤、淋巴結轉移過程并與腫瘤惡生程度有關，但其實際作用機制尚需要進一步探索研究。在本研究中未發現 Lgr5 蛋白表達與胃癌 M 分期有關（P=0.486），分析其原因可能與納入樣本量有關，M1 期病例數僅有 5 例，后期還需增大 M1 期患者的樣本量以明確 Lgr5 蛋白的表達與腫瘤遠處轉移的相關性。本實驗并未發現 Lgr5 蛋白表達與 HP 感染之間的明確相關性（P=5.939）。
3.2 Ki-67 蛋白的表達及其與胃癌臨床病理特征的關系
“正常胃黏膜—腺瘤（息肉）—腺癌”的發展模式是公認的胃癌發生學說，該學說強調在不同的發展階段有不同的癌基因或抑癌基因等因素參與。作為一種細胞周期相關的核抗原 Ki-67 蛋白是目前臨床應用最廣泛的細胞增殖活性標志物，可用來判斷腫瘤細胞增殖活性、腫瘤復發、轉移等諸多生物學特性以及判斷患者預后，其具有非常重要的意義[17-20]。最初 Ki-67 蛋白由 Gerdes 等[17]于 1983 年首先發現，它是一種大分子量的蛋白質，其富含多個 PEST 序列及磷酸化位點。Ki-67 蛋白半衰期短，在細胞中能夠快速降解，已證實其與細胞增殖活性密切相關，故其已經被廣泛地用于判斷乳腺癌、肺癌、前列腺癌等的增生活性，其在胃腸腫瘤中也被廣泛應用[18-25]。本研究中發現，Ki-67 蛋白陽性表達定位在細胞核，呈棕黃色及棕褐色，這與文獻[17-23]報道是一致的。在本研究中觀察到，在正常胃黏膜中 Ki-67 蛋白有少量表達，而在胃癌中 Ki-67 蛋白表達明顯增強，且二者之間的表達陽性率比較差異有統計學意義，結果提示，在“正常胃黏膜—腺瘤（息肉）—腺癌”的轉變過程中，細胞增殖活性逐漸增強。本研究還發現，胃癌組織中 Ki-67 蛋白表達與腫瘤淋巴結轉移及腫瘤分化程度有關，即有淋巴結轉移者及分化較低者 Ki-67 表達陽性率越高，結果提示 Ki-67 在胃癌的發展及淋巴結轉移過程中可能具有重要的意義，Ki-67 蛋白一定程度上也可提示患者的預后情況。本研究還發現 Ki-67 蛋白表達與 HP 感染之間存在關聯（P=0.044），提示 HP 感染在參與胃癌發生及發展過程中可能影響了 Ki-67 蛋白的表達，其具體機制還需進一步的研究揭示。
3.3 Lgr5 蛋白與 Ki-67 蛋白的關聯
在本研究中發現 Lgr5 和 Ki-67 蛋白在胃癌組織中表達陽性率均較高，二者在腫瘤發生及發展過程中是否起協同作用呢？本研究結果發現，二者在胃癌中的表達陽性率呈明顯的正相關關系（rs=0.340，P=0.004），結果提示，二者可能在胃癌的發生及發展過程中起協同作用。
本研究結果提示，作為胃癌干細胞表面標志物的 Lgr5 蛋白以及反映細胞增殖活性的標志物Ki-67，二者均在胃癌組織中的表達陽性率較高且與腫瘤的分化程度和淋巴結轉移有密切的關系，二者可能共同參與了胃癌的發生、發展及轉移過程，并且可能與 HP 感染具有協同作用，可能為胃癌的治療提供新的途徑及思路，但仍需大樣本的隨機對照研究進一步證實并發掘其在胃癌中的相互關系和作用機制。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：馮寧負責研究的具體實施與數據分析、論文撰寫；劉文志負責實驗醞釀和設計；朱瑞萍、程瑤負責標本切片、免疫組化染色；林峰、薛帆、張旭、崔佑剛、馬洋負責病本收集、病例資料隨訪。
倫理聲明：本研究通過了大連大學附屬中山醫院倫理委員會審批。
