引用本文： 龔奇, 徐鋒, 趙亮, 戴朝六. ALPPS 術后肝再生與內質網應激 IRE1α-XBP1 通路的關系研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(10): 1162-1169. doi: 10.7507/1007-9424.201905046 復制
肝部分切除手術是治療肝臟原發性腫瘤和部分轉移最主要的且行之有效的方式之一[1-2]。但很多患者限于手術后肝臟剩余體積的不足而得不到有效救治，使得剩余肝體積不足成為肝臟外科手術的有待解決的重要課題[3-4]。聯合肝臟分離和門靜脈結扎二步肝切除（associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy，ALPPS）自從 2007 年被提出后，得到了業界的廣泛關注[5]。臨床數據顯示，此種手術方式能在短時間提升肝臟的剩余體積達 47%～93%[6]，從而為部分患者提供手術機會，在其后的動物實驗[7]中也逐漸認識到 ALPPS 能有效地刺激肝臟再生，而滿足個體的耐受程度。因此，ALPPS 術式在未來可能是解決臨床窘境的主要方式之一，然而其快速增生的機制尚不明確，了解并探索這一課題是十分必要。
肝臟作為人體主要的代謝器官，擁有強大的再生能力，正常肝組織即使在 70% 的肝切除后仍有能力恢復其體積，這是肝臟的代償性過程，有賴于肝細胞的增生和肝細胞肥大[8]。ALPPS 一期手術包括 2 個主要任務：包括門靜脈結扎和肝臟原位分離，巨大的創傷給個體帶來嚴重負荷的同時也明顯地提高了剩余肝體積的增生率。內質網應激和未折疊蛋白反應從胚胎發育[9-11]到細胞增殖[12-13]，從多能分化[14]到細胞凋亡均扮演了重要角色。早先的肝損傷動物模型顯示，內質網應激的部分通路參與了肝細胞的增殖活動，作為細胞中執行合成功能的重要細胞器的內質網，其準確合成和折疊蛋白的能力對細胞存活和維持正常功能至關重要[15]，多種刺激均可誘導內質網的應激反應并啟動未折疊蛋白反應[16]，其中肌醇酶 1-X 盒連接蛋白 1（IRE1-XBP1）途徑是最為保守的一條途徑，同時也是在多種細胞的增殖中發揮作用的一條途徑[10, 17]。但 ALPPS 術式下，快速增生的機制是否與其相關是有待研究的，內質網應激在快速增生的過程中發揮了何種作用也十分值得研究。筆者團隊渴望通過本研究，一方面明確小鼠體內 ALPPS 在促進肝臟增生方面相較于其他手術方式的優勢，一方面初步地探索內質網應激在這個過程中可能的作用機制。
1 材料與方法
1.1 主要動物和材料
健康雄性 C57bl/6 小鼠 72 只，SPF 級，周齡約 8 周，體質量（24±2）g，購買于遼寧長生生物有限公司。兔抗小鼠 Ki-67 抗體、山羊抗兔二抗、兔抗小鼠 XBP1 及 IRE1α 抗體均購于 Abcam 公司。免疫組織化學試劑盒和 DAB 顯色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。
1.2 實驗分組
72 只小鼠按隨機數字表方法隨機分為假手術組（Sham 組）、單純門靜脈結扎組（PVL 組）和 ALPPS 組，每組 24 只。動物飼養于中國醫科大學 SPF 級動物實驗中心，自由飲食飲水，保持 12 h 光照/12 h 黑暗交替。
1.3 手術方式
動物模型建立參考 Schlegel 等[18]的方法并加以改進。小鼠術前 12 h 禁食，保持正常飲水，所有小鼠采用專用小動物麻醉機，快速麻醉后，給予 3% 的異氟烷+混合空氣持續吸入。麻醉后小鼠固定于專用手術臺，用寵物剃毛機剃除腹部毛發，用愛爾碘Ⅲ型消毒液（有效碘含量 4.5～5.5 g/L）消毒腹部皮膚 3 次。取正中切口 1.5～2.0 cm 長，打開腹腔，解剖分離鐮狀韌帶和肝胃韌帶，充分暴露肝臟，按照 Schlegel 等[18]的實驗方案建模。在 3 組小鼠中，本研究需要結扎并切除肝左外側葉以實現小鼠整個肝臟 90% 的門靜脈結扎，并使得作為殘余肝而保留下來的肝左中葉體積占總肝體積的 9%～11% 以模擬臨床情況。再依次仔細分離尾狀葉、右葉和中葉的動脈、膽管和門靜脈分支。假手術組小鼠經上述操作后逐層縫合關腹；PVL 組在上述基礎上用 5-0 絲線依次結扎尾狀葉、右葉和右中葉對應的門靜脈分支，保留左中葉動脈、膽管和門靜脈分支；ALPPS 組在上述基礎上，沿中葉缺血線離斷肝實質，并用單極電刀充分止血，最后放入止血紗布于斷面防止出血和術后粘連。術后均采用 4-0 絲線逐層縫合。
1.4 標本收集處理
3 組小鼠于術后 1、2、4 及 7 d 麻醉后收集標本，小鼠于取材后采用頸椎脫臼法處死。各時間點 3 組均取材 6 只。小鼠的選擇按照隨機對照原則進行，先將小鼠按體質量編號，隨后以隨機數字表進行分組，最后按隨機對照原則標號入組。下腔靜脈采血 1 mL 后，3 500 r/min 離心 15 min（r=8.6 cm）后收集上清標本于–80 ℃ 保存。解剖肝臟，分離肝葉，稱取左中葉重量，取約 60 mg 組織于液氮中速凍后–80 ℃ 保存，其余肝組織浸泡于 4% 的多聚甲醛中。
1.5 肝重體質量比計算
左中葉肝重體質量比通過以下公式計算：肝重體質量比=剩余肝重量（mg）/體質量（mg）。小鼠體質量在麻醉前進行稱取。
1.6 肝臟病理及免疫組織化學檢測
石蠟切片行 3.5 μm 連續切片、脫蠟、水化，進行免疫組織化學染色。免疫組織化學染色按照試劑盒說明書進行操作，脫蠟、水化后進行檸檬酸鈉緩沖液微波加熱和抗原修復雙重修復，使用兔抗小鼠 Ki-67 單克隆抗體按照 1∶200 稀釋配置后孵育標本，置于 4 ℃ 冷房過夜，次日使用山羊抗兔的二抗于 37 ℃ 溫箱中孵育 40 min，顯色使用 DAB 顯色劑顯色，使用蘇木精復染于組化室脫水，透明后在通風櫥進行中性樹膠封片。結果計算：高倍視野內（200 倍）計算肝細胞數及 Ki-67 陽性細胞數，每張切片隨機選取 5 個視野，計算 Ki-67 陽性細胞比例。
1.7 Western blot 法檢測蛋白表達
稱取肝臟組織約 30 mg，加入裂解液，置于冰上研磨勻漿，靜止 30 min，超聲破碎后 4 ℃ 離心，12 000 r/min 持續 30 min（r=8.6 cm），輕輕吸取上清留作蛋白樣本。BCA 法蛋白測定后與 LOADING 按 4∶1 比例混勻，100 ℃ 金屬浴 5 min，10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE 上樣電泳）后電轉至聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜），以 5% 脫脂牛奶室溫封閉 2 h 后加入一抗 XBP1 與一抗 IRE1α，4 ℃ 孵育過夜。TBST 漂洗 3 次后加入山羊抗兔的二抗室溫孵育 2 h，TBST 洗滌 3 次后，于避光條件下顯影，定影。蛋白半定量的測定：使用 ImageJ 軟件對同組多張 Western blot 圖片的平均光密度值進行測定，計算曲線下面積作為條帶密度值，其與內參條帶密度值的比值作為蛋白的相對表達量。
1.8 統計學方法
數據采用 SPSS 22.0 及 Graphpad Prism 6 統計軟件進行分析。實驗數據以均數±標準差（
±s）表示，統計方法采用 ANOVA 方差分析（兩兩比較采用 Tukey 檢驗方法）。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
預實驗時，筆者團隊對小鼠進行隨機分組，然后造模，造模過程中 Sham 組及 PVL 組小鼠死亡多發生在術后第 1 天，死亡率為 10%，通過對死亡小鼠的解剖，筆者發現，手術操作過程結扎不牢固導致的持續創面出血引起的失血性休克及腹腔感染可能是其死亡的主要因素；而 ALPPS 組小鼠死亡多發生在術后第 2 天，死亡率為 20%，離斷面止血不充分以及腹腔感染是小鼠死亡的主要原因。因此，正式實驗時，本研究除采用常規術前術后切口消毒外，盡可能保證手術在相對無菌的 SPF 級動物實驗室中進行，術中采用 5-0 手術縫合線進行結扎，并采用電凝對創面充分止血以保證小鼠存活。在正式實驗中，各組小鼠在處死前均存活。
2.1 3 組小鼠的殘余肝體積增生情況及肝重體質量比
3 組小鼠的肝臟增生結果見（圖 1a–圖 1m）。小鼠肝體積在大體標本上呈現出明顯差別，3 組術后各時間點肝再生情況變化呈現不同的增生速度，尤其是 ALPPS 組在術后第 4 天和第 7 天表現出較 PVL 組更加明顯的增生，ALPPS 組較其他 2 組優勢明顯。由于各個小鼠體質量及肝體積大小存在一定的個體差異，故本研究通過計算小鼠肝重體質量比后量化作圖（圖 1m），結果顯示：術后 ALPPS 組和 PVL 組的肝重體質量比隨時間逐步上升，而 Sham 組變化不大；在術后第 1 天和第 2 天時，同時點 Sham 組、ALPPS 組及 PVL 組的差異均無統計學意義（P>0.05）；在術后第 4 天時，3 組間則表現出明顯的差異，ALPPS 組和 PVL 組的肝重體質量比均高于 Sham 組，差異均有統計學意義（P<0.000 1、P=0.027 6），且 ALPPS 組的肝重體質量比高于 PVL 組（P=0.017 8）；到術后第 7 天時，3 組間的差異仍然存在，ALPPS 組和 PVL 組的肝重體質量比均高于 Sham 組，差異均有統計學意義（P<0.000 1、P=0.002 5），且 ALPPS 組的肝重體質量比高于 PVL 組（P=0.001 5）。
圖1
示 3 組小鼠各時間點的大體標本增生情況、術后各時間點肝重體質量比的變化及 Ki-67 陽性細胞比變化，以及 3 組各時點的免疫組織化學染色結果（SP ×200）
a–l：示 3 組小鼠各時間點肝臟增生情況，見ALPPS 組與 PVL 組在第 2 天起出現增生趨勢，從第 4 天起增生愈發明顯，且 ALPPS 組的增生速度更快，效果更明顯；m：3 組術后各時間點肝重體質量比的變化；n：3 組術后各時間點的 Ki-67 陽性細胞比變化；同時點與 Sham 組比較，*
2.2 免疫組織化學染色結果
Ki-67 檢測結果顯示，術后 PVL 組和 ALPPS 組的肝組織中均有明顯 Ki-67 陽性表達，而 Sham 組各時間點內的 Ki-67 表達不明顯，ALPPS 組術后第 2 天和第 4 天比 PVL 和 Sham 組有更多的增殖中的細胞，多分布于門靜脈膽管周圍，到第 7 天增生趨勢減緩（圖 1n–圖1z）。通過對 Ki-67 指標的檢測，筆者發現，4 個時間點 Sham 組的 Ki-67 陽性細胞比無明顯變化，而 ALPPS 組和 PVL 組的 Ki-67 陽性細胞比趨勢為：在術后第 2 天增加，第 4 天有所下降，第 7 天降至第 1 天水平左右（圖 1n）。在術后第 1 天和第 7 天，3 組的 Ki-67 陽性細胞比的差異均無統計學意義（P>0.05）；但在第 2 天時，ALPPS 組則呈現出明顯的細胞核增殖，Ki-67 陽性細胞比相比于 Sham 組較高（P<0.05），此外第 2 天時 PVL 組在相對于 Sham 組來說其 Ki-67 陽性細胞比也較高（P<0.05），但 ALPPS 組與 PVL 組相比較仍然存在增殖速度上的優勢（P<0.05）。這提示 ALPPS 導致的快速增生過程啟動階段是發生在術后第 2 天；而到術后第 4 天時，盡管 ALPPS 組與 PVL 組的Ki-67 陽性細胞比相比于 Sham 組來說差異都存在統計學意義（P<0.05），但 ALPPS 組與 PVL 之間已無明顯差異（P>0.05），這提示 ALPPS 導致的肝增生速度減緩。
2.3 Western blot 檢測結果
Western blot 結果提示，Sham 組 IRE1α 和 XBP1 的表達水平在 4 個時點間變化不大；PVL 組 IRE1α 和 XBP1 的表達水平在術后第 1 天和第 2 天變化不大，到第 4 天和第 7 天時呈現明顯增高趨勢；ALPPS 組 IRE1α 和 XBP1 的表達水平在 4 個時點上呈現出逐漸增加的趨勢（圖 2）。
圖2
示Western blot法檢測的3組術后各時點IRE1α及XBP1表達的電泳圖及其半定量結果
a–d：3組術后第1（a）、2（b）、4（c）和7天（d）IRE1α及XBP1表達的電泳結果；e–h：3組術后第1（e）、2（f）、4（g）和7天（h）XBP1表達的半定量結果；i–l：3組術后第1（i）、2（j）、4（k）和7天（l）IRE1α表達的半定量結果
術后第 1 天時，3 組的 XBP1 和 IRE1α 的表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）；術后第 2 天時，與 Sham 組和 PVL 組比較，ALPPS 組的 XBP1 和 IRE1α 的表達水平均較高（P<0.05），但 Sham 組和 PVL 組比較差異無統計學意義（P>0.05）；術后第 4 天時，與 Sham 組比較，ALPPS 組和 PVL 組的 XBP1 和 IRE1α 的表達水平均較高（P<0.05），且 ALPPS 組的 XBP1 和 IRE1α 的表達水平均較 PVL 組高（P<0.05）；術后第 7 天時，與 Sham 組比較，ALPPS 組和 PVL 組的 XBP1 和 IRE1α 的表達水平均較高（P<0.05），ALPPS 組的 XBP1 的表達水平高于 PVL 組（P<0.05），但 ALPPS 組的 IRE1α 的表達水平與 PVL 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 2。
3 討論
肝切除術是目前治療肝臟原發或轉移腫瘤最有效的方式，但是在實施過程中，很難達到 R0 切除以保障生存預后，該問題的關鍵點在于殘余肝體積過小所導致的“肝臟切除術后肝功能衰竭”“小肝綜合征”等一系列并發癥[19-20]。對于正常的成年人來說，可耐受的術后殘余肝體積約為 30%，但對于有肝臟基礎疾病、肝功能障礙或肝損傷的患者而言，40% 及以上的殘余肝體積是十分必要的[21]。對于經典的 PVL 術式而言，刺激肝再生的能力雖然能滿足部分患者的手術要求，但其缺點也是顯而易見的：一方面是需要 6～8 周的時間促進肝再生以滿足術后要求的殘余肝體積，漫長的間期往往使得患者在此期間失去手術機會；另一方面是其對于肝臟再生刺激的不足，使得肝臟即使長時間再生也未能達到手術要求[20, 22]。ALPPS 手術從最初被提出以來就受到世界肝臟外科專家的關注，因其在短時內就能促進肝臟再生出足夠的殘余肝體積以滿足手術要求，同時也因其術后嚴重并發癥、高死亡率以及其尚不明確的快速增生的機制而飽受爭議[23-24]。
肝臟作為人體主要的代謝器官，擁有強大的再生能力，正常肝組織即使在切除 70% 的肝臟后仍有能力恢復其原有體積，這種肝臟的代償性過程，有賴于肝細胞的增生和肝細胞肥大[8, 25]。在受到手術或藥物等刺激后，肝臟接受外源性和內源性信號刺激，啟動內質網應激以調節細胞內合成和降解過程，保證細胞存活并參與增生過程，其中同樣涉及到其他諸多信號通路、細胞因子、生長因子、補體等多種因素，如白介素-6（IL-6）、信號傳導與轉錄激活因子 3（STAT3）、轉化生長因子-α（TGF-α）等不僅參與啟動過程，促進肝細胞由 G0 期轉向 G1 期，同時提高了肝細胞對生長因子的應答，從而推進肝細胞再生[26-28]。而作為功能結構中重要成員的蛋白質在再生過程中的大量合成是不可或缺的，作為蛋白質加工廠的內質網在此過程中發生的應激過程對其合成和再生具有重要作用[25, 29]。
因此，本實驗選定了內質網應激過程中最為保守穩定的一條通路，通過建立小鼠模型模仿手術患者接受 ALPPS 手術，發現術后結扎側肝臟壞死、萎縮，而保留側肝葉得以增生。從本實驗結果不難看出，在小鼠體內，通過 ALPPS 術式在一定程度上刺激了保留肝葉的增生，并成功地顯示出較之經典 PVL 更為明顯的體積優勢和較大的肝重體質量比，這與早先在臨床上開展的人體手術結論相似[20, 30]。作為內質網應激通路的標志蛋白，IRE1α-XBP1 途徑在肝受損后，由于內質網應激的發生，導致 IRE1α 的表達上調，并通過 IRE1α 對 XBP1 基因的剪切作用使得 XBP1 的合成增多，使得該途徑發揮作用以控制蛋白的合成和降解，以參與再生的過程。同時，從 Western blot 實驗結果可以看出，PVL 一定程度上也有著內質網應激的存在，但其程度較 ALPPS 過程來說明顯降低，這可能是 PVL 刺激再生遠不及 ALPPS 手術明顯的部分原因。從本實驗免疫組織化學實驗結果可以看到，ALPPS 組的細胞增殖因子 Ki-67 在術后第 2 天達到最高峰，與 IRE1α-XBP1 應激軸蛋白表達量增高的時間節點相同，結合小鼠肝重體質量比在第 4 天才開始出現明顯增加的結果，證明在 ALPPS 手術早期，肝臟通過內質網應激調節蛋白合成參與了肝細胞的快速增殖，促進了肝組織的快速增生；而第 1 天和第 7 天的 Ki-67 陽性細胞比在 3 組中比較差異無統計學意義，這可能與肝臟增生的過程相關，筆者根據實驗結果可以解釋為，肝在 1 周內增生速度快，故而在第 2 天和第 4 天檢測結果呈現明顯增高，而在第7 天增生速度減緩，故而 Ki-67 陽性細胞比恢復到基線水平，表現的結果就是第 1 天第 7 天間無明顯差異。
然而，對于 ALPPS 術后內質網應激的調節與其參與再生的機制仍有待進一步研究，在內質網應激發生過程中，IRE1α-XBP1 分支通常是被激活以控制過度的內質網應激，在決定細胞命運中起著重要的保護作用[31]。同時 IRE1α 在胰島 B 細胞的增殖過程中，被證明是通過 XBP1 相關機制來起到促進作用的[32]。因此，在 ALPPS 促進肝再生的過程中，內質網應激可能一方面通過促進內質網功能、緩解內質網應激以保證細胞存活，一方面作為一個信號分子與多種基因結合促進肝細胞增生[33]。作為經典的轉錄因子通路，STAT3 分子被證明不僅在胰島細胞增殖過程中起重要作用，而且在小鼠肝臟受到嚴重的創傷后，由于肝細胞中發生內質網應激激活了細胞增殖過程，而這個過程中 STAT3 通過與 IRE1α 作用起到了促進肝細胞增殖的作用[34]。另外在肝損傷模型中，其修復應答過程更是與 STAT3 直接相關，這為證明在 ALPPS 術后肝再生過程中內質網應激通過 IRE1α 與 STAT3 的相互作用而發揮作用提供了證據支持。同時，IRE1α 激活剪切的 XBP1，也可能參與了細胞周期的調控以參與肝細胞的增殖。在最新的研究[35]中，在小鼠肝部分切除后檢測 XBP1 在不同處理后早期的基因結合位點，發現自術后 6 h 起，XBP1 與基因損傷修復、急性相反應及肝生長代謝相關基因緊密結合以促進肝細胞增殖，而在 48 h 后表現出與遠端控制應激反應和蛋白質穩態相關基因的密切關系而恢復穩態，控制內質網應激反應趨于停止。這一過程接受了 IL-6 的調控和 STAT3 非依賴型的調控，從而作用于細胞周期素 D1，參與細胞周期的調控而促進了肝再生，這種 IRE1α-XBP1-CyclinD 1 調控肝細胞增殖的結論與本實驗觀測結果相一致，故更加有理由相信，在 ALPPS 術后肝再生的過程中，IRE1α-XBP1 參與并起到了重要的作用[35]，但它們在 ALPPS 術后肝再生過程中是如何作用的？是否與血流重新分布刺激所導致的細胞因子大量合成有關？這一系列問題尚不明確，這將是我們未來的工作方向。
總而言之，本實驗觀察到，IRE1α-XBP1 反應軸參與了 ALPPS 術后肝再生的促進過程，并初步探討了該過程可能的機制。但該實驗仍存在不足：一方面小鼠模型與人體模型存在差異，所用小鼠均為正常雄性小鼠，不能完全模擬肝癌患者的病理條件；另一方面，本實驗對于再生涉及的機制研究只是做了猜想研究，并未深入分子機制，也未明確內質網的調控機制。但本實驗證實了內質網應激在 ALPPS 再生機制中發揮重要的作用，并初步探索了可能的機制，為進一步明確機制奠定了基礎，為進一步改善 ALPPS 在臨床上的應用提供了證據。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：本研究由龔奇在戴朝六的指導下設計完成；龔奇和趙亮參與了研究的具體實施和資料采集；徐鋒對本研究進行了質控并提供指導意見；龔奇對研究數據進行分析總結并在戴朝六指導下完成文章撰寫及修稿。
倫理聲明：本研究已通過中國醫科大學附屬盛京醫院的倫理審核批準（批準文號：2016PS205K）。
肝部分切除手術是治療肝臟原發性腫瘤和部分轉移最主要的且行之有效的方式之一[1-2]。但很多患者限于手術后肝臟剩余體積的不足而得不到有效救治，使得剩余肝體積不足成為肝臟外科手術的有待解決的重要課題[3-4]。聯合肝臟分離和門靜脈結扎二步肝切除（associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy，ALPPS）自從 2007 年被提出后，得到了業界的廣泛關注[5]。臨床數據顯示，此種手術方式能在短時間提升肝臟的剩余體積達 47%～93%[6]，從而為部分患者提供手術機會，在其后的動物實驗[7]中也逐漸認識到 ALPPS 能有效地刺激肝臟再生，而滿足個體的耐受程度。因此，ALPPS 術式在未來可能是解決臨床窘境的主要方式之一，然而其快速增生的機制尚不明確，了解并探索這一課題是十分必要。
肝臟作為人體主要的代謝器官，擁有強大的再生能力，正常肝組織即使在 70% 的肝切除后仍有能力恢復其體積，這是肝臟的代償性過程，有賴于肝細胞的增生和肝細胞肥大[8]。ALPPS 一期手術包括 2 個主要任務：包括門靜脈結扎和肝臟原位分離，巨大的創傷給個體帶來嚴重負荷的同時也明顯地提高了剩余肝體積的增生率。內質網應激和未折疊蛋白反應從胚胎發育[9-11]到細胞增殖[12-13]，從多能分化[14]到細胞凋亡均扮演了重要角色。早先的肝損傷動物模型顯示，內質網應激的部分通路參與了肝細胞的增殖活動，作為細胞中執行合成功能的重要細胞器的內質網，其準確合成和折疊蛋白的能力對細胞存活和維持正常功能至關重要[15]，多種刺激均可誘導內質網的應激反應并啟動未折疊蛋白反應[16]，其中肌醇酶 1-X 盒連接蛋白 1（IRE1-XBP1）途徑是最為保守的一條途徑，同時也是在多種細胞的增殖中發揮作用的一條途徑[10, 17]。但 ALPPS 術式下，快速增生的機制是否與其相關是有待研究的，內質網應激在快速增生的過程中發揮了何種作用也十分值得研究。筆者團隊渴望通過本研究，一方面明確小鼠體內 ALPPS 在促進肝臟增生方面相較于其他手術方式的優勢，一方面初步地探索內質網應激在這個過程中可能的作用機制。
1 材料與方法
1.1 主要動物和材料
健康雄性 C57bl/6 小鼠 72 只，SPF 級，周齡約 8 周，體質量（24±2）g，購買于遼寧長生生物有限公司。兔抗小鼠 Ki-67 抗體、山羊抗兔二抗、兔抗小鼠 XBP1 及 IRE1α 抗體均購于 Abcam 公司。免疫組織化學試劑盒和 DAB 顯色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。
1.2 實驗分組
72 只小鼠按隨機數字表方法隨機分為假手術組（Sham 組）、單純門靜脈結扎組（PVL 組）和 ALPPS 組，每組 24 只。動物飼養于中國醫科大學 SPF 級動物實驗中心，自由飲食飲水，保持 12 h 光照/12 h 黑暗交替。
1.3 手術方式
動物模型建立參考 Schlegel 等[18]的方法并加以改進。小鼠術前 12 h 禁食，保持正常飲水，所有小鼠采用專用小動物麻醉機，快速麻醉后，給予 3% 的異氟烷+混合空氣持續吸入。麻醉后小鼠固定于專用手術臺，用寵物剃毛機剃除腹部毛發，用愛爾碘Ⅲ型消毒液（有效碘含量 4.5～5.5 g/L）消毒腹部皮膚 3 次。取正中切口 1.5～2.0 cm 長，打開腹腔，解剖分離鐮狀韌帶和肝胃韌帶，充分暴露肝臟，按照 Schlegel 等[18]的實驗方案建模。在 3 組小鼠中，本研究需要結扎并切除肝左外側葉以實現小鼠整個肝臟 90% 的門靜脈結扎，并使得作為殘余肝而保留下來的肝左中葉體積占總肝體積的 9%～11% 以模擬臨床情況。再依次仔細分離尾狀葉、右葉和中葉的動脈、膽管和門靜脈分支。假手術組小鼠經上述操作后逐層縫合關腹；PVL 組在上述基礎上用 5-0 絲線依次結扎尾狀葉、右葉和右中葉對應的門靜脈分支，保留左中葉動脈、膽管和門靜脈分支；ALPPS 組在上述基礎上，沿中葉缺血線離斷肝實質，并用單極電刀充分止血，最后放入止血紗布于斷面防止出血和術后粘連。術后均采用 4-0 絲線逐層縫合。
1.4 標本收集處理
3 組小鼠于術后 1、2、4 及 7 d 麻醉后收集標本，小鼠于取材后采用頸椎脫臼法處死。各時間點 3 組均取材 6 只。小鼠的選擇按照隨機對照原則進行，先將小鼠按體質量編號，隨后以隨機數字表進行分組，最后按隨機對照原則標號入組。下腔靜脈采血 1 mL 后，3 500 r/min 離心 15 min（r=8.6 cm）后收集上清標本于–80 ℃ 保存。解剖肝臟，分離肝葉，稱取左中葉重量，取約 60 mg 組織于液氮中速凍后–80 ℃ 保存，其余肝組織浸泡于 4% 的多聚甲醛中。
1.5 肝重體質量比計算
左中葉肝重體質量比通過以下公式計算：肝重體質量比=剩余肝重量（mg）/體質量（mg）。小鼠體質量在麻醉前進行稱取。
1.6 肝臟病理及免疫組織化學檢測
石蠟切片行 3.5 μm 連續切片、脫蠟、水化，進行免疫組織化學染色。免疫組織化學染色按照試劑盒說明書進行操作，脫蠟、水化后進行檸檬酸鈉緩沖液微波加熱和抗原修復雙重修復，使用兔抗小鼠 Ki-67 單克隆抗體按照 1∶200 稀釋配置后孵育標本，置于 4 ℃ 冷房過夜，次日使用山羊抗兔的二抗于 37 ℃ 溫箱中孵育 40 min，顯色使用 DAB 顯色劑顯色，使用蘇木精復染于組化室脫水，透明后在通風櫥進行中性樹膠封片。結果計算：高倍視野內（200 倍）計算肝細胞數及 Ki-67 陽性細胞數，每張切片隨機選取 5 個視野，計算 Ki-67 陽性細胞比例。
1.7 Western blot 法檢測蛋白表達
稱取肝臟組織約 30 mg，加入裂解液，置于冰上研磨勻漿，靜止 30 min，超聲破碎后 4 ℃ 離心，12 000 r/min 持續 30 min（r=8.6 cm），輕輕吸取上清留作蛋白樣本。BCA 法蛋白測定后與 LOADING 按 4∶1 比例混勻，100 ℃ 金屬浴 5 min，10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE 上樣電泳）后電轉至聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜），以 5% 脫脂牛奶室溫封閉 2 h 后加入一抗 XBP1 與一抗 IRE1α，4 ℃ 孵育過夜。TBST 漂洗 3 次后加入山羊抗兔的二抗室溫孵育 2 h，TBST 洗滌 3 次后，于避光條件下顯影，定影。蛋白半定量的測定：使用 ImageJ 軟件對同組多張 Western blot 圖片的平均光密度值進行測定，計算曲線下面積作為條帶密度值，其與內參條帶密度值的比值作為蛋白的相對表達量。
1.8 統計學方法
數據采用 SPSS 22.0 及 Graphpad Prism 6 統計軟件進行分析。實驗數據以均數±標準差（±s）表示，統計方法采用 ANOVA 方差分析（兩兩比較采用 Tukey 檢驗方法）。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
預實驗時，筆者團隊對小鼠進行隨機分組，然后造模，造模過程中 Sham 組及 PVL 組小鼠死亡多發生在術后第 1 天，死亡率為 10%，通過對死亡小鼠的解剖，筆者發現，手術操作過程結扎不牢固導致的持續創面出血引起的失血性休克及腹腔感染可能是其死亡的主要因素；而 ALPPS 組小鼠死亡多發生在術后第 2 天，死亡率為 20%，離斷面止血不充分以及腹腔感染是小鼠死亡的主要原因。因此，正式實驗時，本研究除采用常規術前術后切口消毒外，盡可能保證手術在相對無菌的 SPF 級動物實驗室中進行，術中采用 5-0 手術縫合線進行結扎，并采用電凝對創面充分止血以保證小鼠存活。在正式實驗中，各組小鼠在處死前均存活。
2.1 3 組小鼠的殘余肝體積增生情況及肝重體質量比
3 組小鼠的肝臟增生結果見（圖 1a–圖 1m）。小鼠肝體積在大體標本上呈現出明顯差別，3 組術后各時間點肝再生情況變化呈現不同的增生速度，尤其是 ALPPS 組在術后第 4 天和第 7 天表現出較 PVL 組更加明顯的增生，ALPPS 組較其他 2 組優勢明顯。由于各個小鼠體質量及肝體積大小存在一定的個體差異，故本研究通過計算小鼠肝重體質量比后量化作圖（圖 1m），結果顯示：術后 ALPPS 組和 PVL 組的肝重體質量比隨時間逐步上升，而 Sham 組變化不大；在術后第 1 天和第 2 天時，同時點 Sham 組、ALPPS 組及 PVL 組的差異均無統計學意義（P>0.05）；在術后第 4 天時，3 組間則表現出明顯的差異，ALPPS 組和 PVL 組的肝重體質量比均高于 Sham 組，差異均有統計學意義（P<0.000 1、P=0.027 6），且 ALPPS 組的肝重體質量比高于 PVL 組（P=0.017 8）；到術后第 7 天時，3 組間的差異仍然存在，ALPPS 組和 PVL 組的肝重體質量比均高于 Sham 組，差異均有統計學意義（P<0.000 1、P=0.002 5），且 ALPPS 組的肝重體質量比高于 PVL 組（P=0.001 5）。
圖1
示 3 組小鼠各時間點的大體標本增生情況、術后各時間點肝重體質量比的變化及 Ki-67 陽性細胞比變化，以及 3 組各時點的免疫組織化學染色結果（SP ×200）
a–l：示 3 組小鼠各時間點肝臟增生情況，見ALPPS 組與 PVL 組在第 2 天起出現增生趨勢，從第 4 天起增生愈發明顯，且 ALPPS 組的增生速度更快，效果更明顯；m：3 組術后各時間點肝重體質量比的變化；n：3 組術后各時間點的 Ki-67 陽性細胞比變化；同時點與 Sham 組比較，*
2.2 免疫組織化學染色結果
Ki-67 檢測結果顯示，術后 PVL 組和 ALPPS 組的肝組織中均有明顯 Ki-67 陽性表達，而 Sham 組各時間點內的 Ki-67 表達不明顯，ALPPS 組術后第 2 天和第 4 天比 PVL 和 Sham 組有更多的增殖中的細胞，多分布于門靜脈膽管周圍，到第 7 天增生趨勢減緩（圖 1n–圖1z）。通過對 Ki-67 指標的檢測，筆者發現，4 個時間點 Sham 組的 Ki-67 陽性細胞比無明顯變化，而 ALPPS 組和 PVL 組的 Ki-67 陽性細胞比趨勢為：在術后第 2 天增加，第 4 天有所下降，第 7 天降至第 1 天水平左右（圖 1n）。在術后第 1 天和第 7 天，3 組的 Ki-67 陽性細胞比的差異均無統計學意義（P>0.05）；但在第 2 天時，ALPPS 組則呈現出明顯的細胞核增殖，Ki-67 陽性細胞比相比于 Sham 組較高（P<0.05），此外第 2 天時 PVL 組在相對于 Sham 組來說其 Ki-67 陽性細胞比也較高（P<0.05），但 ALPPS 組與 PVL 組相比較仍然存在增殖速度上的優勢（P<0.05）。這提示 ALPPS 導致的快速增生過程啟動階段是發生在術后第 2 天；而到術后第 4 天時，盡管 ALPPS 組與 PVL 組的Ki-67 陽性細胞比相比于 Sham 組來說差異都存在統計學意義（P<0.05），但 ALPPS 組與 PVL 之間已無明顯差異（P>0.05），這提示 ALPPS 導致的肝增生速度減緩。
2.3 Western blot 檢測結果
Western blot 結果提示，Sham 組 IRE1α 和 XBP1 的表達水平在 4 個時點間變化不大；PVL 組 IRE1α 和 XBP1 的表達水平在術后第 1 天和第 2 天變化不大，到第 4 天和第 7 天時呈現明顯增高趨勢；ALPPS 組 IRE1α 和 XBP1 的表達水平在 4 個時點上呈現出逐漸增加的趨勢（圖 2）。
圖2
示Western blot法檢測的3組術后各時點IRE1α及XBP1表達的電泳圖及其半定量結果
a–d：3組術后第1（a）、2（b）、4（c）和7天（d）IRE1α及XBP1表達的電泳結果；e–h：3組術后第1（e）、2（f）、4（g）和7天（h）XBP1表達的半定量結果；i–l：3組術后第1（i）、2（j）、4（k）和7天（l）IRE1α表達的半定量結果
術后第 1 天時，3 組的 XBP1 和 IRE1α 的表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）；術后第 2 天時，與 Sham 組和 PVL 組比較，ALPPS 組的 XBP1 和 IRE1α 的表達水平均較高（P<0.05），但 Sham 組和 PVL 組比較差異無統計學意義（P>0.05）；術后第 4 天時，與 Sham 組比較，ALPPS 組和 PVL 組的 XBP1 和 IRE1α 的表達水平均較高（P<0.05），且 ALPPS 組的 XBP1 和 IRE1α 的表達水平均較 PVL 組高（P<0.05）；術后第 7 天時，與 Sham 組比較，ALPPS 組和 PVL 組的 XBP1 和 IRE1α 的表達水平均較高（P<0.05），ALPPS 組的 XBP1 的表達水平高于 PVL 組（P<0.05），但 ALPPS 組的 IRE1α 的表達水平與 PVL 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 2。
3 討論
肝切除術是目前治療肝臟原發或轉移腫瘤最有效的方式，但是在實施過程中，很難達到 R0 切除以保障生存預后，該問題的關鍵點在于殘余肝體積過小所導致的“肝臟切除術后肝功能衰竭”“小肝綜合征”等一系列并發癥[19-20]。對于正常的成年人來說，可耐受的術后殘余肝體積約為 30%，但對于有肝臟基礎疾病、肝功能障礙或肝損傷的患者而言，40% 及以上的殘余肝體積是十分必要的[21]。對于經典的 PVL 術式而言，刺激肝再生的能力雖然能滿足部分患者的手術要求，但其缺點也是顯而易見的：一方面是需要 6～8 周的時間促進肝再生以滿足術后要求的殘余肝體積，漫長的間期往往使得患者在此期間失去手術機會；另一方面是其對于肝臟再生刺激的不足，使得肝臟即使長時間再生也未能達到手術要求[20, 22]。ALPPS 手術從最初被提出以來就受到世界肝臟外科專家的關注，因其在短時內就能促進肝臟再生出足夠的殘余肝體積以滿足手術要求，同時也因其術后嚴重并發癥、高死亡率以及其尚不明確的快速增生的機制而飽受爭議[23-24]。
肝臟作為人體主要的代謝器官，擁有強大的再生能力，正常肝組織即使在切除 70% 的肝臟后仍有能力恢復其原有體積，這種肝臟的代償性過程，有賴于肝細胞的增生和肝細胞肥大[8, 25]。在受到手術或藥物等刺激后，肝臟接受外源性和內源性信號刺激，啟動內質網應激以調節細胞內合成和降解過程，保證細胞存活并參與增生過程，其中同樣涉及到其他諸多信號通路、細胞因子、生長因子、補體等多種因素，如白介素-6（IL-6）、信號傳導與轉錄激活因子 3（STAT3）、轉化生長因子-α（TGF-α）等不僅參與啟動過程，促進肝細胞由 G0 期轉向 G1 期，同時提高了肝細胞對生長因子的應答，從而推進肝細胞再生[26-28]。而作為功能結構中重要成員的蛋白質在再生過程中的大量合成是不可或缺的，作為蛋白質加工廠的內質網在此過程中發生的應激過程對其合成和再生具有重要作用[25, 29]。
因此，本實驗選定了內質網應激過程中最為保守穩定的一條通路，通過建立小鼠模型模仿手術患者接受 ALPPS 手術，發現術后結扎側肝臟壞死、萎縮，而保留側肝葉得以增生。從本實驗結果不難看出，在小鼠體內，通過 ALPPS 術式在一定程度上刺激了保留肝葉的增生，并成功地顯示出較之經典 PVL 更為明顯的體積優勢和較大的肝重體質量比，這與早先在臨床上開展的人體手術結論相似[20, 30]。作為內質網應激通路的標志蛋白，IRE1α-XBP1 途徑在肝受損后，由于內質網應激的發生，導致 IRE1α 的表達上調，并通過 IRE1α 對 XBP1 基因的剪切作用使得 XBP1 的合成增多，使得該途徑發揮作用以控制蛋白的合成和降解，以參與再生的過程。同時，從 Western blot 實驗結果可以看出，PVL 一定程度上也有著內質網應激的存在，但其程度較 ALPPS 過程來說明顯降低，這可能是 PVL 刺激再生遠不及 ALPPS 手術明顯的部分原因。從本實驗免疫組織化學實驗結果可以看到，ALPPS 組的細胞增殖因子 Ki-67 在術后第 2 天達到最高峰，與 IRE1α-XBP1 應激軸蛋白表達量增高的時間節點相同，結合小鼠肝重體質量比在第 4 天才開始出現明顯增加的結果，證明在 ALPPS 手術早期，肝臟通過內質網應激調節蛋白合成參與了肝細胞的快速增殖，促進了肝組織的快速增生；而第 1 天和第 7 天的 Ki-67 陽性細胞比在 3 組中比較差異無統計學意義，這可能與肝臟增生的過程相關，筆者根據實驗結果可以解釋為，肝在 1 周內增生速度快，故而在第 2 天和第 4 天檢測結果呈現明顯增高，而在第7 天增生速度減緩，故而 Ki-67 陽性細胞比恢復到基線水平，表現的結果就是第 1 天第 7 天間無明顯差異。
然而，對于 ALPPS 術后內質網應激的調節與其參與再生的機制仍有待進一步研究，在內質網應激發生過程中，IRE1α-XBP1 分支通常是被激活以控制過度的內質網應激，在決定細胞命運中起著重要的保護作用[31]。同時 IRE1α 在胰島 B 細胞的增殖過程中，被證明是通過 XBP1 相關機制來起到促進作用的[32]。因此，在 ALPPS 促進肝再生的過程中，內質網應激可能一方面通過促進內質網功能、緩解內質網應激以保證細胞存活，一方面作為一個信號分子與多種基因結合促進肝細胞增生[33]。作為經典的轉錄因子通路，STAT3 分子被證明不僅在胰島細胞增殖過程中起重要作用，而且在小鼠肝臟受到嚴重的創傷后，由于肝細胞中發生內質網應激激活了細胞增殖過程，而這個過程中 STAT3 通過與 IRE1α 作用起到了促進肝細胞增殖的作用[34]。另外在肝損傷模型中，其修復應答過程更是與 STAT3 直接相關，這為證明在 ALPPS 術后肝再生過程中內質網應激通過 IRE1α 與 STAT3 的相互作用而發揮作用提供了證據支持。同時，IRE1α 激活剪切的 XBP1，也可能參與了細胞周期的調控以參與肝細胞的增殖。在最新的研究[35]中，在小鼠肝部分切除后檢測 XBP1 在不同處理后早期的基因結合位點，發現自術后 6 h 起，XBP1 與基因損傷修復、急性相反應及肝生長代謝相關基因緊密結合以促進肝細胞增殖，而在 48 h 后表現出與遠端控制應激反應和蛋白質穩態相關基因的密切關系而恢復穩態，控制內質網應激反應趨于停止。這一過程接受了 IL-6 的調控和 STAT3 非依賴型的調控，從而作用于細胞周期素 D1，參與細胞周期的調控而促進了肝再生，這種 IRE1α-XBP1-CyclinD 1 調控肝細胞增殖的結論與本實驗觀測結果相一致，故更加有理由相信，在 ALPPS 術后肝再生的過程中，IRE1α-XBP1 參與并起到了重要的作用[35]，但它們在 ALPPS 術后肝再生過程中是如何作用的？是否與血流重新分布刺激所導致的細胞因子大量合成有關？這一系列問題尚不明確，這將是我們未來的工作方向。
總而言之，本實驗觀察到，IRE1α-XBP1 反應軸參與了 ALPPS 術后肝再生的促進過程，并初步探討了該過程可能的機制。但該實驗仍存在不足：一方面小鼠模型與人體模型存在差異，所用小鼠均為正常雄性小鼠，不能完全模擬肝癌患者的病理條件；另一方面，本實驗對于再生涉及的機制研究只是做了猜想研究，并未深入分子機制，也未明確內質網的調控機制。但本實驗證實了內質網應激在 ALPPS 再生機制中發揮重要的作用，并初步探索了可能的機制，為進一步明確機制奠定了基礎，為進一步改善 ALPPS 在臨床上的應用提供了證據。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：本研究由龔奇在戴朝六的指導下設計完成；龔奇和趙亮參與了研究的具體實施和資料采集；徐鋒對本研究進行了質控并提供指導意見；龔奇對研究數據進行分析總結并在戴朝六指導下完成文章撰寫及修稿。
倫理聲明：本研究已通過中國醫科大學附屬盛京醫院的倫理審核批準（批準文號：2016PS205K）。
