引用本文： 李學華, 邢玉輝, 劉志恒, 姜小紅, 侯旭. miR-141-3p 在肝細胞癌組織中的表達及其靶基因與肝細胞癌惡性特征的關系. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(10): 1175-1183. doi: 10.7507/1007-9424.201905007 復制
肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常見的惡性腫瘤致死病因之一[1]。其發展是一個多步驟、多因素相互作用的復雜過程，涉及許多癌基因和（或）抑癌基因的失調[2]。了解 HCC 發展的潛在機制對于開展新的治療方法非常重要。高爾基體蛋白 73（Golgi protein 73，GP73）是一種高爾基體糖蛋白，主要在膽管上皮細胞中表達，而在正常肝臟的肝細胞中則很少見[3]。有研究[4-6]表明，GP73 可作為一種新的 HCC 血清標志物。在之前的薈萃分析中，筆者團隊[7]發現，GP73 與中國 HCC 患者肝切除術后的預后不良密切相關。然而，GP73 在 HCC 發生、發展及轉移中的上下游調控因子尚未完全確定。微小 RNA（miR）是小的非編碼 RNA，長度約為 22 個核苷酸，其在多種生理和病理過程中發揮著關鍵作用[8-9]。越來越多的研究[8-9]表明，異常的 miR 水平與人類各種疾病（如癌癥）密切相關，這為開展新的診斷、治療及預后策略研究提供了新的途徑。近年來的大量研究[9-11]發現，HCC 的發生發展與許多 miR 相關，包括 miR-148a、miR-124、miR-203、miR-138、miR-122、miR-30a-5p 等，但 miR 在 HCC 進展和轉移中的作用仍未完全了解。鑒于 GP73 在 HCC 的診斷和預后中的重要作用[4-7]，筆者預測了可以靶向調控 GP73 的 miRs；在生物信息學分析中，筆者團隊發現，miR-141-3p 可能調節 GP73。因此，本研究選擇在 HCC 中進一步研究 miR-141-3p。在這項研究中，筆者團隊通過體外研究初步證明，miR-141-3p 抑制 HCC 的發展和轉移，且 GP73 過表達可部分逆轉此過程。
1 材料與方法
1.1 研究對象
回顧性收集聊城市人民醫院肝膽外科于 2008 年 1 月至 2015 年 6 月期間通過手術切除治療的 56 例 HCC 及其配對的癌旁組織標本（距離腫瘤邊緣以遠 2 cm）；在切除后 30 min 內，將標本快速冷凍并儲存在–80℃液氮中。56 例患者中，男 30 例，女 26 例，男女比為 1.2∶1.0；年齡 33～74 歲，中位年齡為 50 歲。HCC 直徑 2～13 cm，中位數為 5.6 cm，其中≤5 cm 14 例；臨床 TNM 分期：Ⅰ期 5 例，Ⅱ期 6 例，Ⅲ期 41 例，Ⅳ期 4 例；腫瘤分化等級依據肝癌的 Edmondson-Steiner 病理分級劃分：Ⅰ級 4 例，Ⅱ級 20 例，Ⅲ級 24 例，Ⅳ級 8 例；血管侵犯 42 例，HBsAg 陽性 48 例，合并肝硬變 42 例。所有患者術前均未接受放療和（或）化療。所有標本均經病理科病理確診并經患者知情同意后獲得。
1.2 主要材料、試劑和設備
各 HCC 細胞系（包括 HepG2、PLC、Huh-7、MHCC-97H 和 HCC-LM3 細胞系）、正常肝細胞細胞系 LO2 和人胚腎（HEK）293T 細胞系來自 ATCC 細胞庫（美國）。Trizol 及 Lipofection2000 購于美國 Invitrogen 公司，DMEM 或 RPMI-1640 培養基系美國賽默飛世爾科技公司產品，RT-PCR 試劑盒、Reverse Transcriptase 試劑盒、Q-PCR 熒光染料 SYRR Green 及 miRs PrimeScript RT reagent Kit 購于日本 TaKaRa 公司，hsa-miR-141-3p 引物和內源性 U6 購于廣州復能基因公司，Anti-GP73 羊多抗購于美國 Santa 公司，抗 GAPDH 購于美國 Invitrogen 公司，熒光定量 PCR 儀購于美國 ABI 公司，Transwell 小室購于美國康寧公司，噻唑藍（MTT）試劑盒購于日本西格瑪奧德里奇公司，二甲基亞礬（DMSO）購于上海生工公司，熒光素酶報告載體 psiCHECK-2 購于美國 Promega 公司，EdU Apollo?488 體外成像試劑盒系中國 Ribobio 公司產品，Alpha FluorChem E 系統系美國 ProteinSimple 公司產品。
1.3 細胞培養
HCC 細胞系（包括 MHCC-97H、HCC-LM3、HepG2、PLC 和 Huh-7）、正常肝細胞細胞系 LO2 和人胚腎（HEK）293T 細胞系，在 37℃，5% CO2 及補充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-鏈霉素的 DMEM 或 RPMI-1640 培養基中培養。
1.4 RNA 抽提、逆轉錄反應及 qRT-PCR 檢測
參照 Trizol 說明書從冷凍肝組織和培養的細胞中提取總 RNA。在定量 RNA 濃度后，根據制造商的說明書使用 Reverse Transcriptase 試劑盒構建 cDNA 文庫。使用 Q-PCR 試劑盒檢測 GP73 mRNA 和 miR-141-3p 的表達水平，并使用內源性 U6 進行標準化。GP73 基因的上游引物：5′-CAGCGCTGATTTTGAGATGA-3′，下游引物：5′-ATGATCCGTGTCTGGAGGTC-3′，擴增長度為 156 bp。內參 α-tubulin 的上游引物：5′-CACCCGTCTTCAGGGCTTCTTGGTTT-3′，下游引物：5′-CATTTCACCATCTGGTTGGCTGGCTC-3′，擴增長度為 527 bp。miR-141-3p 引物購于廣州復能基因公司，使用專利算法設計并經過實驗確證，說明書中未提供。mRNA 的表達水平使用 2–△△CT方法計算。各細胞系中 miR-141-3p 的表達水平的檢測均重復檢測 3 次。
1.5 Western blot 檢測
將組織或培養的細胞在 RIPA 緩沖液中裂解并離心以收集上清液（4℃，12 000 r/min 離心 5 min，r=9.5 cm）。使用標準 Western blot 方案分離蛋白。雜交一抗，包括抗 GP73 及抗 GAPDH，然后與相應的二抗孵育，最后使用 Alpha FluorChem E 系統使結合的蛋白可視化。
1.6 選擇調節 GP73 的 miR
miR 是 HCC 發展中的重要調節因子。為了尋找在 HCC 中調節 GP73 的潛在 miR，本研究通過 microRNA.org 數據庫、TargetScanHuman 7.1 及 MIRDB 來預測靶向 GP73 的 miR。使用 DIANA-TarBase v7.0 和 KEGG pathway 數據庫對上述 miR 進一步分析，以探索調節 GP73 的 miR。
1.7 雙熒光素酶報告基因實驗
為了驗證上述選擇的 miR 與 GP73 的靶向調節關系，本研究擴增并克隆了 GP73 野生型 3′UTR（UTR 為非翻譯區），包括 miR-141-3p 的預測結合位點和兩個突變體，并將上述 DNA 片段克隆至熒光素酶報告載體 psiCHECK-2。將 293T 細胞以 1×106 個/孔的密度接種在 24 孔板中，在 37℃、5% CO2 條件下培養 24 h。在細胞生長至細胞密度達到 50% 時，混勻 1.5 μg Lipofectamine 2000、GP73-WT（GP73 野生型）/GP73-MT1（GP73 突變型 1）/GP73-MT2（GP73 突變型 2）和 50 mmol/L miR-141-3p 模擬物（mimics）、空載體或陰性對照（miR-NC）后共轉染細胞，即分為 7 組：空載體+mimics 組、GP73-WT+mimics 組、GP73-WT+miR-NC 組、GP73-MT1+miR-NC 組、GP73-MT1+mimics 組、GP73-MT2+miR-NC 組和 GP73-MT2+mimics 組。轉染后 48 h，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌細胞，并在 Passive Lysis 緩沖液中裂解 15 min，然后在 4℃下以 12 000 r/min 離心 2 min（r=9.5 cm）。每組 3 個復孔。根據雙熒光素酶報告載體制造商的說明書收集細胞上清液用于熒光素酶測定。
1.8 細胞增殖試驗
為了檢測 miR-141-3p 對 HCC 細胞活力和增殖速率的影響，分別進行 MTT 和 EdU 測定。在 MTT 測定中，將 Huh-7 和 MHCC-97H 細胞（在肝癌細胞系中，Huh-7 及 MHCC-97H 細胞侵襲性相對較高，具有代表性）以 2×103 個細胞/孔的密度接種在 96 孔板中，每種細胞系分為 3 組，每組 5 個復孔，在培養 24 h 后轉染。空白對照組不加入任何試劑、miR-NC 組加入 100 μL 的陰性對照 miR，miR-141-3p 組加入 100 μL 的 miR-141-3p 慢病毒載體。轉染 1 d 后檢測細胞中 miR-141-3p 的表達水平。根據試劑盒說明書在轉染第 1、2、3 和 4 天測量 Huh-7 細胞的吸光度（A）值，以反映細胞增殖率。
在 EdU 測定中，細胞分組同 MTT 測定，分別用 miR-141-3p 和陰性對照 miR 轉染 Huh-7 和 MHCC-97H 細胞。溫育 24 h 后，將細胞以 6×103個/孔的密度接種在 96 孔板中，并向每個孔中加入新鮮制備的 50 μmol EdU 100 μL。在 EdU 標記 3 h 后，洗滌細胞，固定并用 Hoechst 33342 復染。使用 EdU Apollo?488 體外成像試劑盒獲得圖像。細胞增殖率為增殖細胞（EdU 陽性細胞）占視野下細胞總數的百分比（1 個視野，200 倍）。將沒有慢病毒轉染的細胞作為空白對照組。每組 5 個復孔，每種條件復測 3 次（取均值）。
1.9 Transwell 侵襲遷移實驗
Transwell 侵襲遷移實驗時，MHCC-97H 細胞分組及轉染操作同 MTT 實驗部分（MHCC-97H 細胞侵襲性較 Huh-7 更強，更具有代表性，故本部分實驗選擇該類型細胞系），每組 5 個復孔。轉染 24 h后，將細胞以 1×105 個/孔接種在涂有基質膠的 Transwell 的上室中，將其插入 24 孔板中用于侵襲實驗。下室含有補充有 5% FBS 的培養基。培養 24 h后，將遷移的細胞用 0.1% 結晶紫染色 20 min 后，以 PBS 清洗 2 次，在 400 倍顯微鏡下隨機選取觀察 3 個不同視野的細胞數計數，取均值。
遷移實驗步驟與以上侵襲實驗基本一致，但本部分實驗中，筆者團隊在未涂基質膠的 Transwell 上室接種 1×106 個細胞/孔并向下室添加含有 2.5% FBS 的培養基。
在細胞功能學回復實驗部分，筆者團隊在陰性對照 miR 模擬物組（加入 mimic NC）、空白對照組（未加入任何試劑）及 miR-141-3p 組（加入 miR-141-3p 慢病毒載體）基礎上，又增加 miR-141-3p+GP73-NC 組（miR-141-3p 慢病毒載體+空質粒）及 miR-141-3p+GP73 組（miR-141-3p 慢病毒載體+GP73 質粒）。轉染 24 h 后，將細胞以 1×105 個/孔接種在 Transwell 上室中，具體步驟與以上實驗基本一致。
1.10 統計學方法
使用 SPSS 18.0 軟件進行統計分析。以均值±標準差（
±s）表示計量資料。HCC 組及其癌旁組織標志物表達水平的比較采用配對 t 檢驗；多組比較采用方差分析（兩兩比較采用 LSD-t 檢驗方法）；兩參數間的關系應用 Pearson 簡單相關進行分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 GP73 mRNA 及其蛋白在 HCC 組織中的表達顯著上調
在本研究中，筆者團隊首先檢測了 1 組 HCC 癌組織及其配對的癌旁組織中 GP73 mRNA 的表達，qRT-PCR 結果顯示，HCC 組織中 GP73 mRNA 的表達水平與鄰近的癌旁組織相比，GP73 mRNA 的表達顯著上調（P<0.05）），見圖 1a。Western blot（圖 1b）結果證實，GP73 蛋白的表達水平在 HCC 組織中也顯著上調。
圖1
示 HCC 組織及其癌旁組織中 GP73 mRNA 及其蛋白的表達、3 類數據庫均可預測到的共同交叉 miR、miR-141-3p 模擬物或陰性對照的共轉染結果、HCC 細胞系和臨床標本中 miR-141-3p 的表達水平、HCC 組織中 miR-141-3p 與 GP73 mRNA 表達關系的散點圖、轉染后 HCC 細胞中 miR-141-3p 的表達及 miR-141-3p 對 Huh-7 細胞增殖能力的影響
a 和 b：HCC 組織及其癌旁組織中 GP73 mRNA（a）及其蛋白（b）的表達，T 表示 HCC 組織，A 表示癌旁組織；c：3 類數據庫預測的 miR 結果；d：miR-141-3p 模擬物或陰性對照的共轉染結果，與其他組別比較，*
2.2 miR-141-3p 靶向 GP73 且與 HCC 組織中 GP73 mRNA 的表達水平呈負相關
microRNA.org 數據庫、TargetScanHuman 7.1 及 MIRDB 均可預測到的 miR 有 5 種，分別是 miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-342-3p、miR-141-3p 及 miR-143-3p，其預測結果見圖 1c。使用 DIANA-TarBase v7.0 和 KEGG pathway 數據庫對上述 miR 進一步分析，結果顯示，miR-141-3p 具有最高的調節 GP73 的潛力。因此，本研究選擇在 HCC 中研究 miR-141-3p 靶向 GP73 的調節作用。miR-141-3p 模擬物或陰性對照的共轉染結果顯示（圖 1d），GP73-WT+mimics 組的相對熒光素酶活性低于其余 6 組（P<0.05），但其余 6 組比較差異無統計學意義（P>0.05），表明 GP73-WT 的 3′UTR 活性被 miR-141-3p 模擬物影響后顯著降低，然而對突變體的 3′UTR 并未發現顯著影響，這表明 miR-141-3p 通過與 3′UTR 結合直接調節 GP73。
2.3 HCC 細胞系和臨床標本中 miR-141-3p 的表達水平
2.3.1 不同 HCC 細胞系、HCC 組織及其癌旁組織中 miR-141-3p 的表達水平
為了評估 miR-141-3p 在 HCC 進展中的變化，本研究首先檢測了不同 HCC 細胞系中 miR-141-3p 的表達水平。本研究以 miR-141-3p 在 LO2 中的表達水平作為對照，設定其相對表達量為 1。結果表明，與正常肝細胞系 LO2 相比，各 HCC 細胞系中 miR-141-3p 的表達水平均降低（圖 1e）。有趣的是，即使在 HCC 細胞系中，miR-141-3p 的表達水平也存在統計學上的差異：在高侵襲性 HCC 細胞系（MHCC-97H、HCC-LM3 和 Huh-7）中，其 miR-141-3p 的表達水平低于 HepG2 和 PLC 細胞系（P<0.05），且 Huh-7、MHCC-97H 和 HCC-LM3 的表達水平依次降低，兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05），但 HepG2 和 PLC 細胞系比較差異無統計學意義（P>0.05）。這與臨床獲取的 HCC 標本中的 miR-141-3p 表達水平的檢測結果相一致：HCC 組織中 miR-141-3p mRNA 的表達水平低于匹配的相鄰癌旁組織中的表達水平（圖 1f），顯示出與 GP73 mRNA 截然相反的表達模式（圖 1a）。Pearson 簡單相關分析結果表明，在 HCC 腫瘤標本中，miR-141-3p 的表達水平和 GP73 mRNA 的表達水平之間存在負相關（r=0.673，P<0.01），見圖 1g。
2.3.2 miR-141-3p 的表達與 HCC 臨床病理學特征的關系
本研究進一步分析 HCC 組織中 miR-141-3p表達與 HCC 進展之間的關系，包括 miR-141-3p 表達與患者年齡、性別、臨床 TNM 分期、腫瘤分化等級、血管侵犯、腫瘤直徑、HBsAg、AFP 等不同臨床病理學特征或參數的關系，以 HCC 組織中 miR-141-3p 的相對表達水平的均數為基線，分為 miR-141-3p 高表達及低表達組。結果表明，miR-141-3p 低表達與較晚的臨床 TNM 分期（P=0.006），低分化的腫瘤（P=0.002）和血管浸潤性腫瘤（P=0.003）相關，而與其他臨床病理學因素，包括年齡、性別、腫瘤直徑、HBsAg、AFP 水平和肝硬變均無關（P>0.05），具體見表 1。
表1
HCC 組織中 miR-141-3p 的表達與其臨床病理學特征的關系（例）
2.4 miR-141-3p 的過表達抑制 HCC 細胞的增殖、侵襲和遷移
為了深入了解 miR-141-3p 在 HCC 進展中的作用，接下來，我們利用 miR-141-3p 慢病毒轉染了 Huh-7 和 MHCC-97H 細胞。qRT-PCR 結果顯示，不管是在 Huh-7 細胞還是在 MHCC-97H 細胞中，與空白對照組和 miR-NC 組相比，miR-141-3p 組的 miR-141-3p 的表達水平均較高（P<0.05），但空白對照組與 miR-NC 組比較差異無統計學意義（P>0.05），提示 2 種細胞系在誘導后其 miR-141-3p 水平明顯升高（圖 1h），這也證實了 miR-141-3p 慢病毒的轉染效率。
在 Huh-7 細胞的 MTT 實驗中，從第 2 天開始，與空白對照組和 miR-NC 組相比，miR-141-3p 組的細胞增殖率均較低（P<0.05），且在第 4 天觀察到最強的抑制（圖 1i），但同時點空白對照組與 miR-NC 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。
EdU 實驗結果顯示，不管是在 Huh-7 細胞還是在 MHCC-97H 細胞中，與空白對照組和 miR-NC 組相比，miR-141-3p 組的 EdU 陽性細胞比例均較低（P<0.05），但空白對照組與 miR-NC 組比較差異無統計學意義（P>0.05），提示在 Huh-7 和 MHCC-97H 細胞中觀察到 miR-141-3p 過表達后的一致抑制作用（圖 2a–2h）。
圖2
示 EdU 檢測結果（ ×200）、Transwell 侵襲遷移實驗及細胞功能學回復實驗結果
a–h：Huh-7 細胞和 MHCC-97H 細胞中，空白對照組（Huh-7 細胞：a；MHCC-97H 細胞：e）、miR-NC 組（Huh-7 細胞：b；MHCC-97H 細胞：f）和 miR-143-3p 組（Huh-7 細胞：c；MHCC-97H 細胞：g）的 EdU 陽性細胞染色結果和計數結果（Huh-7 細胞：d；MHCC-97H 細胞：h），與其余 2 組比較，*
2.5 miR-141-3p 過表達抑制 HCC 細胞的侵襲和遷移
通過以上不同方法，本研究證明了 miR-141-3p抑制 HCC 細胞的增殖。本研究進一步分析了 miR-141-3p 過表達對 HCC 細胞侵襲和遷移潛能的影響。Transwell 侵襲遷移實驗結果（圖 2i 和 2j）表明，與空白對照組和 miR-NC 組比較，miR-141-3p 組的細胞計數均較低（P<0.05），但空白對照組與 miR-NC 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。該結果表明，體外 miR-141-3p 過表達顯著抑制 HCC 細胞的侵襲和遷移潛力。
2.6 GP73 蛋白可部分逆轉 miR-141-3p 在 HCC 細胞中的抑制作用
在前面的研究中，本研究首先探討了 GP73 是否是 miR-141-3p 的靶標，并發現 GP73 和 miR-141-3p在 HCC 進展中的表達呈負相關。為了更好地理解 2 種基因在 HCC 進展中的機制作用，本研究用 miR-141-3p 慢病毒和表達 GP73 的質粒或空載體共轉染 MHCC-97H 細胞。細胞功能學回復實驗結果表明，在侵襲遷移實驗中，與空白對照組和 miR-NC 組比較，miR-141-3p 組、miR-141-3p+GP73-NC 組及 miR-141-3p+GP73 組的細胞計數均較低（P<0.05），但空白對照組與 miR-NC 組比較、miR-141-3p 組和 miR-141-3p+GP73-NC 組比較差異均無統計學意義（P>0.05）；miR-141-3p 組及miR-141-3p+GP73-NC 組分別與miR-141-3p+GP73 組比較差異具有統計學意義（侵襲實驗 P<0.001，遷移實驗 P<0.05）。這說明，表達 GP73 的質粒可導致 miR-141-3p 抑制細胞侵襲和遷移的潛力部分喪失（圖 2k 和圖 2l）。
3 討論
鑒于 GP73 是 HCC 診斷和預后的特異性血清標志物，在本研究中，筆者團隊選擇了 GP73 作為靶基因來預測參與 HCC 發展的上游 miR。通過搜索不同的數據庫，本研究發現，miR-141-3p 具有調節 GP73 表達和影響 HCC 進展的最大潛力。qRT-PCR 結果顯示，miR-141-3p 的表達水平與 GP73 mRNA 的表達呈負相關。此外，通過分析臨床病理學特征，本研究發現，miR-141-3p 低表達與 HCC 進展顯著相關，這與最近的報道[12]一致，即 miR-141-3p 的表達下調可能是 HCC 高侵襲性的原因。miR-141 與 miR-200c 一起形成簇，均屬于 miR-200 家族[13]。既往研究[14]發現，血液循環中 miR-141 及 miR-200c 的水平在 HCC 患者中顯著升高。因此，本研究結果與之前的研究結果共同揭示了 miR-141-3p 在 HCC 患者的診斷和復發監測中的明確意義；同時，miR-141-3p 也可能被認為是未來 HCC 患者的治療靶標。
miR 在轉錄水平上可以通過與靶基因啟動子結合，激活或抑制靶基因[15]；而在轉錄后水平上 miR 可以抑制靶基因翻譯或通過結合其 3′UTR 區域引起靶 mRNA 降解[16]。在本研究中，熒光素酶測定結果顯示，miR-141-3p 模擬物顯著抑制 GP73 野生型的 3′UTR 活性，然而對突變型卻未發現明顯影響，這表明 miR-141-3p 在轉錄后水平上靶向調控 GP73。
既往的研究[17-19]表明，miR-141 在多種惡性腫瘤中的作用是有爭議的。在晚期腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）中，miR-141-3p 與 miR-145-5p 的表達均下調；當過表達這 2 種 miR 時，則可明顯抑制 RCC 細胞的遷移能力[17]。在另一項胃癌的研究[18]中，miR-141 通過靶向轉錄共激活因子與 PDZ 結合基序，從而抑制腫瘤生長和轉移。然而，另外一項研究[19]發現，miR-141-3p 作為致癌基因促進前列腺癌細胞的增殖。這些研究表明，了解 miR-141-3p 功能最好的方法是研究其在特定腫瘤中的作用。在本研究中，筆者團隊發現，體外實驗中過表達 miR-141-3p 可抑制 HCC 細胞的增殖、侵襲及遷移，這表明 miR-141-3p 在 HCC 進展中作為抑癌基因發揮功能。
本研究的體外實驗結果表明，GP73 部分但不完全逆轉 miR-141-3p 對 HCC 的抑制作用。這與之前有關 miR-141-3p 通過多種不同基因調控 HCC 進展的研究[20-23]結果相一致。miR-141-3p 下調精子相關抗原 9（SPAG9）的表達后，再通過抑制 c-Jun 氨基末端激酶（JNK）通路而抑制 HCC 細胞的侵襲和轉移[24]。另一項研究[25]表明，miR-141-3p 下調 T 淋巴瘤侵襲轉移誘導因子 1（Tiam1）蛋白的表達并抑制 HCC 細胞的侵襲和遷移。這提示，進一步對其他基因的調控及分子途徑激活的研究將有助于更深入了解 miR-141-3p 在 HCC 進展中的重要作用。
總之，本研究發現，miR-141-3p 作為抑癌基因，通過靶向調控 GP73 進而抑制 HCC 的進展。miR-141-3p-GP73 通路有希望成為 HCC 治療的新靶點。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：李學華、邢玉輝及劉志恒涉及實驗的具體操作及實施，并撰寫論文；姜小紅和侯旭，負責實驗設計、數據統計、整理及論文撰寫。
倫理聲明：本研究已通過聊城市人民醫院的倫理審核批準（批準文號：2016031）。
肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常見的惡性腫瘤致死病因之一[1]。其發展是一個多步驟、多因素相互作用的復雜過程，涉及許多癌基因和（或）抑癌基因的失調[2]。了解 HCC 發展的潛在機制對于開展新的治療方法非常重要。高爾基體蛋白 73（Golgi protein 73，GP73）是一種高爾基體糖蛋白，主要在膽管上皮細胞中表達，而在正常肝臟的肝細胞中則很少見[3]。有研究[4-6]表明，GP73 可作為一種新的 HCC 血清標志物。在之前的薈萃分析中，筆者團隊[7]發現，GP73 與中國 HCC 患者肝切除術后的預后不良密切相關。然而，GP73 在 HCC 發生、發展及轉移中的上下游調控因子尚未完全確定。微小 RNA（miR）是小的非編碼 RNA，長度約為 22 個核苷酸，其在多種生理和病理過程中發揮著關鍵作用[8-9]。越來越多的研究[8-9]表明，異常的 miR 水平與人類各種疾病（如癌癥）密切相關，這為開展新的診斷、治療及預后策略研究提供了新的途徑。近年來的大量研究[9-11]發現，HCC 的發生發展與許多 miR 相關，包括 miR-148a、miR-124、miR-203、miR-138、miR-122、miR-30a-5p 等，但 miR 在 HCC 進展和轉移中的作用仍未完全了解。鑒于 GP73 在 HCC 的診斷和預后中的重要作用[4-7]，筆者預測了可以靶向調控 GP73 的 miRs；在生物信息學分析中，筆者團隊發現，miR-141-3p 可能調節 GP73。因此，本研究選擇在 HCC 中進一步研究 miR-141-3p。在這項研究中，筆者團隊通過體外研究初步證明，miR-141-3p 抑制 HCC 的發展和轉移，且 GP73 過表達可部分逆轉此過程。
1 材料與方法
1.1 研究對象
回顧性收集聊城市人民醫院肝膽外科于 2008 年 1 月至 2015 年 6 月期間通過手術切除治療的 56 例 HCC 及其配對的癌旁組織標本（距離腫瘤邊緣以遠 2 cm）；在切除后 30 min 內，將標本快速冷凍并儲存在–80℃液氮中。56 例患者中，男 30 例，女 26 例，男女比為 1.2∶1.0；年齡 33～74 歲，中位年齡為 50 歲。HCC 直徑 2～13 cm，中位數為 5.6 cm，其中≤5 cm 14 例；臨床 TNM 分期：Ⅰ期 5 例，Ⅱ期 6 例，Ⅲ期 41 例，Ⅳ期 4 例；腫瘤分化等級依據肝癌的 Edmondson-Steiner 病理分級劃分：Ⅰ級 4 例，Ⅱ級 20 例，Ⅲ級 24 例，Ⅳ級 8 例；血管侵犯 42 例，HBsAg 陽性 48 例，合并肝硬變 42 例。所有患者術前均未接受放療和（或）化療。所有標本均經病理科病理確診并經患者知情同意后獲得。
1.2 主要材料、試劑和設備
各 HCC 細胞系（包括 HepG2、PLC、Huh-7、MHCC-97H 和 HCC-LM3 細胞系）、正常肝細胞細胞系 LO2 和人胚腎（HEK）293T 細胞系來自 ATCC 細胞庫（美國）。Trizol 及 Lipofection2000 購于美國 Invitrogen 公司，DMEM 或 RPMI-1640 培養基系美國賽默飛世爾科技公司產品，RT-PCR 試劑盒、Reverse Transcriptase 試劑盒、Q-PCR 熒光染料 SYRR Green 及 miRs PrimeScript RT reagent Kit 購于日本 TaKaRa 公司，hsa-miR-141-3p 引物和內源性 U6 購于廣州復能基因公司，Anti-GP73 羊多抗購于美國 Santa 公司，抗 GAPDH 購于美國 Invitrogen 公司，熒光定量 PCR 儀購于美國 ABI 公司，Transwell 小室購于美國康寧公司，噻唑藍（MTT）試劑盒購于日本西格瑪奧德里奇公司，二甲基亞礬（DMSO）購于上海生工公司，熒光素酶報告載體 psiCHECK-2 購于美國 Promega 公司，EdU Apollo?488 體外成像試劑盒系中國 Ribobio 公司產品，Alpha FluorChem E 系統系美國 ProteinSimple 公司產品。
1.3 細胞培養
HCC 細胞系（包括 MHCC-97H、HCC-LM3、HepG2、PLC 和 Huh-7）、正常肝細胞細胞系 LO2 和人胚腎（HEK）293T 細胞系，在 37℃，5% CO2 及補充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-鏈霉素的 DMEM 或 RPMI-1640 培養基中培養。
1.4 RNA 抽提、逆轉錄反應及 qRT-PCR 檢測
參照 Trizol 說明書從冷凍肝組織和培養的細胞中提取總 RNA。在定量 RNA 濃度后，根據制造商的說明書使用 Reverse Transcriptase 試劑盒構建 cDNA 文庫。使用 Q-PCR 試劑盒檢測 GP73 mRNA 和 miR-141-3p 的表達水平，并使用內源性 U6 進行標準化。GP73 基因的上游引物：5′-CAGCGCTGATTTTGAGATGA-3′，下游引物：5′-ATGATCCGTGTCTGGAGGTC-3′，擴增長度為 156 bp。內參 α-tubulin 的上游引物：5′-CACCCGTCTTCAGGGCTTCTTGGTTT-3′，下游引物：5′-CATTTCACCATCTGGTTGGCTGGCTC-3′，擴增長度為 527 bp。miR-141-3p 引物購于廣州復能基因公司，使用專利算法設計并經過實驗確證，說明書中未提供。mRNA 的表達水平使用 2–△△CT方法計算。各細胞系中 miR-141-3p 的表達水平的檢測均重復檢測 3 次。
1.5 Western blot 檢測
將組織或培養的細胞在 RIPA 緩沖液中裂解并離心以收集上清液（4℃，12 000 r/min 離心 5 min，r=9.5 cm）。使用標準 Western blot 方案分離蛋白。雜交一抗，包括抗 GP73 及抗 GAPDH，然后與相應的二抗孵育，最后使用 Alpha FluorChem E 系統使結合的蛋白可視化。
1.6 選擇調節 GP73 的 miR
miR 是 HCC 發展中的重要調節因子。為了尋找在 HCC 中調節 GP73 的潛在 miR，本研究通過 microRNA.org 數據庫、TargetScanHuman 7.1 及 MIRDB 來預測靶向 GP73 的 miR。使用 DIANA-TarBase v7.0 和 KEGG pathway 數據庫對上述 miR 進一步分析，以探索調節 GP73 的 miR。
1.7 雙熒光素酶報告基因實驗
為了驗證上述選擇的 miR 與 GP73 的靶向調節關系，本研究擴增并克隆了 GP73 野生型 3′UTR（UTR 為非翻譯區），包括 miR-141-3p 的預測結合位點和兩個突變體，并將上述 DNA 片段克隆至熒光素酶報告載體 psiCHECK-2。將 293T 細胞以 1×106 個/孔的密度接種在 24 孔板中，在 37℃、5% CO2 條件下培養 24 h。在細胞生長至細胞密度達到 50% 時，混勻 1.5 μg Lipofectamine 2000、GP73-WT（GP73 野生型）/GP73-MT1（GP73 突變型 1）/GP73-MT2（GP73 突變型 2）和 50 mmol/L miR-141-3p 模擬物（mimics）、空載體或陰性對照（miR-NC）后共轉染細胞，即分為 7 組：空載體+mimics 組、GP73-WT+mimics 組、GP73-WT+miR-NC 組、GP73-MT1+miR-NC 組、GP73-MT1+mimics 組、GP73-MT2+miR-NC 組和 GP73-MT2+mimics 組。轉染后 48 h，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌細胞，并在 Passive Lysis 緩沖液中裂解 15 min，然后在 4℃下以 12 000 r/min 離心 2 min（r=9.5 cm）。每組 3 個復孔。根據雙熒光素酶報告載體制造商的說明書收集細胞上清液用于熒光素酶測定。
1.8 細胞增殖試驗
為了檢測 miR-141-3p 對 HCC 細胞活力和增殖速率的影響，分別進行 MTT 和 EdU 測定。在 MTT 測定中，將 Huh-7 和 MHCC-97H 細胞（在肝癌細胞系中，Huh-7 及 MHCC-97H 細胞侵襲性相對較高，具有代表性）以 2×103 個細胞/孔的密度接種在 96 孔板中，每種細胞系分為 3 組，每組 5 個復孔，在培養 24 h 后轉染。空白對照組不加入任何試劑、miR-NC 組加入 100 μL 的陰性對照 miR，miR-141-3p 組加入 100 μL 的 miR-141-3p 慢病毒載體。轉染 1 d 后檢測細胞中 miR-141-3p 的表達水平。根據試劑盒說明書在轉染第 1、2、3 和 4 天測量 Huh-7 細胞的吸光度（A）值，以反映細胞增殖率。
在 EdU 測定中，細胞分組同 MTT 測定，分別用 miR-141-3p 和陰性對照 miR 轉染 Huh-7 和 MHCC-97H 細胞。溫育 24 h 后，將細胞以 6×103個/孔的密度接種在 96 孔板中，并向每個孔中加入新鮮制備的 50 μmol EdU 100 μL。在 EdU 標記 3 h 后，洗滌細胞，固定并用 Hoechst 33342 復染。使用 EdU Apollo?488 體外成像試劑盒獲得圖像。細胞增殖率為增殖細胞（EdU 陽性細胞）占視野下細胞總數的百分比（1 個視野，200 倍）。將沒有慢病毒轉染的細胞作為空白對照組。每組 5 個復孔，每種條件復測 3 次（取均值）。
1.9 Transwell 侵襲遷移實驗
Transwell 侵襲遷移實驗時，MHCC-97H 細胞分組及轉染操作同 MTT 實驗部分（MHCC-97H 細胞侵襲性較 Huh-7 更強，更具有代表性，故本部分實驗選擇該類型細胞系），每組 5 個復孔。轉染 24 h后，將細胞以 1×105 個/孔接種在涂有基質膠的 Transwell 的上室中，將其插入 24 孔板中用于侵襲實驗。下室含有補充有 5% FBS 的培養基。培養 24 h后，將遷移的細胞用 0.1% 結晶紫染色 20 min 后，以 PBS 清洗 2 次，在 400 倍顯微鏡下隨機選取觀察 3 個不同視野的細胞數計數，取均值。
遷移實驗步驟與以上侵襲實驗基本一致，但本部分實驗中，筆者團隊在未涂基質膠的 Transwell 上室接種 1×106 個細胞/孔并向下室添加含有 2.5% FBS 的培養基。
在細胞功能學回復實驗部分，筆者團隊在陰性對照 miR 模擬物組（加入 mimic NC）、空白對照組（未加入任何試劑）及 miR-141-3p 組（加入 miR-141-3p 慢病毒載體）基礎上，又增加 miR-141-3p+GP73-NC 組（miR-141-3p 慢病毒載體+空質粒）及 miR-141-3p+GP73 組（miR-141-3p 慢病毒載體+GP73 質粒）。轉染 24 h 后，將細胞以 1×105 個/孔接種在 Transwell 上室中，具體步驟與以上實驗基本一致。
1.10 統計學方法
使用 SPSS 18.0 軟件進行統計分析。以均值±標準差（±s）表示計量資料。HCC 組及其癌旁組織標志物表達水平的比較采用配對 t 檢驗；多組比較采用方差分析（兩兩比較采用 LSD-t 檢驗方法）；兩參數間的關系應用 Pearson 簡單相關進行分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 GP73 mRNA 及其蛋白在 HCC 組織中的表達顯著上調
在本研究中，筆者團隊首先檢測了 1 組 HCC 癌組織及其配對的癌旁組織中 GP73 mRNA 的表達，qRT-PCR 結果顯示，HCC 組織中 GP73 mRNA 的表達水平與鄰近的癌旁組織相比，GP73 mRNA 的表達顯著上調（P<0.05）），見圖 1a。Western blot（圖 1b）結果證實，GP73 蛋白的表達水平在 HCC 組織中也顯著上調。
圖1
示 HCC 組織及其癌旁組織中 GP73 mRNA 及其蛋白的表達、3 類數據庫均可預測到的共同交叉 miR、miR-141-3p 模擬物或陰性對照的共轉染結果、HCC 細胞系和臨床標本中 miR-141-3p 的表達水平、HCC 組織中 miR-141-3p 與 GP73 mRNA 表達關系的散點圖、轉染后 HCC 細胞中 miR-141-3p 的表達及 miR-141-3p 對 Huh-7 細胞增殖能力的影響
a 和 b：HCC 組織及其癌旁組織中 GP73 mRNA（a）及其蛋白（b）的表達，T 表示 HCC 組織，A 表示癌旁組織；c：3 類數據庫預測的 miR 結果；d：miR-141-3p 模擬物或陰性對照的共轉染結果，與其他組別比較，*
2.2 miR-141-3p 靶向 GP73 且與 HCC 組織中 GP73 mRNA 的表達水平呈負相關
microRNA.org 數據庫、TargetScanHuman 7.1 及 MIRDB 均可預測到的 miR 有 5 種，分別是 miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-342-3p、miR-141-3p 及 miR-143-3p，其預測結果見圖 1c。使用 DIANA-TarBase v7.0 和 KEGG pathway 數據庫對上述 miR 進一步分析，結果顯示，miR-141-3p 具有最高的調節 GP73 的潛力。因此，本研究選擇在 HCC 中研究 miR-141-3p 靶向 GP73 的調節作用。miR-141-3p 模擬物或陰性對照的共轉染結果顯示（圖 1d），GP73-WT+mimics 組的相對熒光素酶活性低于其余 6 組（P<0.05），但其余 6 組比較差異無統計學意義（P>0.05），表明 GP73-WT 的 3′UTR 活性被 miR-141-3p 模擬物影響后顯著降低，然而對突變體的 3′UTR 并未發現顯著影響，這表明 miR-141-3p 通過與 3′UTR 結合直接調節 GP73。
2.3 HCC 細胞系和臨床標本中 miR-141-3p 的表達水平
2.3.1 不同 HCC 細胞系、HCC 組織及其癌旁組織中 miR-141-3p 的表達水平
為了評估 miR-141-3p 在 HCC 進展中的變化，本研究首先檢測了不同 HCC 細胞系中 miR-141-3p 的表達水平。本研究以 miR-141-3p 在 LO2 中的表達水平作為對照，設定其相對表達量為 1。結果表明，與正常肝細胞系 LO2 相比，各 HCC 細胞系中 miR-141-3p 的表達水平均降低（圖 1e）。有趣的是，即使在 HCC 細胞系中，miR-141-3p 的表達水平也存在統計學上的差異：在高侵襲性 HCC 細胞系（MHCC-97H、HCC-LM3 和 Huh-7）中，其 miR-141-3p 的表達水平低于 HepG2 和 PLC 細胞系（P<0.05），且 Huh-7、MHCC-97H 和 HCC-LM3 的表達水平依次降低，兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05），但 HepG2 和 PLC 細胞系比較差異無統計學意義（P>0.05）。這與臨床獲取的 HCC 標本中的 miR-141-3p 表達水平的檢測結果相一致：HCC 組織中 miR-141-3p mRNA 的表達水平低于匹配的相鄰癌旁組織中的表達水平（圖 1f），顯示出與 GP73 mRNA 截然相反的表達模式（圖 1a）。Pearson 簡單相關分析結果表明，在 HCC 腫瘤標本中，miR-141-3p 的表達水平和 GP73 mRNA 的表達水平之間存在負相關（r=0.673，P<0.01），見圖 1g。
2.3.2 miR-141-3p 的表達與 HCC 臨床病理學特征的關系
本研究進一步分析 HCC 組織中 miR-141-3p表達與 HCC 進展之間的關系，包括 miR-141-3p 表達與患者年齡、性別、臨床 TNM 分期、腫瘤分化等級、血管侵犯、腫瘤直徑、HBsAg、AFP 等不同臨床病理學特征或參數的關系，以 HCC 組織中 miR-141-3p 的相對表達水平的均數為基線，分為 miR-141-3p 高表達及低表達組。結果表明，miR-141-3p 低表達與較晚的臨床 TNM 分期（P=0.006），低分化的腫瘤（P=0.002）和血管浸潤性腫瘤（P=0.003）相關，而與其他臨床病理學因素，包括年齡、性別、腫瘤直徑、HBsAg、AFP 水平和肝硬變均無關（P>0.05），具體見表 1。
表1
HCC 組織中 miR-141-3p 的表達與其臨床病理學特征的關系（例）
2.4 miR-141-3p 的過表達抑制 HCC 細胞的增殖、侵襲和遷移
為了深入了解 miR-141-3p 在 HCC 進展中的作用，接下來，我們利用 miR-141-3p 慢病毒轉染了 Huh-7 和 MHCC-97H 細胞。qRT-PCR 結果顯示，不管是在 Huh-7 細胞還是在 MHCC-97H 細胞中，與空白對照組和 miR-NC 組相比，miR-141-3p 組的 miR-141-3p 的表達水平均較高（P<0.05），但空白對照組與 miR-NC 組比較差異無統計學意義（P>0.05），提示 2 種細胞系在誘導后其 miR-141-3p 水平明顯升高（圖 1h），這也證實了 miR-141-3p 慢病毒的轉染效率。
在 Huh-7 細胞的 MTT 實驗中，從第 2 天開始，與空白對照組和 miR-NC 組相比，miR-141-3p 組的細胞增殖率均較低（P<0.05），且在第 4 天觀察到最強的抑制（圖 1i），但同時點空白對照組與 miR-NC 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。
EdU 實驗結果顯示，不管是在 Huh-7 細胞還是在 MHCC-97H 細胞中，與空白對照組和 miR-NC 組相比，miR-141-3p 組的 EdU 陽性細胞比例均較低（P<0.05），但空白對照組與 miR-NC 組比較差異無統計學意義（P>0.05），提示在 Huh-7 和 MHCC-97H 細胞中觀察到 miR-141-3p 過表達后的一致抑制作用（圖 2a–2h）。
圖2
示 EdU 檢測結果（ ×200）、Transwell 侵襲遷移實驗及細胞功能學回復實驗結果
a–h：Huh-7 細胞和 MHCC-97H 細胞中，空白對照組（Huh-7 細胞：a；MHCC-97H 細胞：e）、miR-NC 組（Huh-7 細胞：b；MHCC-97H 細胞：f）和 miR-143-3p 組（Huh-7 細胞：c；MHCC-97H 細胞：g）的 EdU 陽性細胞染色結果和計數結果（Huh-7 細胞：d；MHCC-97H 細胞：h），與其余 2 組比較，*
2.5 miR-141-3p 過表達抑制 HCC 細胞的侵襲和遷移
通過以上不同方法，本研究證明了 miR-141-3p抑制 HCC 細胞的增殖。本研究進一步分析了 miR-141-3p 過表達對 HCC 細胞侵襲和遷移潛能的影響。Transwell 侵襲遷移實驗結果（圖 2i 和 2j）表明，與空白對照組和 miR-NC 組比較，miR-141-3p 組的細胞計數均較低（P<0.05），但空白對照組與 miR-NC 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。該結果表明，體外 miR-141-3p 過表達顯著抑制 HCC 細胞的侵襲和遷移潛力。
2.6 GP73 蛋白可部分逆轉 miR-141-3p 在 HCC 細胞中的抑制作用
在前面的研究中，本研究首先探討了 GP73 是否是 miR-141-3p 的靶標，并發現 GP73 和 miR-141-3p在 HCC 進展中的表達呈負相關。為了更好地理解 2 種基因在 HCC 進展中的機制作用，本研究用 miR-141-3p 慢病毒和表達 GP73 的質粒或空載體共轉染 MHCC-97H 細胞。細胞功能學回復實驗結果表明，在侵襲遷移實驗中，與空白對照組和 miR-NC 組比較，miR-141-3p 組、miR-141-3p+GP73-NC 組及 miR-141-3p+GP73 組的細胞計數均較低（P<0.05），但空白對照組與 miR-NC 組比較、miR-141-3p 組和 miR-141-3p+GP73-NC 組比較差異均無統計學意義（P>0.05）；miR-141-3p 組及miR-141-3p+GP73-NC 組分別與miR-141-3p+GP73 組比較差異具有統計學意義（侵襲實驗 P<0.001，遷移實驗 P<0.05）。這說明，表達 GP73 的質粒可導致 miR-141-3p 抑制細胞侵襲和遷移的潛力部分喪失（圖 2k 和圖 2l）。
3 討論
鑒于 GP73 是 HCC 診斷和預后的特異性血清標志物，在本研究中，筆者團隊選擇了 GP73 作為靶基因來預測參與 HCC 發展的上游 miR。通過搜索不同的數據庫，本研究發現，miR-141-3p 具有調節 GP73 表達和影響 HCC 進展的最大潛力。qRT-PCR 結果顯示，miR-141-3p 的表達水平與 GP73 mRNA 的表達呈負相關。此外，通過分析臨床病理學特征，本研究發現，miR-141-3p 低表達與 HCC 進展顯著相關，這與最近的報道[12]一致，即 miR-141-3p 的表達下調可能是 HCC 高侵襲性的原因。miR-141 與 miR-200c 一起形成簇，均屬于 miR-200 家族[13]。既往研究[14]發現，血液循環中 miR-141 及 miR-200c 的水平在 HCC 患者中顯著升高。因此，本研究結果與之前的研究結果共同揭示了 miR-141-3p 在 HCC 患者的診斷和復發監測中的明確意義；同時，miR-141-3p 也可能被認為是未來 HCC 患者的治療靶標。
miR 在轉錄水平上可以通過與靶基因啟動子結合，激活或抑制靶基因[15]；而在轉錄后水平上 miR 可以抑制靶基因翻譯或通過結合其 3′UTR 區域引起靶 mRNA 降解[16]。在本研究中，熒光素酶測定結果顯示，miR-141-3p 模擬物顯著抑制 GP73 野生型的 3′UTR 活性，然而對突變型卻未發現明顯影響，這表明 miR-141-3p 在轉錄后水平上靶向調控 GP73。
既往的研究[17-19]表明，miR-141 在多種惡性腫瘤中的作用是有爭議的。在晚期腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）中，miR-141-3p 與 miR-145-5p 的表達均下調；當過表達這 2 種 miR 時，則可明顯抑制 RCC 細胞的遷移能力[17]。在另一項胃癌的研究[18]中，miR-141 通過靶向轉錄共激活因子與 PDZ 結合基序，從而抑制腫瘤生長和轉移。然而，另外一項研究[19]發現，miR-141-3p 作為致癌基因促進前列腺癌細胞的增殖。這些研究表明，了解 miR-141-3p 功能最好的方法是研究其在特定腫瘤中的作用。在本研究中，筆者團隊發現，體外實驗中過表達 miR-141-3p 可抑制 HCC 細胞的增殖、侵襲及遷移，這表明 miR-141-3p 在 HCC 進展中作為抑癌基因發揮功能。
本研究的體外實驗結果表明，GP73 部分但不完全逆轉 miR-141-3p 對 HCC 的抑制作用。這與之前有關 miR-141-3p 通過多種不同基因調控 HCC 進展的研究[20-23]結果相一致。miR-141-3p 下調精子相關抗原 9（SPAG9）的表達后，再通過抑制 c-Jun 氨基末端激酶（JNK）通路而抑制 HCC 細胞的侵襲和轉移[24]。另一項研究[25]表明，miR-141-3p 下調 T 淋巴瘤侵襲轉移誘導因子 1（Tiam1）蛋白的表達并抑制 HCC 細胞的侵襲和遷移。這提示，進一步對其他基因的調控及分子途徑激活的研究將有助于更深入了解 miR-141-3p 在 HCC 進展中的重要作用。
總之，本研究發現，miR-141-3p 作為抑癌基因，通過靶向調控 GP73 進而抑制 HCC 的進展。miR-141-3p-GP73 通路有希望成為 HCC 治療的新靶點。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：李學華、邢玉輝及劉志恒涉及實驗的具體操作及實施，并撰寫論文；姜小紅和侯旭，負責實驗設計、數據統計、整理及論文撰寫。
倫理聲明：本研究已通過聊城市人民醫院的倫理審核批準（批準文號：2016031）。
