引用本文： 于婧, 王鳳琴, 姚文娟, 吳冬梅, 劉大鵬. BRAFV600E 基因突變在 FNAB 易漏診的高危甲狀腺結節中的診斷價值. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(9): 1083-1086. doi: 10.7507/1007-9424.201904098 復制
臨床可觸及或超聲檢查發現的甲狀腺結節的發病率逐年升高，大多數甲狀腺結節是良性的，惡性甲狀腺腫瘤占 5%～15%[1]。醫生面臨的挑戰是如何區分良性和惡性甲狀腺病變，以確保每位患者得到及時和適當的治療，同時盡量減少不必要的干預風險。超聲引導下細針穿刺活檢（fine-needle aspiration biopsy，FNAB）是目前最可靠的方法，已被應用于國內臨床診斷工作中，然而其局限性包括無法診斷的樣本、意義不明的非典型病變及存在假陰性和假陽性結果，占全部 FNAB 結果的 10%～40%[2]。FNAB 樣本的分子檢測已成為補充常規細胞學檢查的重要工具[3]。鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌基因同源體 B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）V600E 基因突變作為甲狀腺乳頭狀癌的特異性標志物，具有較高的陽性預測值（95.5%～100.0%）[4-5]。本研究擬檢測 FNAB 易漏診的具有高危超聲特征的甲狀腺結節中的 BRAFV600E 基因突變情況，對比聯合 FNAB 和 BRAFV600E 基因突變檢測與單獨 FNAB 的術后病理符合率，以分析 BRAFV600E 基因突變檢測的診斷價值。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
回顧性收集河北中石油中心醫院于 2017 年1 月至 2018 年 12 月期間收治的術前進行超聲檢查且 FNAB 檢測非陽性結果的甲狀腺結節病例 122 例。納入標準：① FNAB 為非陽性細胞學結果（包括無法診斷或不滿意標本、良性病變及意義不明的非典型病變）；② 超聲高危結果：甲狀腺影像報告和數據系統（thyroid imaging reporting and data system，TI-RADS）分級 Ⅳ～Ⅴ 級，即提示至少1 項惡性征象（如實性結節、低回聲、邊界不清、微鈣化、富于血供、縱橫比≥1 等）；③ 為初治病例，術前未行射頻消融、外照射、131I 治療、化學治療等其他輔助治療；④ 可追蹤到術后病理結果。排除標準：① 雙盲法復閱 FNAB 薄片結果有爭議的；② 臨床病理資料不完整者。122 例患者的年齡為 17～66 歲、（40±14）歲；男 43 例，女 79 例；單一結節 105 例，多結節 17 例；結節直徑 2～18 mm、（9.68±4.47）mm；FNAB 結果：無法診斷或不滿意標本 25 例，良性病變 20 例，意義不明的非典型病變 77 例；超聲 TI-RADS 分級：ⅣA 級 91 例，ⅣB 級 21 例，Ⅴ級 10 例；術后病理學類型：良性病變 85 例，甲狀腺乳頭狀癌 37 例（其中包括微小甲狀腺乳頭狀癌 12 例，濾泡亞型 2 例）。
1.2 FNAB
患者取仰臥位，頭后仰，頸部墊高，充分暴露甲狀腺，采用超聲確定穿刺結節的部位及深度后消毒，在超聲引導下用負壓穿刺器反復不同角度抽吸 3～5 次，穿刺物立即置入液基保存液中，由康柏氏自動薄層液基細胞制片系統制成薄層細胞片，行巴氏染色，經兩名病理醫生以雙盲法閱片。FNAB 細胞學診斷參照 Bethesda 報告系統標準[6]，分為：無法診斷或不滿意標本、良性病變、意義不明的非典型病變、濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤、可疑惡性腫瘤及惡性腫瘤。
1.3 BRAF 基因檢測
按照上海凱杰（QIAGEN）公司的 DNA 提取試劑盒說明書提取液基保存液中剩余標本的 DNA，立即進行 PCR 檢測。按照上海源奇生物醫藥科技有限公司的腫瘤相關基因突變檢測人 BRAF 試劑盒說明（PCR 熒光探針法），行 PCR 擴增，再利用實時熒光 Taqman 探針法，通過熒光信號的變化，檢測標本的 BRAFV600E 基因突變。每次試驗必須同時進行陽性對照和陰性對照檢測。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件包行統計學處理。定量資料比較采用成組 t 檢驗，計數資料比較采用成組 χ2 檢驗、配對 χ2 檢驗或連續性校正的 χ2 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 BRAFV600E 基因突變檢測結果
122 例甲狀腺結節病例中，BRAFV600E 基因突變率為 27.0%（33/122）。BRAFV600E 基因突變陽性率隨著超聲 TI-RADS 分級的增高而增高（P<0.05），而與患者年齡、性別、結節數目、結節直徑及 FNAB 結果均無關（P>0.05），見表 1。
表1
122 例甲狀腺結節的 BRAFV600E基因突變檢測結果
2.2 FNAB 聯合 BRAFV600E 基因突變檢測對術后病理符合率的影響
122 例甲狀腺結節的術后病理結果：良性病變 85 例，甲狀腺乳頭狀癌 37 例（包括微小甲狀腺乳頭狀癌 12 例，濾泡亞型 2 例）。FNAB 檢測參照 Bethesda 報告系統標準全部為非陽性結果：無法診斷或不滿意標準 25 例，良性病變 20 例，意義不明的非典型病變 77 例。術后病理為良性者判定為符合，符合率為 69.7%（85/122）；術后病理為癌者判定為不符合，即假陰性結果，假陰性率為 100%（37/37）。具體見表 2。
表2
單獨 FNAB 檢測與術后病理檢查結果
FNAB 聯合 BRAFV600E 基因突變檢測時，二者至少 1 項陽性者為陽性結果，其術后病理診斷為甲狀腺癌者判定為符合，否則為不符合；FNAB 檢測結果為非陽性且 BRAFV600E 基因突變陰性時為陰性結果，若其術后病理為良性則判定為符合，否則不符合。本研究結果顯示，FNAB 聯合 BRAFV600E 基因突變檢測結果與術后病理的符合率為 86.9%（106/122），假陰性率為 27.0%（10/37），假陽性率為 7.1%（6/85），具體見表 3。6 例假陽性樣本的術后病理：2 例慢性淋巴細胞性甲狀腺炎，3 例結節性甲狀腺腫，1 例伴乳頭狀核特征的非浸潤性濾泡性腫瘤；10 例假陰性樣本經其他機構檢測出 2 例 RAS 基因突變，沒有發現 RET/PTC 基因重排。FNAB 聯合 BRAFV600E 基因突變檢測的符合率高于單獨 FNAB 檢測，差異有統計學意義（χ2=10.630，P=0.001）。
表3
FNAB 聯合 BRAFV600E 基因突變檢測與術后病理檢查結果
3 討論
根據 2016 年美國臨床內分泌學會、美國內分泌學院和美國醫學會的內分泌指南，具有高度可疑超聲特征的甲狀腺結節，惡性腫瘤的風險為 50%～90%[7]。FNAB 是目前甲狀腺結節診斷中可靠的非手術方法，然而它并不是一種精準的檢測方法，部分病例無法明確診斷，假陰性率為 3.6%～10.2%[8]，這些不明確或假陰性的診斷會使隨后的臨床治療復雜化。當超聲學和細胞學檢測結果不一致時，以往的方法是超聲隨診、重復 FNAB 或診斷性切除[9]。
文獻[10-12]報道，BRAF 基因 V600E 點突變是甲狀腺乳頭狀癌最常見的分子遺傳學事件，其突變率為 69%～85.3%。BRAF 基因突變模式涵蓋 65 余種，大部分位于 15 外顯子的催化激酶區，即 V600E 點突變。BRAFV600E 基因突變導致 BRAF 蛋白激酶過度表達，異常激活有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路[13]，進而影響多種復雜途徑，導致腫瘤細胞增生，如抑制鈉/碘共轉運蛋白（NIS）的表達和放射性碘的攝取[14]，誘導炎癥介質的表達[15-16]，改變細胞外基質蛋白骨橋蛋白的表達水平及影響細胞膜整合素受體的表達[17]。BRAFV600E 基因突變甲狀腺乳頭狀癌具有高侵襲潛能及淋巴結轉移的風險[18]，成為近年來靶向治療研究的靶點[19-20]。因此，BRAFV600E 基因突變檢測對甲狀腺乳頭狀病變的良惡性鑒別診斷具有良好的應用價值，同時可作為獨立的預后因子提示不良預后[21]。
經 FNAB 不能確診的甲狀腺結節，補充 BRAFV600E 基因突變檢測能提高診斷的敏感性[22-23]，且有助于預測甲狀腺乳頭狀癌淋巴結轉移，便于制定手術方案[24-25]。Chen 等[26]的一項前瞻性研究中，292 例具有高危超聲特征的良性細胞學結果的甲狀腺結節中，檢測出 36 例 BRAFV600E 突變陽性，術后 31 例為甲狀腺癌，故 BRAFV600E 基因檢測降低了細胞學的假陰性率。本研究對 122 例 FNAB 為非陽性細胞學結果且具有高危超聲特征的甲狀腺結節進行了 BRAFV600E 基因突變檢測，與術后病理對比發現，FNAB 聯合 BRAFV600E 基因突變檢測的符合率（86.9%）高于單獨 FNAB 檢測的符合率（69.7%），BRAFV600E 基因突變檢測可發現 FNAB 可能漏診的甲狀腺乳頭狀癌，這與文獻[26]報道一致。
筆者建議，在具有超聲高危特征的甲狀腺結節中，常規行 FNAB 檢測的同時進行 BRAFV600E 基因突變檢測，并積極分析甲狀腺癌相關的其他基因，如 RAS 基因突變和 RET/PTC 重排，有助于提高檢測的準確性。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：于婧負責論文撰寫和試驗數據分析，王鳳琴和姚文娟負責論文審修，吳冬梅協助試驗設計及查閱文獻，劉大鵬負責收集患者資料。
倫理聲明：本研究已通過河北中石油中心醫院的倫理審核批準。
志謝：感謝河北中石油中心醫院病理科所有技師在制片和試驗中給予的幫助。
臨床可觸及或超聲檢查發現的甲狀腺結節的發病率逐年升高，大多數甲狀腺結節是良性的，惡性甲狀腺腫瘤占 5%～15%[1]。醫生面臨的挑戰是如何區分良性和惡性甲狀腺病變，以確保每位患者得到及時和適當的治療，同時盡量減少不必要的干預風險。超聲引導下細針穿刺活檢（fine-needle aspiration biopsy，FNAB）是目前最可靠的方法，已被應用于國內臨床診斷工作中，然而其局限性包括無法診斷的樣本、意義不明的非典型病變及存在假陰性和假陽性結果，占全部 FNAB 結果的 10%～40%[2]。FNAB 樣本的分子檢測已成為補充常規細胞學檢查的重要工具[3]。鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌基因同源體 B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）V600E 基因突變作為甲狀腺乳頭狀癌的特異性標志物，具有較高的陽性預測值（95.5%～100.0%）[4-5]。本研究擬檢測 FNAB 易漏診的具有高危超聲特征的甲狀腺結節中的 BRAFV600E 基因突變情況，對比聯合 FNAB 和 BRAFV600E 基因突變檢測與單獨 FNAB 的術后病理符合率，以分析 BRAFV600E 基因突變檢測的診斷價值。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
回顧性收集河北中石油中心醫院于 2017 年1 月至 2018 年 12 月期間收治的術前進行超聲檢查且 FNAB 檢測非陽性結果的甲狀腺結節病例 122 例。納入標準：① FNAB 為非陽性細胞學結果（包括無法診斷或不滿意標本、良性病變及意義不明的非典型病變）；② 超聲高危結果：甲狀腺影像報告和數據系統（thyroid imaging reporting and data system，TI-RADS）分級 Ⅳ～Ⅴ 級，即提示至少1 項惡性征象（如實性結節、低回聲、邊界不清、微鈣化、富于血供、縱橫比≥1 等）；③ 為初治病例，術前未行射頻消融、外照射、131I 治療、化學治療等其他輔助治療；④ 可追蹤到術后病理結果。排除標準：① 雙盲法復閱 FNAB 薄片結果有爭議的；② 臨床病理資料不完整者。122 例患者的年齡為 17～66 歲、（40±14）歲；男 43 例，女 79 例；單一結節 105 例，多結節 17 例；結節直徑 2～18 mm、（9.68±4.47）mm；FNAB 結果：無法診斷或不滿意標本 25 例，良性病變 20 例，意義不明的非典型病變 77 例；超聲 TI-RADS 分級：ⅣA 級 91 例，ⅣB 級 21 例，Ⅴ級 10 例；術后病理學類型：良性病變 85 例，甲狀腺乳頭狀癌 37 例（其中包括微小甲狀腺乳頭狀癌 12 例，濾泡亞型 2 例）。
1.2 FNAB
患者取仰臥位，頭后仰，頸部墊高，充分暴露甲狀腺，采用超聲確定穿刺結節的部位及深度后消毒，在超聲引導下用負壓穿刺器反復不同角度抽吸 3～5 次，穿刺物立即置入液基保存液中，由康柏氏自動薄層液基細胞制片系統制成薄層細胞片，行巴氏染色，經兩名病理醫生以雙盲法閱片。FNAB 細胞學診斷參照 Bethesda 報告系統標準[6]，分為：無法診斷或不滿意標本、良性病變、意義不明的非典型病變、濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤、可疑惡性腫瘤及惡性腫瘤。
1.3 BRAF 基因檢測
按照上海凱杰（QIAGEN）公司的 DNA 提取試劑盒說明書提取液基保存液中剩余標本的 DNA，立即進行 PCR 檢測。按照上海源奇生物醫藥科技有限公司的腫瘤相關基因突變檢測人 BRAF 試劑盒說明（PCR 熒光探針法），行 PCR 擴增，再利用實時熒光 Taqman 探針法，通過熒光信號的變化，檢測標本的 BRAFV600E 基因突變。每次試驗必須同時進行陽性對照和陰性對照檢測。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件包行統計學處理。定量資料比較采用成組 t 檢驗，計數資料比較采用成組 χ2 檢驗、配對 χ2 檢驗或連續性校正的 χ2 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 BRAFV600E 基因突變檢測結果
122 例甲狀腺結節病例中，BRAFV600E 基因突變率為 27.0%（33/122）。BRAFV600E 基因突變陽性率隨著超聲 TI-RADS 分級的增高而增高（P<0.05），而與患者年齡、性別、結節數目、結節直徑及 FNAB 結果均無關（P>0.05），見表 1。
表1
122 例甲狀腺結節的 BRAFV600E基因突變檢測結果
2.2 FNAB 聯合 BRAFV600E 基因突變檢測對術后病理符合率的影響
122 例甲狀腺結節的術后病理結果：良性病變 85 例，甲狀腺乳頭狀癌 37 例（包括微小甲狀腺乳頭狀癌 12 例，濾泡亞型 2 例）。FNAB 檢測參照 Bethesda 報告系統標準全部為非陽性結果：無法診斷或不滿意標準 25 例，良性病變 20 例，意義不明的非典型病變 77 例。術后病理為良性者判定為符合，符合率為 69.7%（85/122）；術后病理為癌者判定為不符合，即假陰性結果，假陰性率為 100%（37/37）。具體見表 2。
表2
單獨 FNAB 檢測與術后病理檢查結果
FNAB 聯合 BRAFV600E 基因突變檢測時，二者至少 1 項陽性者為陽性結果，其術后病理診斷為甲狀腺癌者判定為符合，否則為不符合；FNAB 檢測結果為非陽性且 BRAFV600E 基因突變陰性時為陰性結果，若其術后病理為良性則判定為符合，否則不符合。本研究結果顯示，FNAB 聯合 BRAFV600E 基因突變檢測結果與術后病理的符合率為 86.9%（106/122），假陰性率為 27.0%（10/37），假陽性率為 7.1%（6/85），具體見表 3。6 例假陽性樣本的術后病理：2 例慢性淋巴細胞性甲狀腺炎，3 例結節性甲狀腺腫，1 例伴乳頭狀核特征的非浸潤性濾泡性腫瘤；10 例假陰性樣本經其他機構檢測出 2 例 RAS 基因突變，沒有發現 RET/PTC 基因重排。FNAB 聯合 BRAFV600E 基因突變檢測的符合率高于單獨 FNAB 檢測，差異有統計學意義（χ2=10.630，P=0.001）。
表3
FNAB 聯合 BRAFV600E 基因突變檢測與術后病理檢查結果
3 討論
根據 2016 年美國臨床內分泌學會、美國內分泌學院和美國醫學會的內分泌指南，具有高度可疑超聲特征的甲狀腺結節，惡性腫瘤的風險為 50%～90%[7]。FNAB 是目前甲狀腺結節診斷中可靠的非手術方法，然而它并不是一種精準的檢測方法，部分病例無法明確診斷，假陰性率為 3.6%～10.2%[8]，這些不明確或假陰性的診斷會使隨后的臨床治療復雜化。當超聲學和細胞學檢測結果不一致時，以往的方法是超聲隨診、重復 FNAB 或診斷性切除[9]。
文獻[10-12]報道，BRAF 基因 V600E 點突變是甲狀腺乳頭狀癌最常見的分子遺傳學事件，其突變率為 69%～85.3%。BRAF 基因突變模式涵蓋 65 余種，大部分位于 15 外顯子的催化激酶區，即 V600E 點突變。BRAFV600E 基因突變導致 BRAF 蛋白激酶過度表達，異常激活有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路[13]，進而影響多種復雜途徑，導致腫瘤細胞增生，如抑制鈉/碘共轉運蛋白（NIS）的表達和放射性碘的攝取[14]，誘導炎癥介質的表達[15-16]，改變細胞外基質蛋白骨橋蛋白的表達水平及影響細胞膜整合素受體的表達[17]。BRAFV600E 基因突變甲狀腺乳頭狀癌具有高侵襲潛能及淋巴結轉移的風險[18]，成為近年來靶向治療研究的靶點[19-20]。因此，BRAFV600E 基因突變檢測對甲狀腺乳頭狀病變的良惡性鑒別診斷具有良好的應用價值，同時可作為獨立的預后因子提示不良預后[21]。
經 FNAB 不能確診的甲狀腺結節，補充 BRAFV600E 基因突變檢測能提高診斷的敏感性[22-23]，且有助于預測甲狀腺乳頭狀癌淋巴結轉移，便于制定手術方案[24-25]。Chen 等[26]的一項前瞻性研究中，292 例具有高危超聲特征的良性細胞學結果的甲狀腺結節中，檢測出 36 例 BRAFV600E 突變陽性，術后 31 例為甲狀腺癌，故 BRAFV600E 基因檢測降低了細胞學的假陰性率。本研究對 122 例 FNAB 為非陽性細胞學結果且具有高危超聲特征的甲狀腺結節進行了 BRAFV600E 基因突變檢測，與術后病理對比發現，FNAB 聯合 BRAFV600E 基因突變檢測的符合率（86.9%）高于單獨 FNAB 檢測的符合率（69.7%），BRAFV600E 基因突變檢測可發現 FNAB 可能漏診的甲狀腺乳頭狀癌，這與文獻[26]報道一致。
筆者建議，在具有超聲高危特征的甲狀腺結節中，常規行 FNAB 檢測的同時進行 BRAFV600E 基因突變檢測，并積極分析甲狀腺癌相關的其他基因，如 RAS 基因突變和 RET/PTC 重排，有助于提高檢測的準確性。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：于婧負責論文撰寫和試驗數據分析，王鳳琴和姚文娟負責論文審修，吳冬梅協助試驗設計及查閱文獻，劉大鵬負責收集患者資料。
倫理聲明：本研究已通過河北中石油中心醫院的倫理審核批準。
志謝：感謝河北中石油中心醫院病理科所有技師在制片和試驗中給予的幫助。
