引用本文： 王洋, 姚殿波, 吳碩東. 姜黃素能夠抑制脂多糖誘導的內源性 β-葡萄糖醛酸酶的表達上調. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(8): 917-922. doi: 10.7507/1007-9424.201903082 復制
膽管色素結石在中國非常常見[1]，因其病變復雜和復發率高，成為較難治愈的一種良性膽道疾病[2]。研究結石形成的機制，探索預防或干預結石形成的有效方法具有重要的臨床意義[3]。膽管色素結石以膽紅素鈣為主要成分，細菌感染是促進其形成的重要因素[4]。膽道細菌感染后，膽汁中除了外源性 β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase，β-GD）的活性增高以外，內源性 β-GD 的活性也明顯增高，而且有研究[5]提示，內源性 β-GD 在膽色素結石形成中的作用時間可能相對更長。筆者團隊[6]之前的研究發現，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可刺激肝內膽管上皮細胞中內源性 β-GD 表達的上調，具有明顯的濃度依賴性，此外，c-myc 在 LPS 誘導的內源性 β-GD 的表達上調中起著重要作用。進一步探索干預 c-myc 和內源性 β-GD 表達的有效措施，將可能有助于我們今后尋找干預膽管色素結石形成或復發的有效方法。姜黃素通過抗炎、抗氧化、減慢鈣的沉積速率和礦化結節的形成、抑制破骨細胞樣細胞形成等作用，可以抑制腎結石形成過程中的相應環節，具有預防草酸鈣腎結石的潛質[7]。此外，多種腫瘤細胞增殖或凋亡相關研究[8-9]表明，姜黃素可抑制 c-myc 的轉錄或表達，并且具有濃度依賴性。結合筆者團隊之前的研究發現，筆者推測，姜黃素亦可能抑制膽管色素結石的形成，而且可能與抑制由 LPS 刺激的肝內膽管上皮細胞中內源性 β-GD 表達的上調有關。因此，本研究旨在探討姜黃素對 LPS 刺激的肝內膽管上皮細胞中內源性β-GD 表達的影響，為控制膽管色素結石形成和預防結石復發提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗細胞、主要材料、試劑和設備
1.1.1 實驗細胞
人肝內膽管上皮細胞系（HIBEpiC）及上皮細胞專用培養基購自美國 Sciencell 公司。人肝內膽管上皮細胞系 HIBEpiC 細胞常規培養于加入 10% 胎牛血清的上皮細胞專用培養基中，置于 37 ℃、5% CO2 培養箱中恒溫培養，48～72 h 進行傳代。實驗細胞均為活力良好的對數生長期細胞。
1.1.2 主要試劑、材料和設備
二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG（A0208）、二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠 IgG（A0216）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（P0012S）、RIPA 裂解液（P0013B）和極超敏 ECL 化學發光試劑盒（P0018F）均購自上海碧云天生物技術有限公司；DAB 辣根過氧化物酶顯色試劑盒（ZLI-9019）購自北京中杉金橋生物技術公司；LPS（14011S）購自美國 Cell signaling 公司；姜黃素（C1386）購自美國 Sigma 公司；胎牛血清（10099133）購自 Gibco 公司；一抗 c-myc（ab32072）和 β-GD（ab166904）均購自美國 AbCam 公司；一抗 β-actin（sc-70319）購自美國 Santa Cruz 公司。CO2 細胞培養箱為美國 Thermo 公司產品。垂直電泳裝置、轉膜儀、凝膠成像及分析系統為美國 Bio-Rad 公司產品。
1.2 實驗分組
1.2.1 LPS 刺激實驗
取對數生長期的 HIBEpiC 細胞進行分組：空白對照組（0 h 組）及 7 個不同刺激時點組，調整細胞密度為 1×104個/mL，在 5 個不同刺激時點組的培養基中加入 100 μg/mL 的 LPS 分別刺激 1、3、6、18 及 24 h，另外取 2 份 LPS 刺激 24 h 的培養基，在 LPS 刺激 24 h 后更換為無 LPS 培養基，分別繼續培養 18 h 和 24 h。每個刺激時間點設有 5 個復孔。收集所有培養基內細胞，提取蛋白，進行檢測。
1.2.2 姜黃素干預實驗
取對數生長期的 HIBEpiC 細胞進行分組：空白對照組、LPS 組、LSP+低濃度姜黃素組、LSP+中濃度姜黃素組及 LSP+高濃度姜黃素組，調整細胞密度為 1×104個/mL。除空白對照組細胞不加入任何試劑、LPS 組僅加入 100 μg/mLLPS 外，其余 3 組在培養基中加入 100 μg/mL 的 LPS 的同時，分別給予 20（低濃度）、40（中濃度）和 80（高濃度）μmol/L 姜黃素干預。每個組別設有5 個復孔。細胞培養 24 h 后收集細胞提取蛋白，進行檢測。
1.3 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測目的蛋白的表達
采用蛋白免疫印跡法檢測目的蛋白的表達：使用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化收集各組 HIBEpiC 細胞。以 RIPA 蛋白裂解液裂解細胞后提取總蛋白，以 BCA 法測定蛋白濃度。將蛋白樣品與蛋白加樣緩沖液按 4∶1 混合后 100 ℃ 煮沸5 min。取 50 μg 蛋白上樣，行 8% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，采用全濕法轉膜至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，以含 5% 脫脂奶粉的 Tris 緩沖液加 Tween-20（Tris-Buffered Saline with 0.1% Tween-20，TBST）室溫封閉 1 h 后，分別加入目的蛋白的一抗：β-GD（1∶1 000）、c-myc（1∶1 000）及 β-actin（1∶3 000），4 ℃ 孵育過夜。次日以 TBST 洗膜后，加入山羊抗兔 IgG 二抗（1∶5 000）或山羊抗小鼠 IgG 二抗（1∶5 000），室溫搖床孵育 2 h。再以 TBST 洗膜后，采用 ECL 法顯影。采用 ImageJ 軟件測定目的條帶和相應β-actin 條帶的灰度值，然后進行蛋白半定量分析，目的條帶灰度值與相應組別的 β-actin 條帶灰度值的比值即為目的蛋白的相對表達量。目的蛋白的一抗信息見表1。
表1
目的蛋白的一抗
1.4 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件進行分析。每個樣本的結果為 5 次獨立實驗的均值。各實驗組和空白對照組細胞中 c-myc 和 β-GD 蛋白的表達水平比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用 SNK 法。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 LPS 誘導 c-myc 和內源性 β-GD 的表達上調，具有時間依賴性
總體而言，LPS 作用 0～24 h 期間，人正常肝內膽管細胞中內源性 β-GD 和 c-myc 的表達水平隨著 LPS 作用時間的延長呈增加趨勢，且各時點組的β-GD 和 c-myc 的表達水平與 0 h 組相比，差異均具有統計學意義（P<0.05），見圖1a。LPS 作用時間為 18 h 時，c-myc 的表達水平達到最大值（圖1b）；而 LPS 作用時間為 24 h 時，內源性 β-GD 的表達水平達到最大值（圖1c）。在 LPS 作用 24 h、更換為無 LPS 的培養基后，在無 LPS 刺激下繼續培養 18 h 和 24 h，結果發現：c-myc 的表達水平略有回升，而內源性 β-GD 的表達水平略有下降，但是兩者仍明顯高于正常肝內膽管細胞中內源性 β-GD 和 c-myc 表達的基礎水平（P<0.05），見圖1b 和圖1c。該檢測結果提示，在人肝內膽管細胞中，LPS 可刺激細胞內 c-myc 和內源性 β-GD 的表達水平增加，且具有時間依賴性；在 LPS 停止刺激 24 h 后，肝內膽管細胞中的 c-myc 和內源性 β-GD 仍可保持高表達。
圖1
示單純 LPS 刺激不同時點組及不同濃度姜黃素聯合 LPS 作用組細胞中 c-myc 和 β-GD 蛋白的表達水平
a：單純 LPS 刺激不同時點組細胞中 c-myc 和 β-GD 表達的電泳結果；b：單純 LPS 刺激不同時點組細胞中 c-myc 的表達水平結果，與0 h 組比較，*
2.2 姜黃素有效抑制 LPS 誘導的 c-myc 和內源性 β-GD 的表達上調，具有濃度依賴性
在 LPS（100 μg/mL）刺激人正常肝內膽管細胞的同時，給予不同濃度（20、40 和 80 μmol/L）姜黃素干預后，結果發現，空白對照組、LPS 組、LPS+低濃度姜黃素組、LPS+中濃度姜黃素組及 LPS+高濃度姜黃素組間兩兩比較，c-myc 和 β-GD 的表達水平的差異均具有統計學意義（P<0.05）。3 種濃度姜黃素干預下，可使得 LPS 刺激下肝內膽管細胞中c-myc 的表達水平低于肝內膽管細胞（無 LPS 刺激）的正常表達水平；而且，當姜黃素濃度達到40 μmol/L 及以上時，β-GD 的表達水平也低于肝內膽管細胞（無 LPS 刺激）的正常表達水平（圖1d–1f）。該結果提示，姜黃素可有效抑制 LPS 誘導的 c-myc 和 β-GD 的表達上調，具有濃度依賴性，姜黃素干預可能會成為抑制肝內膽管結石形成或復發的有效措施。
3 討論
肝內膽管結石在西方國家少見，發病率為 0.6%～1.3%，但其在中國卻非常常見，發病率達到 38.0%，是威脅我國人民群眾健康的常見疾病[1]。膽管切開取石或膽道鏡下取石、肝切除等治療方法僅能最大限度清除結石，卻不能有效預防結石復發。結石復發患者不得不再次接受手術或內鏡取石治療，其治療風險及難度均增加，同時也增加了患者的痛苦[2]。因此，研究結石形成的機制，探索預防結石形成或復發的有效方法具有重要的臨床意義[3]。
肝內膽管結石絕大多數為膽紅素結石，膽色素鈣是其主要成分。β-GD 是一種重要的生物活性蛋白酶，在膽色素鈣形成過程中起著重要作用。β-GD 可通過水解結合型膽紅素而生成游離型的膽紅素，促進后者與鈣質結合形成膽色素鈣[10]。β-GD 有內源性和外源性之分，外源性 β-GD 即是細菌感染繁殖產生的 β-GD，而內源性 β-GD 是機體自身組織細胞產生、合成并分泌的。著名的 Maki 學說認為，細菌感染繁殖產生的外源性 β-GD 是膽紅素鈣形成的主要機制[11]。細菌感染促進膽色素結石形成，而隨著膽汁的排空，感染程度下降，外源性 β-GD 的活性逐漸下降，而內源性 β-GD 的活性卻可較長時間地保持在較高水平，這暗示內源性 β-GD 在膽色素結石形成中作用時間可能相對更長[5]。因此，對內源性 β-GD 活性的調節機制的研究將有助于我們探索干預肝內膽管結石形成或復發的有效措施[12-13]。
筆者團隊之前對內源性 β-GD 相關的調節機制進行了初步探索。最初，利用膽色素結石模型探索膽石成因，結果發現，膽色素結石形成過程中，血 LPS 水平和膽汁中內源性 β-GD 的活性顯著增高，提示兩者可能與膽色素結石形成密切相關[14]。另外，筆者團隊利用體內實驗[15-16]還證明，LPS 可誘導肝臟內源性 β-GD 轉錄水平的升高。近期，筆者團隊[6]通過體外細胞實驗證明，LPS 可刺激肝細胞或肝內膽管上皮細胞中內源性 β-GD 表達水平增加，并且具有明顯的濃度依賴性。另外，通過檢測還發現，肝細胞或肝內膽管上皮細胞中內源性 β-GD 的分泌也相應增加[17]。這些結果提示了，LPS 刺激后內源性 β-GD 表達上調，相應地肝細胞或肝內膽管上皮細胞中內源性 β-GD 分泌亦增加，這可能是膽色素結石患者膽汁中內源性 β-GD 活性增加的一個重要原因。筆者團隊的研究[6]還發現，LPS 可誘導 c-myc 蛋白的表達上調，而利用 c-myc siRNA 有效抑制 c-myc 的表達后，可抑制 LPS 誘導的內源性 β-GD 的表達上調，提示 LPS 可通過 c-myc 刺激內源性 β-GD 表達水平的增加，進而促進肝內膽管結石的形成。本次實驗中，筆者團隊通過進一步檢測發現，LPS 刺激肝內膽管細胞內 c-myc 和內源性 β-GD 的表達上調具有時間依賴性，而且在 LPS 停止刺激后，肝內膽管細胞中 c-myc 和內源性 β-GD 仍可保持一段時間的高表達。由此，本實驗結果提示，LPS 刺激后的 c-myc 和內源性 β-GD 表達上調，在膽色素結石形成中可能作用時間較長[5]。因此，探索干預 LPS 誘導的肝內膽管細胞 c-myc 和內源性 β-GD 表達上調的有效措施具有重要意義。
姜黃素是在姜科植物姜黃等根莖中提取得到的黃色色素，在傳統醫學中有悠久的應用歷史。姜黃素具有保肝、抗炎、抗氧化應激、抗腫瘤等多方面的作用[18-20]。研究[9, 21-22]提示，姜黃素對多種腫瘤細胞增殖或凋亡的影響與其抑制 c-myc 的轉錄或表達有關，并且具有濃度依賴性。而筆者團隊之前的研究[6]發現，LPS 可通過上調 c-myc 的表達而刺激肝內膽管上皮細胞中內源性 β-GD 的表達上調，亦具有明顯的濃度依賴性。因此可推測，姜黃素對于 LPS 刺激的肝內膽管上皮細胞中 c-myc 的表達上調也可能有抑制作用，可能進而抑制內源性 β-GD 的表達。本實驗結果表明，姜黃素有效抑制了 LPS 誘導的 c-myc 和內源性 β-GD 的表達上調，具有濃度依賴性，結合之前的實驗結果，筆者認為，姜黃素可抑制 LPS 誘導的內源性 β-GD 的表達上調，而且推測這可能與抑制 c-myc 的表達有關。當然，本次實驗尚不能充分證明筆者的推測，在后續實驗中筆者團隊擬應用 c-myc 質粒轉染等方法，促使姜黃素干預下 c-myc 的表達上調，進而檢測內源性 β-GD 表達水平的變化，可進一步充分證明 c-myc 在姜黃素抑制 LPS 誘導的膽管細胞內源性 β-GD 表達中的作用。
對于 c-myc 的表達調節機制，目前有研究[23]提示，c-myc 為 miR-34 家族的作用靶蛋白，miR-34 能夠直接作用于 c-myc 的 3′非編碼區，從而抑制c-myc 的表達。LPS/Toll 樣受體 4（Toll-like receptors 4，TLR4）/核因子-κB（nuclear transcription factor kappa B，NF-κB）為經典的炎癥通路，在炎癥性疾病中，NF-κB 亦通過上調 miR-34a 的表達水平參與疾病的發生[24]。姜黃素可上調 miR-34a 的表達[25]，可推測，姜黃素可能是通過上調 miR-34a 而直接抑制 c-myc 的表達，進而抑制肝內膽管上皮細胞中內源性 β-GD 的表達。對于其上游的 TLR4、NF-κB 等信號調節因子，姜黃素是否亦發揮相應的抑制作用還有待于進一步驗證[26]。此外，本實驗還發現，姜黃素在濃度達 20 μmol/L 時已有效抑制了 LPS 誘導的肝內膽管上皮細胞中 c-myc 的表達，使其顯著低于細胞的正常表達水平，但內源性 β-GD 的表達抑制卻較緩慢，在姜黃素濃度達 40 μmol/L 時內源性β-GD 的表達水平才低于細胞正常表達水平，提示除了 c-myc，可能還存在其他調節因子或蛋白等參與 LPS 誘導的膽管細胞中內源性 β-GD 表達的調節，等待我們去進一步探索。在姜黃素干預下，可使得 LPS 刺激后肝內膽管細胞中內源性 β-GD 和c-myc 的表達水平低于肝內膽管細胞（無 LPS 刺激）的正常表達水平，可以推測，姜黃素干預可能會成為抑制肝內膽管結石形成或復發的有效措施。另外，合成的姜黃素類似物亦可抑制 β-GD 的活性，而且一些姜黃素類似物的抑制作用甚至更強[27]，可能發展成為干擾膽管色素結石形成的有效試劑。對于給藥途徑，最近實驗[28-29]證明，膽道局部灌注給藥可更有效抑制膽道炎癥以及下調內源性β-GD 的活性，這可能發展成為今后控制膽管色素結石復發的主要干預途徑。
總之，本實驗結果表明，LPS 可刺激肝內膽管上皮細胞中 c-myc 和內源性 β-GD 表達的上調，具有時間依賴性，并可保持其較長時間的高表達狀態；姜黃素可有效抑制 c-myc 和內源性 β-GD 的表達上調，具有濃度依賴性。姜黃素具有抑制 LPS 誘導的內源性 β-GD 表達上調的能力，可能因此具有抑制肝內膽管膽色素結石形成的能力。本實驗結果為防止肝膽管色素結石形成或復發的相關研究提供了一個新的可能思路。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：王洋、姚殿波和吳碩東共同完成本實驗的科研選題以及研究方案設計；王洋參與完成實驗并撰寫草稿；姚殿波和吳碩東參與文章審核及投稿。
志謝：沈陽迪安醫學檢驗所有限公司病理科王翠芳在文章修稿過程中對于討論部分書寫修改給予了特別幫助，特此感謝。
膽管色素結石在中國非常常見[1]，因其病變復雜和復發率高，成為較難治愈的一種良性膽道疾病[2]。研究結石形成的機制，探索預防或干預結石形成的有效方法具有重要的臨床意義[3]。膽管色素結石以膽紅素鈣為主要成分，細菌感染是促進其形成的重要因素[4]。膽道細菌感染后，膽汁中除了外源性 β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase，β-GD）的活性增高以外，內源性 β-GD 的活性也明顯增高，而且有研究[5]提示，內源性 β-GD 在膽色素結石形成中的作用時間可能相對更長。筆者團隊[6]之前的研究發現，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可刺激肝內膽管上皮細胞中內源性 β-GD 表達的上調，具有明顯的濃度依賴性，此外，c-myc 在 LPS 誘導的內源性 β-GD 的表達上調中起著重要作用。進一步探索干預 c-myc 和內源性 β-GD 表達的有效措施，將可能有助于我們今后尋找干預膽管色素結石形成或復發的有效方法。姜黃素通過抗炎、抗氧化、減慢鈣的沉積速率和礦化結節的形成、抑制破骨細胞樣細胞形成等作用，可以抑制腎結石形成過程中的相應環節，具有預防草酸鈣腎結石的潛質[7]。此外，多種腫瘤細胞增殖或凋亡相關研究[8-9]表明，姜黃素可抑制 c-myc 的轉錄或表達，并且具有濃度依賴性。結合筆者團隊之前的研究發現，筆者推測，姜黃素亦可能抑制膽管色素結石的形成，而且可能與抑制由 LPS 刺激的肝內膽管上皮細胞中內源性 β-GD 表達的上調有關。因此，本研究旨在探討姜黃素對 LPS 刺激的肝內膽管上皮細胞中內源性β-GD 表達的影響，為控制膽管色素結石形成和預防結石復發提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗細胞、主要材料、試劑和設備
1.1.1 實驗細胞
人肝內膽管上皮細胞系（HIBEpiC）及上皮細胞專用培養基購自美國 Sciencell 公司。人肝內膽管上皮細胞系 HIBEpiC 細胞常規培養于加入 10% 胎牛血清的上皮細胞專用培養基中，置于 37 ℃、5% CO2 培養箱中恒溫培養，48～72 h 進行傳代。實驗細胞均為活力良好的對數生長期細胞。
1.1.2 主要試劑、材料和設備
二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG（A0208）、二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠 IgG（A0216）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（P0012S）、RIPA 裂解液（P0013B）和極超敏 ECL 化學發光試劑盒（P0018F）均購自上海碧云天生物技術有限公司；DAB 辣根過氧化物酶顯色試劑盒（ZLI-9019）購自北京中杉金橋生物技術公司；LPS（14011S）購自美國 Cell signaling 公司；姜黃素（C1386）購自美國 Sigma 公司；胎牛血清（10099133）購自 Gibco 公司；一抗 c-myc（ab32072）和 β-GD（ab166904）均購自美國 AbCam 公司；一抗 β-actin（sc-70319）購自美國 Santa Cruz 公司。CO2 細胞培養箱為美國 Thermo 公司產品。垂直電泳裝置、轉膜儀、凝膠成像及分析系統為美國 Bio-Rad 公司產品。
1.2 實驗分組
1.2.1 LPS 刺激實驗
取對數生長期的 HIBEpiC 細胞進行分組：空白對照組（0 h 組）及 7 個不同刺激時點組，調整細胞密度為 1×104個/mL，在 5 個不同刺激時點組的培養基中加入 100 μg/mL 的 LPS 分別刺激 1、3、6、18 及 24 h，另外取 2 份 LPS 刺激 24 h 的培養基，在 LPS 刺激 24 h 后更換為無 LPS 培養基，分別繼續培養 18 h 和 24 h。每個刺激時間點設有 5 個復孔。收集所有培養基內細胞，提取蛋白，進行檢測。
1.2.2 姜黃素干預實驗
取對數生長期的 HIBEpiC 細胞進行分組：空白對照組、LPS 組、LSP+低濃度姜黃素組、LSP+中濃度姜黃素組及 LSP+高濃度姜黃素組，調整細胞密度為 1×104個/mL。除空白對照組細胞不加入任何試劑、LPS 組僅加入 100 μg/mLLPS 外，其余 3 組在培養基中加入 100 μg/mL 的 LPS 的同時，分別給予 20（低濃度）、40（中濃度）和 80（高濃度）μmol/L 姜黃素干預。每個組別設有5 個復孔。細胞培養 24 h 后收集細胞提取蛋白，進行檢測。
1.3 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測目的蛋白的表達
采用蛋白免疫印跡法檢測目的蛋白的表達：使用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化收集各組 HIBEpiC 細胞。以 RIPA 蛋白裂解液裂解細胞后提取總蛋白，以 BCA 法測定蛋白濃度。將蛋白樣品與蛋白加樣緩沖液按 4∶1 混合后 100 ℃ 煮沸5 min。取 50 μg 蛋白上樣，行 8% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，采用全濕法轉膜至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，以含 5% 脫脂奶粉的 Tris 緩沖液加 Tween-20（Tris-Buffered Saline with 0.1% Tween-20，TBST）室溫封閉 1 h 后，分別加入目的蛋白的一抗：β-GD（1∶1 000）、c-myc（1∶1 000）及 β-actin（1∶3 000），4 ℃ 孵育過夜。次日以 TBST 洗膜后，加入山羊抗兔 IgG 二抗（1∶5 000）或山羊抗小鼠 IgG 二抗（1∶5 000），室溫搖床孵育 2 h。再以 TBST 洗膜后，采用 ECL 法顯影。采用 ImageJ 軟件測定目的條帶和相應β-actin 條帶的灰度值，然后進行蛋白半定量分析，目的條帶灰度值與相應組別的 β-actin 條帶灰度值的比值即為目的蛋白的相對表達量。目的蛋白的一抗信息見表1。
表1
目的蛋白的一抗
1.4 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件進行分析。每個樣本的結果為 5 次獨立實驗的均值。各實驗組和空白對照組細胞中 c-myc 和 β-GD 蛋白的表達水平比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用 SNK 法。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 LPS 誘導 c-myc 和內源性 β-GD 的表達上調，具有時間依賴性
總體而言，LPS 作用 0～24 h 期間，人正常肝內膽管細胞中內源性 β-GD 和 c-myc 的表達水平隨著 LPS 作用時間的延長呈增加趨勢，且各時點組的β-GD 和 c-myc 的表達水平與 0 h 組相比，差異均具有統計學意義（P<0.05），見圖1a。LPS 作用時間為 18 h 時，c-myc 的表達水平達到最大值（圖1b）；而 LPS 作用時間為 24 h 時，內源性 β-GD 的表達水平達到最大值（圖1c）。在 LPS 作用 24 h、更換為無 LPS 的培養基后，在無 LPS 刺激下繼續培養 18 h 和 24 h，結果發現：c-myc 的表達水平略有回升，而內源性 β-GD 的表達水平略有下降，但是兩者仍明顯高于正常肝內膽管細胞中內源性 β-GD 和 c-myc 表達的基礎水平（P<0.05），見圖1b 和圖1c。該檢測結果提示，在人肝內膽管細胞中，LPS 可刺激細胞內 c-myc 和內源性 β-GD 的表達水平增加，且具有時間依賴性；在 LPS 停止刺激 24 h 后，肝內膽管細胞中的 c-myc 和內源性 β-GD 仍可保持高表達。
圖1
示單純 LPS 刺激不同時點組及不同濃度姜黃素聯合 LPS 作用組細胞中 c-myc 和 β-GD 蛋白的表達水平
a：單純 LPS 刺激不同時點組細胞中 c-myc 和 β-GD 表達的電泳結果；b：單純 LPS 刺激不同時點組細胞中 c-myc 的表達水平結果，與0 h 組比較，*
2.2 姜黃素有效抑制 LPS 誘導的 c-myc 和內源性 β-GD 的表達上調，具有濃度依賴性
在 LPS（100 μg/mL）刺激人正常肝內膽管細胞的同時，給予不同濃度（20、40 和 80 μmol/L）姜黃素干預后，結果發現，空白對照組、LPS 組、LPS+低濃度姜黃素組、LPS+中濃度姜黃素組及 LPS+高濃度姜黃素組間兩兩比較，c-myc 和 β-GD 的表達水平的差異均具有統計學意義（P<0.05）。3 種濃度姜黃素干預下，可使得 LPS 刺激下肝內膽管細胞中c-myc 的表達水平低于肝內膽管細胞（無 LPS 刺激）的正常表達水平；而且，當姜黃素濃度達到40 μmol/L 及以上時，β-GD 的表達水平也低于肝內膽管細胞（無 LPS 刺激）的正常表達水平（圖1d–1f）。該結果提示，姜黃素可有效抑制 LPS 誘導的 c-myc 和 β-GD 的表達上調，具有濃度依賴性，姜黃素干預可能會成為抑制肝內膽管結石形成或復發的有效措施。
3 討論
肝內膽管結石在西方國家少見，發病率為 0.6%～1.3%，但其在中國卻非常常見，發病率達到 38.0%，是威脅我國人民群眾健康的常見疾病[1]。膽管切開取石或膽道鏡下取石、肝切除等治療方法僅能最大限度清除結石，卻不能有效預防結石復發。結石復發患者不得不再次接受手術或內鏡取石治療，其治療風險及難度均增加，同時也增加了患者的痛苦[2]。因此，研究結石形成的機制，探索預防結石形成或復發的有效方法具有重要的臨床意義[3]。
肝內膽管結石絕大多數為膽紅素結石，膽色素鈣是其主要成分。β-GD 是一種重要的生物活性蛋白酶，在膽色素鈣形成過程中起著重要作用。β-GD 可通過水解結合型膽紅素而生成游離型的膽紅素，促進后者與鈣質結合形成膽色素鈣[10]。β-GD 有內源性和外源性之分，外源性 β-GD 即是細菌感染繁殖產生的 β-GD，而內源性 β-GD 是機體自身組織細胞產生、合成并分泌的。著名的 Maki 學說認為，細菌感染繁殖產生的外源性 β-GD 是膽紅素鈣形成的主要機制[11]。細菌感染促進膽色素結石形成，而隨著膽汁的排空，感染程度下降，外源性 β-GD 的活性逐漸下降，而內源性 β-GD 的活性卻可較長時間地保持在較高水平，這暗示內源性 β-GD 在膽色素結石形成中作用時間可能相對更長[5]。因此，對內源性 β-GD 活性的調節機制的研究將有助于我們探索干預肝內膽管結石形成或復發的有效措施[12-13]。
筆者團隊之前對內源性 β-GD 相關的調節機制進行了初步探索。最初，利用膽色素結石模型探索膽石成因，結果發現，膽色素結石形成過程中，血 LPS 水平和膽汁中內源性 β-GD 的活性顯著增高，提示兩者可能與膽色素結石形成密切相關[14]。另外，筆者團隊利用體內實驗[15-16]還證明，LPS 可誘導肝臟內源性 β-GD 轉錄水平的升高。近期，筆者團隊[6]通過體外細胞實驗證明，LPS 可刺激肝細胞或肝內膽管上皮細胞中內源性 β-GD 表達水平增加，并且具有明顯的濃度依賴性。另外，通過檢測還發現，肝細胞或肝內膽管上皮細胞中內源性 β-GD 的分泌也相應增加[17]。這些結果提示了，LPS 刺激后內源性 β-GD 表達上調，相應地肝細胞或肝內膽管上皮細胞中內源性 β-GD 分泌亦增加，這可能是膽色素結石患者膽汁中內源性 β-GD 活性增加的一個重要原因。筆者團隊的研究[6]還發現，LPS 可誘導 c-myc 蛋白的表達上調，而利用 c-myc siRNA 有效抑制 c-myc 的表達后，可抑制 LPS 誘導的內源性 β-GD 的表達上調，提示 LPS 可通過 c-myc 刺激內源性 β-GD 表達水平的增加，進而促進肝內膽管結石的形成。本次實驗中，筆者團隊通過進一步檢測發現，LPS 刺激肝內膽管細胞內 c-myc 和內源性 β-GD 的表達上調具有時間依賴性，而且在 LPS 停止刺激后，肝內膽管細胞中 c-myc 和內源性 β-GD 仍可保持一段時間的高表達。由此，本實驗結果提示，LPS 刺激后的 c-myc 和內源性 β-GD 表達上調，在膽色素結石形成中可能作用時間較長[5]。因此，探索干預 LPS 誘導的肝內膽管細胞 c-myc 和內源性 β-GD 表達上調的有效措施具有重要意義。
姜黃素是在姜科植物姜黃等根莖中提取得到的黃色色素，在傳統醫學中有悠久的應用歷史。姜黃素具有保肝、抗炎、抗氧化應激、抗腫瘤等多方面的作用[18-20]。研究[9, 21-22]提示，姜黃素對多種腫瘤細胞增殖或凋亡的影響與其抑制 c-myc 的轉錄或表達有關，并且具有濃度依賴性。而筆者團隊之前的研究[6]發現，LPS 可通過上調 c-myc 的表達而刺激肝內膽管上皮細胞中內源性 β-GD 的表達上調，亦具有明顯的濃度依賴性。因此可推測，姜黃素對于 LPS 刺激的肝內膽管上皮細胞中 c-myc 的表達上調也可能有抑制作用，可能進而抑制內源性 β-GD 的表達。本實驗結果表明，姜黃素有效抑制了 LPS 誘導的 c-myc 和內源性 β-GD 的表達上調，具有濃度依賴性，結合之前的實驗結果，筆者認為，姜黃素可抑制 LPS 誘導的內源性 β-GD 的表達上調，而且推測這可能與抑制 c-myc 的表達有關。當然，本次實驗尚不能充分證明筆者的推測，在后續實驗中筆者團隊擬應用 c-myc 質粒轉染等方法，促使姜黃素干預下 c-myc 的表達上調，進而檢測內源性 β-GD 表達水平的變化，可進一步充分證明 c-myc 在姜黃素抑制 LPS 誘導的膽管細胞內源性 β-GD 表達中的作用。
對于 c-myc 的表達調節機制，目前有研究[23]提示，c-myc 為 miR-34 家族的作用靶蛋白，miR-34 能夠直接作用于 c-myc 的 3′非編碼區，從而抑制c-myc 的表達。LPS/Toll 樣受體 4（Toll-like receptors 4，TLR4）/核因子-κB（nuclear transcription factor kappa B，NF-κB）為經典的炎癥通路，在炎癥性疾病中，NF-κB 亦通過上調 miR-34a 的表達水平參與疾病的發生[24]。姜黃素可上調 miR-34a 的表達[25]，可推測，姜黃素可能是通過上調 miR-34a 而直接抑制 c-myc 的表達，進而抑制肝內膽管上皮細胞中內源性 β-GD 的表達。對于其上游的 TLR4、NF-κB 等信號調節因子，姜黃素是否亦發揮相應的抑制作用還有待于進一步驗證[26]。此外，本實驗還發現，姜黃素在濃度達 20 μmol/L 時已有效抑制了 LPS 誘導的肝內膽管上皮細胞中 c-myc 的表達，使其顯著低于細胞的正常表達水平，但內源性 β-GD 的表達抑制卻較緩慢，在姜黃素濃度達 40 μmol/L 時內源性β-GD 的表達水平才低于細胞正常表達水平，提示除了 c-myc，可能還存在其他調節因子或蛋白等參與 LPS 誘導的膽管細胞中內源性 β-GD 表達的調節，等待我們去進一步探索。在姜黃素干預下，可使得 LPS 刺激后肝內膽管細胞中內源性 β-GD 和c-myc 的表達水平低于肝內膽管細胞（無 LPS 刺激）的正常表達水平，可以推測，姜黃素干預可能會成為抑制肝內膽管結石形成或復發的有效措施。另外，合成的姜黃素類似物亦可抑制 β-GD 的活性，而且一些姜黃素類似物的抑制作用甚至更強[27]，可能發展成為干擾膽管色素結石形成的有效試劑。對于給藥途徑，最近實驗[28-29]證明，膽道局部灌注給藥可更有效抑制膽道炎癥以及下調內源性β-GD 的活性，這可能發展成為今后控制膽管色素結石復發的主要干預途徑。
總之，本實驗結果表明，LPS 可刺激肝內膽管上皮細胞中 c-myc 和內源性 β-GD 表達的上調，具有時間依賴性，并可保持其較長時間的高表達狀態；姜黃素可有效抑制 c-myc 和內源性 β-GD 的表達上調，具有濃度依賴性。姜黃素具有抑制 LPS 誘導的內源性 β-GD 表達上調的能力，可能因此具有抑制肝內膽管膽色素結石形成的能力。本實驗結果為防止肝膽管色素結石形成或復發的相關研究提供了一個新的可能思路。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：王洋、姚殿波和吳碩東共同完成本實驗的科研選題以及研究方案設計；王洋參與完成實驗并撰寫草稿；姚殿波和吳碩東參與文章審核及投稿。
志謝：沈陽迪安醫學檢驗所有限公司病理科王翠芳在文章修稿過程中對于討論部分書寫修改給予了特別幫助，特此感謝。
