結直腸癌患者外周血及其癌組織中 CD19<sup>+</sup>IL-10<sup>+</sup>B 細胞及其亞群含量的差異及意義_《中國普外基礎與臨床雜志》

作者：

許杰 , 陳小龍 , 胡欣雨 , 左宗林 , 陳鵬 , 馮立波 , 鄒慶偉 ,  夏冬

西南醫科大學附屬醫院胃腸外科（四川瀘州 646000）;

關鍵詞：

結直腸癌 CD19⁺ IL-10⁺ B 細胞調節性 B 細胞

DOI：

10.7507/1007-9424.201903070

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摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

目的探討 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞及其亞群在結直腸癌患者外周血及其癌組織中的表達差異及臨床意義。方法納入在西南醫科大學附屬醫院 2017 年 11 月至 2018 年 11 月期間確診為結直腸癌并行手術患者共 38 例，用流式細胞術檢測結直腸癌患者外周血、癌組織及其相應癌旁組織中 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞及其3 種亞群 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞、CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^int B 細胞及 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 細胞占 CD19⁺ B 細胞的百分比；另外納入同時間段在西南醫科大學附屬醫院健康體檢者共 37 例，僅抽取外周血同法分離細胞。比較 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞及其亞群含量在結直腸癌和健康對照者外周血中以及在結直腸癌患者癌組織及其相應癌旁組織中的表達差異，并分析其與結直腸癌患者臨床病理特征的關系。結果 ① 結直腸癌患者外周血中 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞和 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞含量明顯高于健康對照組（分別為：t=9.09，P<0.01；t=9.36，P<0.01），CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 細胞含量明顯低于健康對照組（t=6.15，P<0.01），而 CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^int B 細胞含量在 2 組間比較差異無統計學意義（t=1.78，P=0.08）。② CD19⁺IL-10⁺ B 細胞和 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hiB 細胞含量在結直腸癌患者的癌組織中明顯高于在其相應的癌旁組織中（分別為：t=11.67，P<0.01；t=19.64，P<0.01），而 CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^int B 細胞和 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 細胞含量在二者間比較差異無統計學意義（分別為：t=1.72，P=0.09；t=1.57，P=0.12）。③ CD19⁺IL-10⁺ B 細胞及其亞群 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞含量在Ⅲ+Ⅳ期結直腸癌患者外周血中明顯高于Ⅰ+Ⅱ期者（t=5.39，P<0.01；t=3.13，P<0.01），而其他均未發現差異有統計學意義（P>0.05）。結論 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞在結直腸癌患者的外周血和癌組織以及中晚期結直腸癌患者的外周血中均明顯增高，且其以 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞亞群升高為主，結果提示，CD19⁺IL-10⁺ B 細胞及其亞群 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞可能與結直腸癌的發生及進展有關。

引用本文： 許杰, 陳小龍, 胡欣雨, 左宗林, 陳鵬, 馮立波, 鄒慶偉, 夏冬. 結直腸癌患者外周血及其癌組織中 CD19⁺IL-10⁺B 細胞及其亞群含量的差異及意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(7): 808-813. doi: 10.7507/1007-9424.201903070 復制

結直腸癌是嚴重危害人們健康的主要消化道腫瘤之一，除手術治療外，免疫治療也成為結直腸癌綜合治療的重要組成部分。Sakaguchi 等^[1]首次發現了具有免疫抑制功能的調節性 T 細胞（regulatory T cell，Treg）的存在，在腫瘤免疫、自身性免疫、移植免疫等疾病中具有調節作用^[2-3]。是否具有調節功能的 B 細胞存在呢？最近一些研究^[4-6]揭示了一類特殊的 B 細胞即調節性 B 細胞（regulatory B cell，Breg），其與 Treg 相似，也具有免疫調節功能，在自身免疫性疾病^[7-9]、病毒感染^[10-11]、血液系統疾病^[12-13]、移植排斥反應^[14-15]及腫瘤免疫^[16-17]中發揮著重要作用。Breg 產生 IL-10 被認為是 Breg 的最重要特征。有研究^[18-21]發現，IL-10 與多種腫瘤的進展有關，具有免疫抑制作用。在胃癌研究^[19]中發現，CD19⁺IL-10⁺ B 細胞具有免疫抑制作用，且主要是 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞發揮免疫抑制功能，其他兩種亞群細胞（CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^int B 細胞、CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 細胞）雖然能分泌 IL-10，但不具有免疫抑制功能。目前關于 CD19⁺IL-10⁺B 細胞及亞群研究相對較少，其所有亞群在結直腸癌中是否都具有免疫調節功能在國內外研究中未見報道。本研究中將以 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞為基礎，探討結直腸癌患者的外周血和癌組織中 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞及其亞群含量的變化及可能的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集 2017 年 11 月至 2018 年 11 月期間在西南醫科大學附屬醫院（簡稱“我院”）首次入院并行手術治療的結直腸癌患者作為研究組，另選擇同期在我院體檢的健康自愿者作為對照組。

納入標準及排除標準：① 研究組：術前經病理檢查確診為結直腸癌；術前未做過手術、化放療、免疫治療、靶向治療、生物治療等；術后均取得腫瘤組織及其相應的癌旁組織并經我院病理學專家確診并明確病理分期。② 對照組：選擇與研究組年齡在同一范圍內未做過手術、化放療、免疫治療、靶向治療、生物治療等健康體檢者。2 組均排除了過敏、炎癥、感染、自身免疫性等病史者。臨床分期按 AJCC/UICC 公布的第 8 版結直腸癌 TNM 分期進行分類。所有參加者均同意并簽署知情同意書，經我院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 標本采集

① 收集 2 組受試者清晨空腹外周血 5 mL，加入淋巴細胞分離液，以 510 ×g 離心25 min，分離并提取外周血單個核細胞（peripheral blood monouclear cell，PBMC）備用。② 收集研究組手術切除的新鮮腫瘤組織及其相應的距腫瘤組織邊緣 5 cm 遠時的癌旁組織（術后證實無癌），分別切成 2～3 mm³見方的組織塊，加入組織消化液進行振蕩消化，用 70 目尼龍網進行過濾，獲得細胞離心重懸，再按照外周血中 PBMC 的分離法進行操作，獲得癌組織中提取的腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）和癌旁組織中提取的非腫瘤浸潤淋巴細胞（NIL）。

1.2.2 標記抗體、流式細胞術檢測

用單克隆抗體標記 PBMC、TIL 和 NIL 的表面抗原 CD19（PE-Cy?7）、CD24（FITC）、CD38（PE-Cy?5），室溫下搖動避光孵育 30 min 后行破膜固定，再加入胞內抗 IL-10 的單抗（PE）標記 IL-10⁺細胞（抗體均來自 BD 公司，破膜固定劑 FIX&PERM Kit 聯科生物公司提供）。孵育完成后用流式細胞儀完成測定。以 CD19⁺ B 細胞為總 B 細胞，以 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞設門，再根據 CD24 和 CD38 的表達情況，按 Carsetti 等^[22]的方法將 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞分為 3 種亞群，即 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞（Q2）、CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^intB 細胞（Q3）、CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 細胞（Q1），見圖 1。

圖1 示 CD19⁺ IL-10⁺ B 細胞及亞群檢測

a：標記淋巴細胞；b：標記 CD19⁺ B 淋巴細胞；c：標記 CD19⁺IL-10⁺ B 淋巴細胞；d：CD19⁺IL-10⁺ B 淋巴細胞 3 種亞群分布。 FSC-A：前向角散射；SSC-A：側向角散射。CD19 PE-Cy7-A、CD24 FITC-A、CD38 PE-Cy5.5-A 分別為 CD19、CD24、CD38 的抗體標記熒光染料

圖選項

下載全尺寸圖像

下載幻燈片

1.3 統計學方法

使用 SPSS 23.0 進行統計分析，計量資料經檢驗符合正態分布時用均數 ± 標準差（±s）表示，方差齊性采用 t 檢驗，方差不齊時用校正的 t 檢驗（即 t′檢驗）；分類變量采用卡方（ χ² ）檢驗。檢驗水準 α=0.05。

2 結果

2.1 納入研究對象的基本情況

納入 2017 年 11 月至 2018 年 11 月期間在我院首次入院并行手術治療的結直腸癌患者 38 例（研究組），男 24 例，女 14 例；年齡 49～73 歲、（60±7）歲；結腸癌 26 例，直腸癌 12 例；TNM 分期Ⅰ期 3 例、Ⅱ期 12 例、Ⅲ期 10 例、Ⅳ期 13 例，癌胚抗原（CEA）水平<5 μg/L 者 14 例，≥5 μg/L 者 24 例。對照組共納入 37 例，男 20 例，女 17 例；年齡 49～73 歲、（62±7）歲。2 組性別和年齡均匹配，差異無統計學意義（性別：χ²=0.64，P=0.42；年齡：t=1.44，P=0.16）。

2.2 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞及其亞群在研究組和對照組中的表達情況

結果見表 1。①在 PBMC 中，CD19⁺IL-10⁺ B 細胞和 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞含量在研究組中均明顯高于對照組（分別為：t=9.09，P<0.01；t=9.36，P<0.01）、CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 細胞含量在研究組中明顯低于對照組（t=6.15，P<0.01），而 CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^int B 細胞含量在 2 組間比較差異無統計學意義（t=1.78，P=0.08）。② CD19⁺IL-10⁺B 細胞和 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞含量在 TIL中的含量明顯高于在 NIL 中（分別為：t=11.67，P<0.01；t=19.64，P<0.01），而 CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^intB 細胞和 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 細胞含量在 TIL 中和 NIL 中比較差異無統計學意義（t=1.72，P=0.09；t=1.57，P=0.12）。

表1 CD19⁺ IL-10⁺ B 細胞及其亞群在研究組和對照組中的表達情況（%，

）

表選項

下載CSV

組別	n	CD19⁺IL-10⁺ B 細胞	CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞	CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^int B 細胞	CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 細胞
研究組
PMBC	38	8.04±3.01^*	2.79±0.95^*	0.87±0.30	1.13±0.40^*
TIL	38	6.02±2.33^△	1.11±0.31^△	0.84±0.36	0.86±0.22
NIL	38	3.07±0.92	0.56±0.18	0.77±0.27	0.90±0.23
對照組
PMBC	37	3.31±1.09	1.13±0.53	0.77±0.21	1.75±0.48
與對照組 PMBC 比較，*P<0.01；與 NIL 比較，△P<0.01

2.3 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞及其亞群與結直腸癌患者臨床病理特征的相關性

結果見表 2。從表 2 可見，結直腸癌患者外周血中 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞及亞群與患者性別、腫瘤位置及血清 CEA 濃度均無關，CD19⁺IL-10⁺ B 細胞及亞群 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞均與腫瘤臨床分期有關，即在中晚期（Ⅲ+Ⅳ期）結直腸癌中明顯高于早期（Ⅰ+Ⅱ期）者（t=5.39，P<0.01；t=3.13，P<0.01），但未發現 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 細胞和 CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^int B 細胞與腫瘤臨床分期有關（P>0.05）。

表2 外周血中各細胞亞群占 CD19⁺ B 總細胞的比例與結直腸癌患者臨床病理特征的關系（%）

表選項

下載CSV

臨床病理特征	n	CD19⁺IL-10⁺ B 細胞		CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 細胞		CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞		CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^int B 細胞
性別
男	24	7.99±3.17	0.15	0.88	1.21±0.40	1.62	0.11	2.81±0.80	0.77	0.45	0.91±0.28	1.19	0.24
女	14	8.14±2.83	1.00±0.38	2.58±1.04	0.80±0.31
腫瘤位置
結腸	26	8.40±2.69	1.10	0.28	1.14±0.42	0.21	0.84	2.87±0.86	0.77	0.45	0.85±0.33	0.69	0.49
直腸	12	7.26±3.61	1.11±0.37	2.61±1.16	0.92±0.20
腫瘤分期
Ⅰ+Ⅱ	15	5.58±2.02	5.39	<0.01	1.00±0.33	1.67	0.10	2.25±1.06	3.13	<0.01	0.85±0.28	0.28	0.78
Ⅲ+Ⅳ	23	9.65±2.42	1.22±0.43	3.14±0.70	0.88±0.31
CEA
≥5 μg/L	24	8.28±3.19	0.63	0.53	1.18±0.41	1.03	0.31	2.98±0.90	1.68	0.10	0.90±0.28	0.70	0.49
<5 μg/L	14	7.64±2.76	1.05±0.39	2.46±0.99	0.83±0.33

3 討論

Breg 是具有免疫調節或免疫抑制特性的 B 細胞的特殊亞群。但 Breg 自發現以來，未發現類似于 Treg 中的作為標志的核轉錄因子 FoxP3 那樣的特定表面標志物^[23]，但 Breg 分泌的各種細胞因子與抑制腫瘤免疫效應有關，主要有 IL-10、IL-35、IL-6 和轉化生長因子-β，其調節功能主要由 IL-10 發揮，因此，IL-10 仍然是定義人 Breg 的最佳表型標志物^[24-25]。CD19 是鑒定 B 細胞最好的標志，CD24 是鑒定 B 細胞等成熟與否的標志，在外周血中 CD38 表達于 T 和 B 細胞。Carsetti 等^[22]將 CD19⁺ B 細胞分為 3 種不同的 B 細胞亞群即 CD19⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞（包含未成熟 B 細胞）、CD19⁺CD24^intCD38^int B 細胞（主要是成熟 B 細胞）和 CD19⁺CD24^hiCD38^– B 細胞（主要是記憶 B 細胞），各亞群分泌 IL-10 能力不同，在免疫方面具有不同的功能^{[19, 26]}。在胃癌^[19]研究中，CD19⁺IL-10⁺ B 細胞具有免疫抑制功能，其中主要是 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞具有免疫調節功能，促進了腫瘤的進展，而 CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^int B 細胞和 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 細胞都能表達 IL-10，但未發現其免疫抑制功能，具體原因不明，猜測可能原因是該兩種細胞 IL-10 表達量低于 CD19⁺IL-10⁺CD24 ^hiCD38^hi B 細胞有關。因此，這 3 種亞群細胞雖然都能表達 IL-10，但不是都具有免疫抑制功能，是否與 CD24 與 CD38 的高表達情況有關還需要進一步探討。

Shimabukuro-Vornhagen 等^[27]在結直腸癌研究中提出 CD19⁺CD20⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞具有免疫調節功能，但該細胞亞群在結直腸癌患者和健康人外周血中并無明顯差別，可能是研究中未分析與 IL-10之間的免疫關系。目前關于 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞與結直腸癌之間的研究較少，CD19⁺IL-10⁺ B 細胞的所有亞群是否在結直腸癌中都具有免疫調節功能在國內外研究中未見報道。因此，本研究探討了 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞亞群含量在結直腸癌中的變化及其可能臨床意義。

在本研究中發現，在結直腸癌患者外周血中 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞含量明顯高于健康自愿者、在結直腸癌患者的癌組織中明顯高于其相應的癌旁組織，這與在其他研究^{[19, 21]}結果基本一致。結果提示，結直腸癌中 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞具有免疫調節功能，促進了腫瘤的進展，其中可能主要是 IL-10 發揮了免疫抑制功能并參與了腫瘤微環境的免疫調節。

CD19⁺IL-10⁺ B 細胞各亞群是否都具有免疫調節功能目前尚不清楚，因此，本研究對此進行了研究。結果發現，CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞亞群在結直腸癌患者的外周血中明顯高于健康對照組，且在結直腸癌患者的癌組織中明顯高于癌旁組織，結果提示，該亞群發揮了免疫抑制功能，這與其他研究^{[19, 28]}結論較一致，但這與 Shimabukuro-Vornhagen 等^[27]的研究結果不同，可能原因是該研究中并沒有包括 IL-10，且以 CD19⁺CD20⁺ B 淋巴細胞進行設門，門控策略方式不同，導致在結直腸癌患者和健康人外周血中并沒有明顯的區別。

CD19⁺IL-10⁺CD24^intCD38^int B 細胞亞群在結直腸癌與健康對照組患者的外周血以及結直腸癌患者的癌組織及其相應的癌旁組織之間均無明顯差別，這與胃癌的結論不一致^[19]，具體原因還需更多的研究進行分析。CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^– B 細胞含量在結直腸癌患者的外周血中低于健康對照組，這與其他研究^{[19, 26]}結論相似，但在結直腸癌患者的癌組織與其相應的癌旁組織之間無明顯差別，結果提示，該亞群可能具有促進腫瘤免疫的功能，但在腫瘤微環境中卻無明顯變化，這需要更多的研究來探討該亞群在全身和局部微環境之間的表現差異以及可能的免疫機制。

本研究還分析了結直腸癌患者的外周血中 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞及其亞群與不同臨床病理因素的關系，結果發現，CD19⁺IL-10⁺ B 細胞及其亞群與結直腸癌患者的性別、腫瘤位置及 CEA 濃度之間無明顯關系，但發現了 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞及 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞與結直腸癌的臨床分期有關，即在中晚期（Ⅲ+Ⅳ期）結直腸癌中的含量是明顯高于早期（Ⅰ+Ⅱ期）者，這在其他消化道腫瘤中也有類似結論，如在胃癌研究中也發現 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞含量隨著 TNM 分期增加是明顯增高的^[19]。結果提示，CD19⁺IL-10⁺ B 細胞及 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞亞群可能與結直腸癌發生及進展有關。

總之，在結直腸癌患者外周血中 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞含量明顯高于健康自愿者、在結直腸癌患者的癌組織中明顯高于其相應的癌旁組織的結果提示，CD19⁺IL-10⁺ B 細胞在腫瘤微環境中具有免疫抑制功能；但在其 3 種亞群中僅發現 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞亞群在其中有明顯差別，可見 IL-10 免疫抑制作用可能與 CD24 和 CD38 高表達有關，同樣也說明該亞群可能具有抑制腫瘤局部免疫的特性，若能局部消除該亞群細胞或許可為結直腸癌靶向治療提供新的方向。另外，結直腸癌患者外周血中 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞和 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hiB 細胞含量在Ⅲ+Ⅳ期結直腸癌的含量均明顯高于Ⅰ+Ⅱ期，而在其他兩種亞群細胞中未見這種規律，結果提示，結直腸癌中 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞可能具促進腫瘤進展的作用，并且其中主要是 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞發揮作用的，而其他兩種亞群細胞可能并沒有發揮免疫調節功能，可見，并不是所有 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞亞群都發揮免疫抑制功能，所以可選擇性地消除 CD19⁺IL-10⁺CD24^hiCD38^hi B 細胞而非所有的 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞，可能為結直腸癌靶向治療提供了新的方向。但是由于本研究條件有限，未能進一步分選出 CD19⁺IL-10⁺ B 細胞亞群進行更多體外實驗的功能和機制的探討，且目前 Breg 特異性表型及轉錄因子并不明確，還需要更多研究探討 Breg 免疫調控機制。

重要聲明

利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。

作者貢獻聲明：許杰負責實驗及文章的撰寫及投稿，陳小龍、胡欣雨、左宗林和陳鵬負責資料的收集，馮立波和鄒慶偉負責文章的指導，夏冬負責研究的設計和指導。

倫理聲明：本研究通過了西南醫科大學附屬醫院倫理委員會審批（倫理編號：KY2017129）。