引用本文： 錢昌林, 沈志勇, 張捷, 邱偉箐, 劉驊. 膽固醇結石差異lncRNA表達基因的分析及其功能研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(6): 654-661. doi: 10.7507/1007-9424.201902072 復制
膽結石是普外科最常見的疾病之一，在西方國家成年人中發病率達 5%～25%[1]。在我國，隨著經濟的發展和生活方式的西式化，其發病率也有逐年上升的趨勢。研究[2]顯示，當前上海地區人群總體膽石病患病率為 7.02%，膽囊切除率為 2.48%。雖然膽結石患者中有 75% 為無癥狀者，但一旦出現癥狀或者并發癥，就會嚴重影響居民的健康和生活質量，同時帶來了沉重的經濟和醫療衛生資源負擔[3]。膽結石形成的危險因素有很多，包括年齡、女性、種族及致石基因因素，同時代謝綜合征、飲食因素、膽囊功能的缺陷及藥物的因素對其形成也起到了重要作用。有關膽結石的最終形成原因主要包含以下幾個方面：致石相關基因，包括 LITH 基因等；肝臟膽固醇過多分泌；過飽和膽囊膽汁的形成；膽囊收縮功能的受損；小腸吸收功能的影響[4]。目前，關于長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）調控膽固醇結石的相關研究少見報道。本研究通過建立小鼠成石模型，給予或不給予熊脫氧膽酸藥物治療，分析小鼠肝臟組織中的差異表達 lncRNA 基因，并通過生物信息學方法初步探討差異基因的生物學功能。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要材料和設備
實驗動物：C57BL/6 雄性（購自北京維通利華實驗動物公司）小鼠 24 只，飼養動物房為 SPF 級，體質量 20～22 g，10 周齡。主要材料：總膽固醇（T-CHO）測試盒、總膽紅素（TBIL）檢測試劑盒（化學氧化法）及總膽汁酸（TBA）測試盒均購于南京建成生物工程研究所，NEBNext? UltraRNA 文庫制備試劑盒（New England Biolabs 公司），TRIzol? Plus RNA 純化試劑盒、SuperScriptTM Ⅲ第一鏈合成 SuperMix、TRIzol 試劑盒以及 Qubit 2.0 Fluorometer（Invitrogen 公司），RNase-Free DNase Set 和 RNeasy Mini Kit（Qiagen 公司），Power SYBR? Green PCR Master Mix（美國應用生物系統公司），AxyPrep Mag PCR Clean-up（Axygen 公司），Ribo-ZeroTM rRNA removal Kit（Mouse）、TruSeq PE Cluster Kit V4 試劑盒及 TruSeq SBS Kit V4-HS 試劑盒（Illumina 公司）。主要設備：3K-15 高速冷凍離心機（Sigma 公司），DU-640 紫外分光光度計（Beckman 公司），TU-10 恒溫金屬浴（上海一恒公司），CFX384 多重實時熒光定量 PCR 儀（美國 Bio-Rad 公司），Agilent 2100 生物分析儀和 Agilent2100 系統（美國 Agilent 科技有限公司），Multiskan Sky 全波長酶標儀和 NanoDrop（賽默飛世爾科技公司）。
1.2 動物建模及分組
小鼠適應性飼養 1 周后，開始分組造模。采用隨機數字表法將小鼠隨機分組為 2 組：膽固醇結石組 16 只，飼喂致石飼料 [致石飼料配方：基礎飼料+15.0%脂肪（豬油）+1.0%膽固醇+0.5%膽酸鈉]，連續飼養時間為 5 周；空白對照組 8 只，飼喂常規飼料（膽固醇含量 0.02%）。致石飼料和常規飼料均購于江蘇協同醫藥生物工程公司。16 只膽固醇結石小鼠采用隨機數字表法隨機分成 2 組：熊去氧膽酸組及模型對照組（每組 8 只）。熊去氧膽酸組小鼠予以熊去氧膽酸膠囊灌胃給藥，濃度為10 mg/（kg·d），連續給藥 2 周時間。模型對照組和空白對照組小鼠分別給予致石飲食及常規飼料飲食。熊去氧膽酸組給藥結束后，采用頸椎脫臼法處死 3 組小鼠。見膽固醇結石小鼠膽囊比空白對照組偏大，膽汁渾濁，顏色較暗，肉眼可見結石形成。對 3 組小鼠的膽囊進行拍照，取全部肝臟組織及膽囊膽汁，–80 ℃ 保存。
1.3 膽汁脂質分析
膽囊膽汁的膽固醇含量采用 T-CHO 測試盒檢測，直接膽紅素（DBIL）及 TBIL 含量測定采用 TBIL 檢測試劑盒（化學氧化法），膽囊中膽汁酸測定采用 TBA 測試盒。測定膽固醇含量時，先將膽汁離心 10 min（1 000 r/min，r=6 cm），取上清測定，在空白孔、校準孔及樣本孔中分別置入蒸餾水 2.5 μL、校準品 2.5 μL 及樣本 2.5 μL，再加入工作液 250 μL。混勻，37 ℃ 孵育 10 min，以酶標儀（波長 510 nm）測定各孔吸光度（A）值。T-CHO 含量（mmol/L）=（樣本孔A值–空白孔A值）/（校準孔A值–空白孔A值）×5.17（mmol/L）。測定 TBA 含量時，在標準孔內加入校準品 3 μL、試劑一 200 μL 及試劑二 200 μL；測定孔內加入樣品 3 μL、試劑一 200 μL 及試劑二 200 μL。混勻，37 ℃ 孵育 1.5 min 后，以酶標儀（波長 405 nm）測定各孔A值，讀取 0、30、60、90 及 120 s 的A值，計算 ΔA/min [（A120 s–A0 s）/2]。TBA 含量（μmol/L）=ΔA測定孔/ΔA標準孔×40（μmol/L）。測定膽紅素含量時，于空白孔內加入雙蒸水 8 μL，試劑一 240 μL；測定孔內加入樣品8 μL，試劑一 240 μL。分別混勻，37 ℃ 孵育 3～5 min，以酶標儀（波長 450 nm）測定 A 值（A0 值）。分別加入試劑二 60 μL，混勻，37 ℃ 孵育5 min 后，再以酶標儀（波長 450 nm）測定 A 值（A1值）。ΔA=A0–A1。TBIL 的計算公式為：TBIL 濃度（μmol/L）=887.211×（ΔA測定孔–ΔA空白孔）+0.549 2；DBIL 的計算公式為：DBIL（μmol/L）=922.12×（ΔA測定孔–ΔA空白孔）–0.839 5。
1.4 lncRNA 表達譜測定
對上述 3 組小鼠肝臟組織分別進行 RNA 提取、RNA 樣品質量檢測、文庫構建、文庫純化、文庫檢測、文庫定量、測序簇的生成以及上機測序，嚴格質控每一步實驗過程，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求混樣后進行 Illumina HiSeq 測序。RNA 質量檢測采用 Agilent2100 系統，核糖體 RNA 去除采用 Ribo-ZeroTM rRNA removal Kit（Mouse）試劑盒，文庫構建采用 NEBNext? UltraTM Directional RNA Library Prep Kit for Illumina?，文庫純化采用 AxyPrep Mag PCR Clean-up，文庫檢測采用 Agilent2100 系統，文庫定量采用 Qubit 2.0 Fluorometer。Cbot 簇生成儀采用 TruSeq PE Cluster Kit V4 試劑盒，Hiseq（高通量測序）測序采用 TruSeq SBS Kit V4-HS 試劑盒。操作均按試劑盒說明書進行。對檢測的結果按照差異顯著性標準（差異基因表達變化 2 倍以上且P≤0.05）進行篩選，統計基因的差異表達情況，之后對 lncRNA 差異表達基因進行聚類分析。
1.5 生物信息學分析
對獲取的差異 lncRNA 基因進行 Cis-/Trans-靶基因的基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）Pathway 分析。GO 分析首先把所有差異表達基因向 Gene Ontology 數據庫的各個 term 映射，計算每個 term 的基因數目，然后應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在差異表達基因中顯著富集的 GO 條目。KEGG Pathway 顯著性富集分析以 KEGG Pathway 為單位，應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在差異表達基因中顯著性富集的 Pathway，以分析差異表達的 lncRNA 參與的細胞功能和信號通路，進一步推測 lncRNA 可能發揮的生物學作用。
1.6 統計學方法
統計學分析采用 GraphPad Prism 7.0 軟件，聚類分析采用 DAVID 分析軟件。計量資料以均數±標準差（
±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One Way ANOVA），兩兩比較采用 Tukey’s 檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 3 組小鼠的膽囊膽汁外觀及脂質分析結果
本組 16 只膽結石模型均制備成功。飼養 7 周后，空白對照組小鼠膽囊的膽汁透明，呈黃色；模型對照組小鼠給予 7 周致石飲食后，膽囊比空白對照組偏大，且膽汁渾濁，顏色較暗；熊去氧膽酸組小鼠經 2 周熊去氧膽酸給藥處理后，膽囊有明顯變化，大小與空白對照組接近，膽汁呈透明黃色，提示熊去氧膽酸對小鼠膽固醇結石起到治療效果。
膽囊膽汁脂質分析結果提示，模型對照組、熊脫氧膽酸組及空白對照組膽囊膽汁的 T-CHO 含量的差異有統計學意義（P<0.05），模型對照組較空白對照組和熊脫氧膽酸組明顯升高（P<0.05），但熊脫氧膽酸組與空白對照組比較差異無統計學意義（P=0.59），提示熊脫氧膽酸治療后效果明顯；而3 組的膽囊膽汁 TBA、TBIL 及 DBIL 含量比較差異均無統計學意義（P>0.05），具體見圖 1a–1e。膽囊膽汁脂質分析結果提示，T-CHO 含量變化在膽結石形成中起重要作用。
圖1
示 3 組小鼠的膽囊膽汁外觀及膽汁脂質分析結果
a：3 組小鼠的膽囊膽汁外觀；b：3 組小鼠的 T-CHO 含量結果；c：3 組小鼠的 TBA 含量結果；d：3 組小鼠的 TBIL 含量結果；e：3 組小鼠的 DBIL 含量結果；與空白對照組比較，*
2.2 3 組小鼠肝臟組織的 lncRNA 差異表達譜
相比空白對照組，模型對照組的肝臟組織中有 76 種 lncRNA 表達上調，88 種 lncRNA 表達下調。與空白對照組相比，熊脫氧膽酸組肝臟組織中有 261 種 lncRNA 表達上調，315 種 lncRNA 表達下調。同時對 lncRNA 差異表達基因進行聚類分析，以 log10（FPKM+1）值進行聚類，FPKM 為每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的碎片。聚類分析是對數據進行相似度計算，并根據相似度將數據進行分類，從而將具有相同功能或密切聯系的基因聚集成類，識別未知基因的功能或已知基因的未知功能，推斷是否共同參與同一代謝過程或細胞通路，其中紅色表示高表達基因，藍色表示低表達基因，聚類分析結果見圖 2a。顏色從藍到紅，表示基因表達量越高。另外，本研究對模型對照組及熊脫氧膽酸組的差異 lncRNA 基因構建維恩圖，見圖 2b。結果提示，有 49 種共同差異 lncRNA 表達基因，其具體名稱見表 1。
圖2
示差異 lncRNA 表達基因的聚類分析結果、差異 lncRNA 表達基因的維恩圖、GO 富集柱狀圖及 KEGG 富集散點圖
a：差異 lncRNA 表達基因的聚類分析結果；b：模型對照組及熊脫氧膽酸組差異 lncRNA 表達基因的維恩圖；c：空白對照組與模型對照組 lncRNA 的 GO 富集柱狀圖；d：空白對照組與熊去氧膽酸組 lncRNA 的 GO 富集柱狀圖；e：空白對照組與模型對照組 lncRNA 的 KEGG 富集散點圖；f：空白對照組與熊去氧膽酸組 lncRNA 的 KEGG 富集散點圖；UDCA 代表熊去氧膽酸，NC 表示空白對照，Model 表示模型對照
表1
模型對照組及熊脫氧膽酸組共同的差異 lncRNA 表達基因
2.3 差異表達 lncRNA 靶基因的 GO 富集柱狀圖
構建差異表達 lncRNA 靶基因的 GO 富集柱狀圖，以反映在生物過程（biological process）、細胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）富集 GO term 上的差異基因分布，結果見圖 2c 和圖 2d，圖中選擇了富集最顯著的 GO term 進行展示。其中縱坐標為富集的 GO term，橫坐標為該 term 中的差異基因個數。不同顏色用來區分生物過程、細胞組分和分子功能。將差異基因進行 GO 分析后發現，模型對照組與空白對照組的差異基因富集得到 88 個 GO term，其中分子功能富集差異基因最多的 term 有結合（binding）、催化活性（catalytic activity）和酶調節活性（enzyme regulator activity）。細胞組分富集差異基因最多的 term 有細胞組分（cell part）、細胞器（organelle）和膜（membrane）。生物過程富集差異基因最多的 term 有生物調節（biological regulation）、單一生物過程（single-organism process）和細胞過程（cellular process）。熊去氧膽酸組與空白對照組的差異基因富集得到 205 個 GO term，其中分子功能富集差異基因最多的 term 有結合、催化活性和分子傳感器活動（molecular transducer activity）。細胞組分富集差異基因最多的 term 有細胞組分、細胞器和膜。生物過程富集差異基因最多的 term 有生物調節、細胞過程和單一生物過程。
空白對照組與模型對照組相比，GO term 富集最顯著的有低密度脂蛋白、乳糜微粒、極低密度脂蛋白顆粒、富含甘油三酯的脂蛋白顆粒、血漿脂蛋白顆粒、蛋白質脂肪酰化、脂蛋白運輸等。空白對照組與熊去氧膽酸組相比，GO term 富集最顯著的有磷脂酰肌醇結合、蛋白激酶活化劑活性、激酶活化劑活性、皮質肌動蛋白細胞骨架組織、蛋白磷酸酶 4 復合物等。
2.4 差異表達 lncRNA 靶基因的 KEGG 富集散點圖
構建差異表達 lncRNA 靶基因的 KEGG 富集散點圖，KEGG 富集程度通過 rich factor、Q值和富集到此通路上的基因個數來衡量。rich factor 越大，提示富集的程度越大。Q值越接近于零，提示富集越顯著。圖 2e 和圖 2f 顯示了富集最顯著的 pathway條目，其中縱軸表示 pathway 名稱，橫軸表示 rich factor，點的大小表示此 pathway 中差異表達基因的個數多少，而點的顏色對應于不同的Q值。將差異基因進行 KEGG pathway 分析后發現，模型對照組與空白對照組的差異基因富集得到 18 條 pathway，熊去氧膽酸組與空白對照組的差異基因富集得到 20 條 pathway。通過 KEGG 分析發現，結石相關較密切的通路包括蛋白質輸出、甘油脂類代謝、甘油磷脂代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、糖尿病、膽汁分泌、初級膽汁酸生物合成、視黃醇代謝等通路。
空白對照組與模型對照組相比差異基因 KEGG pathway 分析顯示的富集程度最顯著的生物學通路包括蛋白質輸出、甘油脂類代謝、甘油磷脂代謝、減數分裂-酵母、腎素-血管緊張素系統、賴氨酸降解、不飽和脂肪酸的生物合成、藥物代謝-其他酶、牛磺酸和亞牛磺酸代謝、范可尼貧血途徑、晝夜節律、青少年發病的成年型糖尿病、RNA 降解、甲狀腺癌、硫辛酸代謝、膽汁分泌、初級膽汁酸生物合成及過氧物酶體。空白對照組與模型對照組相比，差異基因 KEGG pathway 分析顯示的富集程度最顯著的生物學通路包括肌醇磷酸代謝、卵母細胞減數分裂、黑素瘤、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路、肥厚型心肌病（HCM）、RNA 降解、自噬調節、緊密連接、青少年發病的成年型糖尿病、內質網中的蛋白質加工、p53 信號通路、側索硬化（ALS）、擴張型心肌病、卵巢類固醇生成、長期抑郁癥、視黃醇代謝、膠質瘤、半乳糖代謝、醛固酮調節的鈉重吸收及賴氨酸降解。
3 討論
目前認為，膽囊過飽和膽汁的形成是膽囊結石發生發展的先決條件，膽汁脂質代謝異常致膽汁中膽固醇溶解度的理化性質失衡，形成過飽和的膽囊膽汁[5-6]，膽固醇從過飽和膽汁中析出并形成膽固醇單水結晶，進而形成膽囊膽固醇結石[7]。膽汁膽固醇的溶解形式主要是“微膠團”和“膽汁泡”，兩者在膽汁中處于一個動態平衡的狀態，微膠粒中的膽固醇不直接以結晶析出，而是將膽固醇轉移到膽汁泡中再結晶析出膽固醇。膽汁脂質代謝異常影響到膽固醇、磷脂及膽汁酸的比例，致使過飽和膽汁的形成。陳敏等[8]探討了血漿 Apo B 基因 rs676210 和 rs2854725 位點多態性與膽囊結石之間的關系，結果提示，rs676210 和 rs2854725 位點的基因多態性與膽囊結石無關；但無膽囊結石即健康對照者 rs2854725 位點的基因多態性在維吾爾族和漢族間可能存在差異，可能與結石形成相關。有研究[9]提示，成纖維細胞生長因子受體 4（FGFR4）可通過調控膽固醇 7α-羥化酶（CYP7A1）影響膽汁酸的代謝平衡，同時 FGFR4 基因 Gly388Arg（G-388R）的多態性可抑制膽汁酸的合成，可能是膽結石形成的基因影響因素。另有研究[10]表明，miRNA-122a 和 miRNA-422a 直接抑制 CYP7A1 基因，參與膽汁酸的調控。多配體 B 類清道夫受體 CD36 可促進游離脂肪酸的攝取，也可調節肝臟和小腸膽固醇的代謝[11]。研究[12]顯示，CD36 基因敲除可降低膽汁膽固醇的分泌和改變膽汁酸池的親水性傾向，增加膽囊的收縮功能，從而達到修飾小鼠結石易感性的目的，可預防膽結石的形成。Asai 等[13]的研究表明，在脂肪肝小鼠中，低氧條件下誘導缺氧誘導因子 1a（HIF1A）的上調可降低水通道蛋白 8（AQP8）的表達水平，并增加了膽汁脂質的集聚，增加了膽結石的形成。Yang 等[14]研究了膽結石人群的 miRNA 及 mRNA 表達，鑒定出了 17 種 miRNAs 及 525 種 mRNA 差異基因，同時在人膽囊上皮細胞中發現，miRNA-210 可下調三磷酸腺苷酶 11A（ATP11A）的表達。
lncRNA 是長度大于 200 個核苷酸的非編碼 RNA，lncRNA 可通過與 DNA/RNA 結合或與蛋白結合而行使其功能。一些 lncRNA 實際上是某些調控 RNA（如 miRNA 或 piwi RNA）的前體。與 miRNA 不同的是，lncRNA 沒有一種普遍的作用模式，它以許多不同的方式來調控基因表達和蛋白合成[15]。目前研究[16-20]顯示，lncRNA 對脂質代謝及其他疾病都有重要的調控作用，但其與膽固醇結石的相關性研究仍較少。研究[21]顯示，Lnc-HC 可以在轉錄后水平通過結合 hnRNPA2B1，而調控 CYP7A1 和 Abca11 基因的表達。在高血脂及動脈粥樣硬化患者中鑒定出的 lncRNA CHROME 可以調節細胞內及循環系統的膽固醇代謝，在肝細胞中敲除 CHROME 基因后發現，miR-27b、miR-33a、miR-33b 和 miR-128 的表達均上調[22]。
在本實驗中，筆者成功建立了 C57BL/6 小鼠膽固醇結石模型及熊去氧膽酸給藥模型，并分析了各組小數膽囊膽汁中的脂質含量，結果顯示：空白對照組小鼠膽囊的膽汁透明，呈黃色，而模型對照組組小鼠的膽囊比空白對照組偏大，且膽汁渾濁，顏色較暗。熊去氧膽酸組小鼠經 2 周熊去氧膽酸給藥處理后，膽囊有明顯變化，大小恢復正常表現且膽汁呈透明黃色，提示熊去氧膽酸對膽固醇結石小鼠起到較明顯的治療效果。模型對照組、熊脫氧膽酸組及空白對照組膽囊膽汁的 T-CHO 含量比較差異有統計學意義（P<0.05），模型對照組較空白對照組和熊去氧膽酸組高，而熊去氧膽酸組與空白對照組無明顯差異，提示熊去氧膽酸治療后效果明顯；3 組小鼠的膽囊膽汁 TBA、TBIL 及 DBIL 含量比較差異均無統計學意義。這些結果提示，膽固醇含量變化在膽結石形成中起重要作用。
此外，本研究分析了 3 組小鼠肝臟組織的差異表達 lncRNA，并進行了生物學信息分析，包括 GO 分析和 KEGG pathway 分析。結果表明，空白對照組與模型對照組相比，GO term 富集最顯著的有低密度脂蛋白、乳糜微粒、極低密度脂蛋白顆粒、富含甘油三酯的脂蛋白顆粒、血漿脂蛋白顆粒、蛋白質脂肪酰化、脂蛋白運輸等，差異基因 KEGG pathway 分析顯示的富集程度最顯著的生物學通路包括蛋白質輸出、甘油脂類代謝、甘油磷脂代謝、減數分裂-酵母、腎素-血管緊張素系統、賴氨酸降解、不飽和脂肪酸的生物合成、藥物代謝-其他酶、牛磺酸和亞牛磺酸代謝、范可尼貧血途徑、晝夜節律、青少年發病的成年型糖尿病、RNA 降解、甲狀腺癌、硫辛酸代謝、膽汁分泌、初級膽汁酸生物合成及過氧物酶體。空白對照組與熊去氧膽酸組相比，GO term 富集最顯著的有磷脂酰肌醇結合、蛋白激酶活化劑活性、激酶活化劑活性、皮質肌動蛋白細胞骨架組織、蛋白磷酸酶 4 復合物等，差異基因 KEGG pathway 分析顯示的富集程度最顯著的生物學通路包括肌醇磷酸代謝、卵母細胞減數分裂、黑素瘤、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路、肥厚型心肌病（HCM）、RNA 降解、自噬調節、緊密連接、青少年發病的成年型糖尿病、內質網中的蛋白質加工、p53 信號通路、側索硬化（ALS）、擴張型心肌病、卵巢類固醇生成、長期抑郁癥、視黃醇代謝、膠質瘤、半乳糖代謝、醛固酮調節的鈉重吸收及賴氨酸降解。通過 KEGG pathway 分析，結合既往研究及文獻檢索，筆者總結，結石相關較密切的通路包括甘油代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、糖尿病、膽汁分泌、初級膽汁酸生物合成、視黃醇代謝等通路[23-26]，但差異 lncRNA 通過上述通路參與調節結石形成的具體機制有待于進一步探討及驗證。
本實驗成功構建了小鼠成石及熊去氧膽酸治療模型，篩選出了 lncRNA 調控的差異表達基因及通路，對膽固醇結石發生及其機制研究有重要作用，熊脫氧膽酸組的 lncRNA 差異表達基因為其在預防結石形中的分子機制研究提供了理論依據，但其具體機制有待于進一步深入研究。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：錢昌林（第一作者）直接參與設計實驗、實施研究、采集數據、分析數據、文章撰寫等；沈志勇、張捷及邱偉箐參與實驗設計、數據采集等；劉驊（通信作者）直接參與設計實驗、實施研究、分析數據、對文章內容作批評性審閱等。
倫理審批聲明：本研究通過了上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院的倫理審批 ［審批文號：仁濟科倫審（2015）W029 號］；實驗動物使用許可證 ［SYXX（滬）2015-0011］。
膽結石是普外科最常見的疾病之一，在西方國家成年人中發病率達 5%～25%[1]。在我國，隨著經濟的發展和生活方式的西式化，其發病率也有逐年上升的趨勢。研究[2]顯示，當前上海地區人群總體膽石病患病率為 7.02%，膽囊切除率為 2.48%。雖然膽結石患者中有 75% 為無癥狀者，但一旦出現癥狀或者并發癥，就會嚴重影響居民的健康和生活質量，同時帶來了沉重的經濟和醫療衛生資源負擔[3]。膽結石形成的危險因素有很多，包括年齡、女性、種族及致石基因因素，同時代謝綜合征、飲食因素、膽囊功能的缺陷及藥物的因素對其形成也起到了重要作用。有關膽結石的最終形成原因主要包含以下幾個方面：致石相關基因，包括 LITH 基因等；肝臟膽固醇過多分泌；過飽和膽囊膽汁的形成；膽囊收縮功能的受損；小腸吸收功能的影響[4]。目前，關于長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）調控膽固醇結石的相關研究少見報道。本研究通過建立小鼠成石模型，給予或不給予熊脫氧膽酸藥物治療，分析小鼠肝臟組織中的差異表達 lncRNA 基因，并通過生物信息學方法初步探討差異基因的生物學功能。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、主要材料和設備
實驗動物：C57BL/6 雄性（購自北京維通利華實驗動物公司）小鼠 24 只，飼養動物房為 SPF 級，體質量 20～22 g，10 周齡。主要材料：總膽固醇（T-CHO）測試盒、總膽紅素（TBIL）檢測試劑盒（化學氧化法）及總膽汁酸（TBA）測試盒均購于南京建成生物工程研究所，NEBNext? UltraRNA 文庫制備試劑盒（New England Biolabs 公司），TRIzol? Plus RNA 純化試劑盒、SuperScriptTM Ⅲ第一鏈合成 SuperMix、TRIzol 試劑盒以及 Qubit 2.0 Fluorometer（Invitrogen 公司），RNase-Free DNase Set 和 RNeasy Mini Kit（Qiagen 公司），Power SYBR? Green PCR Master Mix（美國應用生物系統公司），AxyPrep Mag PCR Clean-up（Axygen 公司），Ribo-ZeroTM rRNA removal Kit（Mouse）、TruSeq PE Cluster Kit V4 試劑盒及 TruSeq SBS Kit V4-HS 試劑盒（Illumina 公司）。主要設備：3K-15 高速冷凍離心機（Sigma 公司），DU-640 紫外分光光度計（Beckman 公司），TU-10 恒溫金屬浴（上海一恒公司），CFX384 多重實時熒光定量 PCR 儀（美國 Bio-Rad 公司），Agilent 2100 生物分析儀和 Agilent2100 系統（美國 Agilent 科技有限公司），Multiskan Sky 全波長酶標儀和 NanoDrop（賽默飛世爾科技公司）。
1.2 動物建模及分組
小鼠適應性飼養 1 周后，開始分組造模。采用隨機數字表法將小鼠隨機分組為 2 組：膽固醇結石組 16 只，飼喂致石飼料 [致石飼料配方：基礎飼料+15.0%脂肪（豬油）+1.0%膽固醇+0.5%膽酸鈉]，連續飼養時間為 5 周；空白對照組 8 只，飼喂常規飼料（膽固醇含量 0.02%）。致石飼料和常規飼料均購于江蘇協同醫藥生物工程公司。16 只膽固醇結石小鼠采用隨機數字表法隨機分成 2 組：熊去氧膽酸組及模型對照組（每組 8 只）。熊去氧膽酸組小鼠予以熊去氧膽酸膠囊灌胃給藥，濃度為10 mg/（kg·d），連續給藥 2 周時間。模型對照組和空白對照組小鼠分別給予致石飲食及常規飼料飲食。熊去氧膽酸組給藥結束后，采用頸椎脫臼法處死 3 組小鼠。見膽固醇結石小鼠膽囊比空白對照組偏大，膽汁渾濁，顏色較暗，肉眼可見結石形成。對 3 組小鼠的膽囊進行拍照，取全部肝臟組織及膽囊膽汁，–80 ℃ 保存。
1.3 膽汁脂質分析
膽囊膽汁的膽固醇含量采用 T-CHO 測試盒檢測，直接膽紅素（DBIL）及 TBIL 含量測定采用 TBIL 檢測試劑盒（化學氧化法），膽囊中膽汁酸測定采用 TBA 測試盒。測定膽固醇含量時，先將膽汁離心 10 min（1 000 r/min，r=6 cm），取上清測定，在空白孔、校準孔及樣本孔中分別置入蒸餾水 2.5 μL、校準品 2.5 μL 及樣本 2.5 μL，再加入工作液 250 μL。混勻，37 ℃ 孵育 10 min，以酶標儀（波長 510 nm）測定各孔吸光度（A）值。T-CHO 含量（mmol/L）=（樣本孔A值–空白孔A值）/（校準孔A值–空白孔A值）×5.17（mmol/L）。測定 TBA 含量時，在標準孔內加入校準品 3 μL、試劑一 200 μL 及試劑二 200 μL；測定孔內加入樣品 3 μL、試劑一 200 μL 及試劑二 200 μL。混勻，37 ℃ 孵育 1.5 min 后，以酶標儀（波長 405 nm）測定各孔A值，讀取 0、30、60、90 及 120 s 的A值，計算 ΔA/min [（A120 s–A0 s）/2]。TBA 含量（μmol/L）=ΔA測定孔/ΔA標準孔×40（μmol/L）。測定膽紅素含量時，于空白孔內加入雙蒸水 8 μL，試劑一 240 μL；測定孔內加入樣品8 μL，試劑一 240 μL。分別混勻，37 ℃ 孵育 3～5 min，以酶標儀（波長 450 nm）測定 A 值（A0 值）。分別加入試劑二 60 μL，混勻，37 ℃ 孵育5 min 后，再以酶標儀（波長 450 nm）測定 A 值（A1值）。ΔA=A0–A1。TBIL 的計算公式為：TBIL 濃度（μmol/L）=887.211×（ΔA測定孔–ΔA空白孔）+0.549 2；DBIL 的計算公式為：DBIL（μmol/L）=922.12×（ΔA測定孔–ΔA空白孔）–0.839 5。
1.4 lncRNA 表達譜測定
對上述 3 組小鼠肝臟組織分別進行 RNA 提取、RNA 樣品質量檢測、文庫構建、文庫純化、文庫檢測、文庫定量、測序簇的生成以及上機測序，嚴格質控每一步實驗過程，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求混樣后進行 Illumina HiSeq 測序。RNA 質量檢測采用 Agilent2100 系統，核糖體 RNA 去除采用 Ribo-ZeroTM rRNA removal Kit（Mouse）試劑盒，文庫構建采用 NEBNext? UltraTM Directional RNA Library Prep Kit for Illumina?，文庫純化采用 AxyPrep Mag PCR Clean-up，文庫檢測采用 Agilent2100 系統，文庫定量采用 Qubit 2.0 Fluorometer。Cbot 簇生成儀采用 TruSeq PE Cluster Kit V4 試劑盒，Hiseq（高通量測序）測序采用 TruSeq SBS Kit V4-HS 試劑盒。操作均按試劑盒說明書進行。對檢測的結果按照差異顯著性標準（差異基因表達變化 2 倍以上且P≤0.05）進行篩選，統計基因的差異表達情況，之后對 lncRNA 差異表達基因進行聚類分析。
1.5 生物信息學分析
對獲取的差異 lncRNA 基因進行 Cis-/Trans-靶基因的基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）Pathway 分析。GO 分析首先把所有差異表達基因向 Gene Ontology 數據庫的各個 term 映射，計算每個 term 的基因數目，然后應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在差異表達基因中顯著富集的 GO 條目。KEGG Pathway 顯著性富集分析以 KEGG Pathway 為單位，應用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，在差異表達基因中顯著性富集的 Pathway，以分析差異表達的 lncRNA 參與的細胞功能和信號通路，進一步推測 lncRNA 可能發揮的生物學作用。
1.6 統計學方法
統計學分析采用 GraphPad Prism 7.0 軟件，聚類分析采用 DAVID 分析軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One Way ANOVA），兩兩比較采用 Tukey’s 檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 3 組小鼠的膽囊膽汁外觀及脂質分析結果
本組 16 只膽結石模型均制備成功。飼養 7 周后，空白對照組小鼠膽囊的膽汁透明，呈黃色；模型對照組小鼠給予 7 周致石飲食后，膽囊比空白對照組偏大，且膽汁渾濁，顏色較暗；熊去氧膽酸組小鼠經 2 周熊去氧膽酸給藥處理后，膽囊有明顯變化，大小與空白對照組接近，膽汁呈透明黃色，提示熊去氧膽酸對小鼠膽固醇結石起到治療效果。
膽囊膽汁脂質分析結果提示，模型對照組、熊脫氧膽酸組及空白對照組膽囊膽汁的 T-CHO 含量的差異有統計學意義（P<0.05），模型對照組較空白對照組和熊脫氧膽酸組明顯升高（P<0.05），但熊脫氧膽酸組與空白對照組比較差異無統計學意義（P=0.59），提示熊脫氧膽酸治療后效果明顯；而3 組的膽囊膽汁 TBA、TBIL 及 DBIL 含量比較差異均無統計學意義（P>0.05），具體見圖 1a–1e。膽囊膽汁脂質分析結果提示，T-CHO 含量變化在膽結石形成中起重要作用。
圖1
示 3 組小鼠的膽囊膽汁外觀及膽汁脂質分析結果
a：3 組小鼠的膽囊膽汁外觀；b：3 組小鼠的 T-CHO 含量結果；c：3 組小鼠的 TBA 含量結果；d：3 組小鼠的 TBIL 含量結果；e：3 組小鼠的 DBIL 含量結果；與空白對照組比較，*
2.2 3 組小鼠肝臟組織的 lncRNA 差異表達譜
相比空白對照組，模型對照組的肝臟組織中有 76 種 lncRNA 表達上調，88 種 lncRNA 表達下調。與空白對照組相比，熊脫氧膽酸組肝臟組織中有 261 種 lncRNA 表達上調，315 種 lncRNA 表達下調。同時對 lncRNA 差異表達基因進行聚類分析，以 log10（FPKM+1）值進行聚類，FPKM 為每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的碎片。聚類分析是對數據進行相似度計算，并根據相似度將數據進行分類，從而將具有相同功能或密切聯系的基因聚集成類，識別未知基因的功能或已知基因的未知功能，推斷是否共同參與同一代謝過程或細胞通路，其中紅色表示高表達基因，藍色表示低表達基因，聚類分析結果見圖 2a。顏色從藍到紅，表示基因表達量越高。另外，本研究對模型對照組及熊脫氧膽酸組的差異 lncRNA 基因構建維恩圖，見圖 2b。結果提示，有 49 種共同差異 lncRNA 表達基因，其具體名稱見表 1。
圖2
示差異 lncRNA 表達基因的聚類分析結果、差異 lncRNA 表達基因的維恩圖、GO 富集柱狀圖及 KEGG 富集散點圖
a：差異 lncRNA 表達基因的聚類分析結果；b：模型對照組及熊脫氧膽酸組差異 lncRNA 表達基因的維恩圖；c：空白對照組與模型對照組 lncRNA 的 GO 富集柱狀圖；d：空白對照組與熊去氧膽酸組 lncRNA 的 GO 富集柱狀圖；e：空白對照組與模型對照組 lncRNA 的 KEGG 富集散點圖；f：空白對照組與熊去氧膽酸組 lncRNA 的 KEGG 富集散點圖；UDCA 代表熊去氧膽酸，NC 表示空白對照，Model 表示模型對照
表1
模型對照組及熊脫氧膽酸組共同的差異 lncRNA 表達基因
2.3 差異表達 lncRNA 靶基因的 GO 富集柱狀圖
構建差異表達 lncRNA 靶基因的 GO 富集柱狀圖，以反映在生物過程（biological process）、細胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）富集 GO term 上的差異基因分布，結果見圖 2c 和圖 2d，圖中選擇了富集最顯著的 GO term 進行展示。其中縱坐標為富集的 GO term，橫坐標為該 term 中的差異基因個數。不同顏色用來區分生物過程、細胞組分和分子功能。將差異基因進行 GO 分析后發現，模型對照組與空白對照組的差異基因富集得到 88 個 GO term，其中分子功能富集差異基因最多的 term 有結合（binding）、催化活性（catalytic activity）和酶調節活性（enzyme regulator activity）。細胞組分富集差異基因最多的 term 有細胞組分（cell part）、細胞器（organelle）和膜（membrane）。生物過程富集差異基因最多的 term 有生物調節（biological regulation）、單一生物過程（single-organism process）和細胞過程（cellular process）。熊去氧膽酸組與空白對照組的差異基因富集得到 205 個 GO term，其中分子功能富集差異基因最多的 term 有結合、催化活性和分子傳感器活動（molecular transducer activity）。細胞組分富集差異基因最多的 term 有細胞組分、細胞器和膜。生物過程富集差異基因最多的 term 有生物調節、細胞過程和單一生物過程。
空白對照組與模型對照組相比，GO term 富集最顯著的有低密度脂蛋白、乳糜微粒、極低密度脂蛋白顆粒、富含甘油三酯的脂蛋白顆粒、血漿脂蛋白顆粒、蛋白質脂肪酰化、脂蛋白運輸等。空白對照組與熊去氧膽酸組相比，GO term 富集最顯著的有磷脂酰肌醇結合、蛋白激酶活化劑活性、激酶活化劑活性、皮質肌動蛋白細胞骨架組織、蛋白磷酸酶 4 復合物等。
2.4 差異表達 lncRNA 靶基因的 KEGG 富集散點圖
構建差異表達 lncRNA 靶基因的 KEGG 富集散點圖，KEGG 富集程度通過 rich factor、Q值和富集到此通路上的基因個數來衡量。rich factor 越大，提示富集的程度越大。Q值越接近于零，提示富集越顯著。圖 2e 和圖 2f 顯示了富集最顯著的 pathway條目，其中縱軸表示 pathway 名稱，橫軸表示 rich factor，點的大小表示此 pathway 中差異表達基因的個數多少，而點的顏色對應于不同的Q值。將差異基因進行 KEGG pathway 分析后發現，模型對照組與空白對照組的差異基因富集得到 18 條 pathway，熊去氧膽酸組與空白對照組的差異基因富集得到 20 條 pathway。通過 KEGG 分析發現，結石相關較密切的通路包括蛋白質輸出、甘油脂類代謝、甘油磷脂代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、糖尿病、膽汁分泌、初級膽汁酸生物合成、視黃醇代謝等通路。
空白對照組與模型對照組相比差異基因 KEGG pathway 分析顯示的富集程度最顯著的生物學通路包括蛋白質輸出、甘油脂類代謝、甘油磷脂代謝、減數分裂-酵母、腎素-血管緊張素系統、賴氨酸降解、不飽和脂肪酸的生物合成、藥物代謝-其他酶、牛磺酸和亞牛磺酸代謝、范可尼貧血途徑、晝夜節律、青少年發病的成年型糖尿病、RNA 降解、甲狀腺癌、硫辛酸代謝、膽汁分泌、初級膽汁酸生物合成及過氧物酶體。空白對照組與模型對照組相比，差異基因 KEGG pathway 分析顯示的富集程度最顯著的生物學通路包括肌醇磷酸代謝、卵母細胞減數分裂、黑素瘤、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路、肥厚型心肌病（HCM）、RNA 降解、自噬調節、緊密連接、青少年發病的成年型糖尿病、內質網中的蛋白質加工、p53 信號通路、側索硬化（ALS）、擴張型心肌病、卵巢類固醇生成、長期抑郁癥、視黃醇代謝、膠質瘤、半乳糖代謝、醛固酮調節的鈉重吸收及賴氨酸降解。
3 討論
目前認為，膽囊過飽和膽汁的形成是膽囊結石發生發展的先決條件，膽汁脂質代謝異常致膽汁中膽固醇溶解度的理化性質失衡，形成過飽和的膽囊膽汁[5-6]，膽固醇從過飽和膽汁中析出并形成膽固醇單水結晶，進而形成膽囊膽固醇結石[7]。膽汁膽固醇的溶解形式主要是“微膠團”和“膽汁泡”，兩者在膽汁中處于一個動態平衡的狀態，微膠粒中的膽固醇不直接以結晶析出，而是將膽固醇轉移到膽汁泡中再結晶析出膽固醇。膽汁脂質代謝異常影響到膽固醇、磷脂及膽汁酸的比例，致使過飽和膽汁的形成。陳敏等[8]探討了血漿 Apo B 基因 rs676210 和 rs2854725 位點多態性與膽囊結石之間的關系，結果提示，rs676210 和 rs2854725 位點的基因多態性與膽囊結石無關；但無膽囊結石即健康對照者 rs2854725 位點的基因多態性在維吾爾族和漢族間可能存在差異，可能與結石形成相關。有研究[9]提示，成纖維細胞生長因子受體 4（FGFR4）可通過調控膽固醇 7α-羥化酶（CYP7A1）影響膽汁酸的代謝平衡，同時 FGFR4 基因 Gly388Arg（G-388R）的多態性可抑制膽汁酸的合成，可能是膽結石形成的基因影響因素。另有研究[10]表明，miRNA-122a 和 miRNA-422a 直接抑制 CYP7A1 基因，參與膽汁酸的調控。多配體 B 類清道夫受體 CD36 可促進游離脂肪酸的攝取，也可調節肝臟和小腸膽固醇的代謝[11]。研究[12]顯示，CD36 基因敲除可降低膽汁膽固醇的分泌和改變膽汁酸池的親水性傾向，增加膽囊的收縮功能，從而達到修飾小鼠結石易感性的目的，可預防膽結石的形成。Asai 等[13]的研究表明，在脂肪肝小鼠中，低氧條件下誘導缺氧誘導因子 1a（HIF1A）的上調可降低水通道蛋白 8（AQP8）的表達水平，并增加了膽汁脂質的集聚，增加了膽結石的形成。Yang 等[14]研究了膽結石人群的 miRNA 及 mRNA 表達，鑒定出了 17 種 miRNAs 及 525 種 mRNA 差異基因，同時在人膽囊上皮細胞中發現，miRNA-210 可下調三磷酸腺苷酶 11A（ATP11A）的表達。
lncRNA 是長度大于 200 個核苷酸的非編碼 RNA，lncRNA 可通過與 DNA/RNA 結合或與蛋白結合而行使其功能。一些 lncRNA 實際上是某些調控 RNA（如 miRNA 或 piwi RNA）的前體。與 miRNA 不同的是，lncRNA 沒有一種普遍的作用模式，它以許多不同的方式來調控基因表達和蛋白合成[15]。目前研究[16-20]顯示，lncRNA 對脂質代謝及其他疾病都有重要的調控作用，但其與膽固醇結石的相關性研究仍較少。研究[21]顯示，Lnc-HC 可以在轉錄后水平通過結合 hnRNPA2B1，而調控 CYP7A1 和 Abca11 基因的表達。在高血脂及動脈粥樣硬化患者中鑒定出的 lncRNA CHROME 可以調節細胞內及循環系統的膽固醇代謝，在肝細胞中敲除 CHROME 基因后發現，miR-27b、miR-33a、miR-33b 和 miR-128 的表達均上調[22]。
在本實驗中，筆者成功建立了 C57BL/6 小鼠膽固醇結石模型及熊去氧膽酸給藥模型，并分析了各組小數膽囊膽汁中的脂質含量，結果顯示：空白對照組小鼠膽囊的膽汁透明，呈黃色，而模型對照組組小鼠的膽囊比空白對照組偏大，且膽汁渾濁，顏色較暗。熊去氧膽酸組小鼠經 2 周熊去氧膽酸給藥處理后，膽囊有明顯變化，大小恢復正常表現且膽汁呈透明黃色，提示熊去氧膽酸對膽固醇結石小鼠起到較明顯的治療效果。模型對照組、熊脫氧膽酸組及空白對照組膽囊膽汁的 T-CHO 含量比較差異有統計學意義（P<0.05），模型對照組較空白對照組和熊去氧膽酸組高，而熊去氧膽酸組與空白對照組無明顯差異，提示熊去氧膽酸治療后效果明顯；3 組小鼠的膽囊膽汁 TBA、TBIL 及 DBIL 含量比較差異均無統計學意義。這些結果提示，膽固醇含量變化在膽結石形成中起重要作用。
此外，本研究分析了 3 組小鼠肝臟組織的差異表達 lncRNA，并進行了生物學信息分析，包括 GO 分析和 KEGG pathway 分析。結果表明，空白對照組與模型對照組相比，GO term 富集最顯著的有低密度脂蛋白、乳糜微粒、極低密度脂蛋白顆粒、富含甘油三酯的脂蛋白顆粒、血漿脂蛋白顆粒、蛋白質脂肪酰化、脂蛋白運輸等，差異基因 KEGG pathway 分析顯示的富集程度最顯著的生物學通路包括蛋白質輸出、甘油脂類代謝、甘油磷脂代謝、減數分裂-酵母、腎素-血管緊張素系統、賴氨酸降解、不飽和脂肪酸的生物合成、藥物代謝-其他酶、牛磺酸和亞牛磺酸代謝、范可尼貧血途徑、晝夜節律、青少年發病的成年型糖尿病、RNA 降解、甲狀腺癌、硫辛酸代謝、膽汁分泌、初級膽汁酸生物合成及過氧物酶體。空白對照組與熊去氧膽酸組相比，GO term 富集最顯著的有磷脂酰肌醇結合、蛋白激酶活化劑活性、激酶活化劑活性、皮質肌動蛋白細胞骨架組織、蛋白磷酸酶 4 復合物等，差異基因 KEGG pathway 分析顯示的富集程度最顯著的生物學通路包括肌醇磷酸代謝、卵母細胞減數分裂、黑素瘤、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路、肥厚型心肌病（HCM）、RNA 降解、自噬調節、緊密連接、青少年發病的成年型糖尿病、內質網中的蛋白質加工、p53 信號通路、側索硬化（ALS）、擴張型心肌病、卵巢類固醇生成、長期抑郁癥、視黃醇代謝、膠質瘤、半乳糖代謝、醛固酮調節的鈉重吸收及賴氨酸降解。通過 KEGG pathway 分析，結合既往研究及文獻檢索，筆者總結，結石相關較密切的通路包括甘油代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、糖尿病、膽汁分泌、初級膽汁酸生物合成、視黃醇代謝等通路[23-26]，但差異 lncRNA 通過上述通路參與調節結石形成的具體機制有待于進一步探討及驗證。
本實驗成功構建了小鼠成石及熊去氧膽酸治療模型，篩選出了 lncRNA 調控的差異表達基因及通路，對膽固醇結石發生及其機制研究有重要作用，熊脫氧膽酸組的 lncRNA 差異表達基因為其在預防結石形中的分子機制研究提供了理論依據，但其具體機制有待于進一步深入研究。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：錢昌林（第一作者）直接參與設計實驗、實施研究、采集數據、分析數據、文章撰寫等；沈志勇、張捷及邱偉箐參與實驗設計、數據采集等；劉驊（通信作者）直接參與設計實驗、實施研究、分析數據、對文章內容作批評性審閱等。
倫理審批聲明：本研究通過了上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院的倫理審批 ［審批文號：仁濟科倫審（2015）W029 號］；實驗動物使用許可證 ［SYXX（滬）2015-0011］。
