引用本文： 吉九威, 趙海平, 胡文秀. 雷帕霉素對重癥急性胰腺炎胰腺損害的保護性作用. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(4): 405-411. doi: 10.7507/1007-9424.201812024 復制
重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是臨床中較為危重的急腹癥之一，以發病急、進展快和病死率高為特點，死亡率高達 10%～25%[1]。SAP 的病理改變主要表現為胰腺組織廣泛性出血壞死[2]，大多數 SAP 是由急性水腫性胰腺炎發展而來[3]，治療方面主要是積極治療原發病、禁食水、抑制胰酶、抗感染、補液、糾正水電解質紊亂、防治并發癥及止痛對癥支持治療，充分讓胰腺休息[4-5]；當胰腺大面積壞死繼發感染時，需要外科手術治療[6-8]。相關研究已經證實，在 SAP 中多種信號通路被激活，如 p38 分裂原激活的蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinases，p38MAPK）、核因子 kB（nuclear factor kB，NF-kB）等信號通路，但關于雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路與 SAP 關系的報道并不多見。mTOR 信號通路在維持蛋白合成、細胞存活、生長、凋亡、調節炎癥反應等方面發揮重要作用[9]。mTOR 是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是多種信號通路的樞紐，通過對信號的整合從而對細胞的生長、周期及營養代謝進行調節。在哺乳動物中，mTOR 以 mTORC1-mTORC2 復合物的形式存在，激活的 mTORC1-mTORC2 復合物可使信號通路下游的核糖體 S6 激酶（S6K1）磷酸化，進而發揮其生理作用。相關研究[10]已經證實，mTORC1 具有雷帕霉素敏感性的特點，可被雷帕霉素抑制。此外，mTOR 抑制劑可以調節炎癥反應，緩解系統性紅斑狼瘡癥狀，對骨性關節炎也具有保護作用[11-12]。SAP 以無菌性炎癥為主要病理改變，隨著疾病的進展和加重，可以繼發細菌感染，嚴重者可以并發全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），最終可發展為多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），預后極差。mTOR 信號通路作為調節炎癥反應的重要信號通路之一，是否參與了 SAP 的發生發展、其抑制劑雷帕霉素是否對 SAP 患者的胰腺損害具有保護作用等，目前還不清楚。本實驗通過動物實驗，研究雷帕霉素對 SAP 胰腺損害的保護性作用，并進一步闡述其保護機制。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、材料和設備
清潔級雄性 SD 大鼠 90 只，雄性，280～320 g，7～8 周齡（購自遼寧長生生物技術股份有限公司）。動物手術器械和動物手術操作臺系上海玉研科學儀器有限公司產品，TDL-5 臺式大容量低速離心機系上海安亭科學儀器廠產品，顯微止血夾購自寧波醫用縫針有限公司，可吸收性外科縫線購自上海浦東金環醫療用品股份有限公司，pH 試紙購自上海馨晟試化工科技有限公司，采血管、載玻片、蓋玻片及 1/5 mL 注射器均系山東威高集團醫用高分子制品股份有限公司產品。5% 牛磺膽酸鈉購自北京索萊寶科技有限公司；水合氯醛、亞甲藍注射液和 0.9% 生理鹽水均系四川科倫藥業有限責任公司產品；雷帕霉素，HE 染色及 Western blot 相關試劑，IL-1β、IL-6 及 TNF-α ELISA 檢測試劑盒等均購自美國 Sigma 公司。
1.2 方法
1.2.1 實驗動物分組
90 只 SD 大鼠購回后適應性喂養 1 周，隨后按照拆信封法隨機分配成 3 組：假手術組（SO 組）、SAP 組和雷帕霉素組（RAPA 組），每組 30 只大鼠；每組大鼠再按照隨機數字表隨機分為 24、36 和 48 h 亞組，每個亞組 10 只大鼠。
1.2.2 SD 大鼠 SAP 模型的制備
參照相關 SAP 大鼠模型制備法建模[13-16]，具體步驟如下（圖 1）。手術器械消毒，操作過程嚴格無菌，實驗大鼠術前 12 h 禁食、不禁水。采用 10% 水合氯醛腹腔注射麻醉（3.3 mL/kg），待麻醉滿意后將大鼠固定于手術臺，腹部術區備皮，75% 乙醇消毒，鋪無菌洞巾，取上腹正中切口長約 3 cm 入腹；顯露十二指腸，將十二指腸順時針翻轉，暴露胰腺背側，手術燈光照向胰腺背側，從胰腺腹側辨認膽管系統及十二指腸乳頭，顯微止血夾暫時阻閉肝門部膽管；用棉簽鈍性分離胰頭，暴露胰膽管-十二指腸腸匯合部，于乳頭開口處十二指腸對系膜緣腸壁無血管區作為穿刺點，用直徑 0.3 mm 穿刺針頭與腸管壁成 10° 角刺入十二指腸壁內，調整穿刺針方向平行于胰膽管，經乳頭部插入胰膽管內約 5 mm（此處一般無主胰管）；以顯微止血夾封閉胰膽管十二指腸開口端，穿刺針連接 1 mL 注射器，由專人以 0.3 mL/min 的速度勻速向胰膽管內注射 5% 牛磺膽酸鈉（2 mL/kg）與亞甲藍的（0.1 mL）混合液，注射完畢后 5 min，去除肝門部膽管及乳頭處顯微止血夾，以 8-0 可吸線“8”字縫合腸壁穿刺口；用 5 mL 注射器抽取溫鹽水沖洗穿刺口及乳頭部位，5 min 后用 pH 試紙蘸取穿刺口周圍腸壁及乳頭部組織液，與標準卡比色，判斷是否出現腸瘺或膽汁漏（比色后呈現堿性，則認為出現腸瘺或膽汁漏）；用干紗布擦凈腹腔內沖洗液及滲液，查無活動性出血后逐層關腹，術畢背部皮下注射 5 mL 生理鹽水補液。大鼠蘇醒后禁食，可飲水，分組飼養。以上所有操作均由同一名術者完成。
圖1
示 SAP 建模操作
a：順時針翻轉胰腺，充分暴露膽胰管（黑箭）；b：以顯微止血夾暫時夾閉肝門部膽管（黑箭）；c：注射藥液后膽胰管及分支胰管清晰可見（黑箭）
1.2.3 建模大鼠的選擇
納入標準：① 穿刺過程中無肉眼可見的胰膽管穿透性損傷；② 無胰腺及其被膜損傷；③ 無胰腺及穿刺部位的活動性出血；④ 穿刺口及十二指腸乳頭周圍無膽汁漏或腸瘺；⑤ 操作過程中無其他器官組織的副損傷；⑥ 大鼠在處死的各時間點仍然存活。對符合以上全部條件的大鼠納入本研究。排除標準：① 穿刺過程中有肉眼可見的胰膽管穿透性損傷；② 穿刺十二指腸后針頭脫出或反復穿刺；③ 有胰腺及其被膜損傷；④ 有胰腺及穿刺部位活動性出血且按壓止血后仍有出血；⑤ 穿刺口及十二指腸乳頭周圍有膽汁漏或腸瘺；⑥ 操作過程中有其他器官組織的副損傷；⑦ 在處死的各時間點大鼠已經死亡。對符合以上任何 1 條的大鼠均不納入研究范圍。本實驗 SAP 組和 RAPA 組大鼠均建模成功。
1.2.4 3 組大鼠的處理
SO 組 SD 大鼠（共 30 只，24、36 和 48 h 3 個亞組各 10 只）的操作方法均與 SAP 組相同，只是將注射的藥物替換為 0.9% 生理鹽水（2 mL/kg）與亞甲藍的（0.1 mL）混合液；RAPA 組 SD 大鼠（共 30 只，24、36 和 48 h 3 個亞組各 10 只）的操作方法和注射藥物均與 SAP 組相同，只是在手術麻醉前 30 min 經腹腔注射雷帕霉素（1 mg/kg）。
1.2.5 胰腺組織中磷酸化的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）和磷酸化的核糖體 S6 蛋白激酶 1（p-S6K1）的表達量檢測
SAP 組、SO 組及 RAPA 組中的各時段亞組大鼠分別于術后 24、36 及 48 h 腹腔注射 10% 的水合氯醛溶液（3.3 mL/kg），麻醉滿意后開胸，直視下行右心房穿刺采血并放血處死相應亞組存活的全部大鼠。各組大鼠放血處死后立即完整切取相應胰腺組織，分為兩部分，一部分用 10% 中性甲醛溶液固定 48 h 以上，待行組織染色；另一部分放置于–80 ℃ 超低溫冰箱冷凍保存，采用 Western blot 法檢測胰腺組織中 p-mTOR 和p-S6K1 的表達量（操作按試劑盒說明書進行）。
1.2.6 血清標本的采集及炎癥因子的檢測
按上述方法行右心房穿刺采血并放血處死大鼠后，血液標本離心（2 500 r/min，r=12 cm，15 min）后移液器抽取上層血清置于 EP 管中，采用 ELISA 方法檢測血清 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的含量，操作根據試劑盒說明書進行。
1.2.7 胰腺組織的 HE 染色
將以 10% 中性甲醛溶液固定好的胰腺組織（胰頭部）行 HE 染色，將組織塊修整成統一大小，脫水透明，石蠟包埋，置于切片機上，以厚度 4 μm 的標準連續性切片，每個蠟塊切片 5 張，取其中之一作常規 HE 染色。
1.2.8 胰腺組織光鏡下病理評分
取各時間點存活大鼠的胰腺標本，行 HE 染色后，采用盲法由專科醫師在光鏡下閱片，每張切片隨機選擇 10 個高倍視野（200 倍），觀察胰腺組織的病理變化，參照 Schmidt 等[17]的光鏡下評分法進行評分（表 1）。
表1
胰腺病變光鏡下評分標準
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件進行統計分析。計量資料采用均數±標準差（
±s）表示。多個樣本均數比較時，經方差齊性檢驗后，若滿足方差齊性，使用方差分析，兩兩比較采用 LSD-t 檢驗；若方差不齊，則采用 t′ 檢驗；關系的分析采用線性相關性分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
SO 組各時間點亞組的大鼠均存活，總體存活率為 100%；SAP 組中，24 h 亞組大鼠存活 8 只，36 h 亞組大鼠存活 6 只，48 h 亞組大鼠存活 4 只，總體存活率為 60%；RAPA 組中，24 h 亞組大鼠存活 9 只，36 h 亞組大鼠存活 8 只，48 h 亞組大鼠存活 7 只，總體存活率為 80%。
2.1 胰腺組織中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表達量
2.1.1 胰腺組織中 p-mTOR 的表達量
在 24、36 及 48 h 時點，SO 組、SAP 組和 RAPA 組大鼠胰腺組織中的 p-mTOR 表達量順序均為：SO 組<RAPA 組<SAP 組，3 組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。SO 組內的 3 個時間點亞組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）；在 SAP 組和 RAPA 組，均是 24 h<36 h<48 h，同組內的 3 個時間點間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。具體見圖 2a和圖 2b。
圖2
示胰腺組織中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表達
a：胰腺組織中 p-mTOR 表達的電泳圖片；b：3 組胰腺組織中 p-mTOR 的表達水平；c：胰腺組織中 p-S6K1 表達的電泳圖片；d：3 組胰腺組織中 p-S6K1 的表達水平；同時點與 SO 組比較，*
2.1.2 胰腺組織中 p-S6K1 的表達量
在 24、36 及 48 h 時點，SO 組、SAP 組和 RAPA 組大鼠胰腺組織中的 p-S6K1 表達量順序均為：SO 組<RAPA 組<SAP 組，3 組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。SO 組內的 3 個時間點亞組比較差異無統計學意義（P>0.05）；在 SAP 組和 RAPA 組，均是 24 h<36 h<48 h，同組內的 3 個時間點間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。具體見圖 2c和圖 2d。
2.2 血清炎癥因子含量
2.2.1 血清 IL-1β 含量
SO 組中，隨著時間的延長，血清 IL-1β 含量總體呈下降趨勢；SAP 組中，隨著時間的延長，血清 IL-1β 含量總體呈上升趨勢；RAPA 組中，隨著時間的延長，血清 IL-1β 含量大致呈下降趨勢。在 24 h 亞組中，SO 組、RAPA 組及 SAP 組大鼠的血清 IL-1β 含量比較差異無統計學意義（P>0.05）；在 36 h 亞組中，3 組大鼠的血清 IL-1β 含量順序為：RAPA 組<SAP 組<SO 組，3 組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）；在 48 h 亞組中，3 組大鼠的血清 IL-1β 含量順序為：SO 組<RAPA 組<SAP 組，3 組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。具體見圖 3a。
圖3
示 3 組大鼠各時點的血清 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 含量、胰腺組織的病理學檢查結果以及胰腺組織中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表達水平與胰腺組織病理評分的關系的散點圖
a：3 組大鼠各時點血清 IL-1β 含量；b：3 組大鼠各時點血清 IL-6 含量；c：3 組大鼠各時點血清 TNF-α 含量；同時點與 SO 組比較，*
2.2.2 血清 IL-6 含量
SO 組中，隨著時間的延長，血清 IL-6 含量總體呈下降趨勢；SAP 組中，隨著時間的延長，血清 IL-6 含量總體呈上升趨勢；RAPA 組中，隨著時間的延長，血清 IL-6 含量總體呈下降趨勢。在 24 h 亞組中，3 組的血清 IL-6 含量順序依次為：SO 組/SAP 組<RAPA 組，RAPA 組與另 2 組比較差異均有統計學意義（P<0.05），而 SO 組與 SAP 組比較差異無統計學意義（P>0.05）；在 36 h 和 48 h 亞組中，3 組的血清 IL-6 含量順序依次為：SO 組<RAPA 組<SAP 組，3 組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05），具體見圖 3b。
2.2.3 血清 TNF-α 含量
SO 組中，隨著時間的延長，血清 TNF-α 含量總體呈下降趨勢；SAP 組中，隨著時間的延長，血清 TNF-α 含量總體呈上升趨勢；RAPA 組中，隨著時間的延長，血清 TNF-α 含量總體呈下降趨勢。在 24 h 亞組中， SO 組、SAP 組及 RAPA 組的血清 TNF-α 含量比較差異無統計學意義（P>0.05）；在 36 h 亞組中，3 組的血清 TNF-α 含量順序依次為：SO 組<RAPA 組<SAP 組，3 組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）；在 48 h 亞組中，血清 TNF-α 含量為 SO/RAPA 組<SAP 組，SAP 組與其余 2 組比較差異均有統計學意義（P<0.05），而 SO 組與 RAPA 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 3c。
2.3 胰腺組織的病理學改變及其病理評分
同時點與 SO 組比較，SAP 組和 RAPA 組的胰腺組織的病理學損傷較重，RAPA 組損傷較 SAP 組輕；同組內隨時間延長，SO 組的病理學改變不大，但 SAP 組和 RAPA 組有加重趨勢，具體見 3d–3j。SO 組、SAP 組及 RAPA 組內 3 個時間點的病理學評分依次為：SO 組，48 h 組<36 h 組<24 h 組，3 個時點間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）；SAP 組：24 h 組<36 h 組<48 h 組，3 個時點間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）；RAPA 組，24 h 組<36 h 組<48 h 組，3 個時點間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。24 h、36 h 及 48 h 時，同時點下 3 組胰腺組織的病理學評分依次為：SO組<RAPA 組<SAP 組，3 組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。具體見表 2。
表2
3 組大鼠胰腺組織的病理學評分（分，
）
2.4 胰腺組織中 p-mTOR、p-S6K1 的表達水平與胰腺組織病理評分的相關性
胰腺組織中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表達水平與胰腺組織的病理學評分均呈正相關（r=0.97，P<0.01；r=0.89，P<0.01），見圖 3k 和圖 3l（根據3 組大鼠 3 個時點結果的均值繪制）。
3 討論
SAP 是臨床常見的急腹癥之一，該病發病快，呈惡性發展趨勢，治療極為復雜，晚期階段同時合并 SIRS，引起廣泛的器官組織損傷，最終發展為多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[18-20]。約有 25% 的急性胰腺炎可發展為 SAP[21]。mTOR 是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶，存在于 2 個不同的復合體中，第 1 個為 mTORC1，由 mTOR、Raptor、GβL 和 DEPTOR 構成，它是一主要的生長調節分子，可感受并結合不同的營養因素和環境因素，包括生長因子、能量水平、細胞應激及氨基酸，可被雷帕霉素抑制，而激活的 mTOR 可使下游 S6K1 磷酸化而發揮其生理作用[22-24]。第 2 種復合體是 mTORC2，由 mTOR、Rictor、GβL、Sin1、PRR5/Protor-1 和 DEPTOR 構成。有研究[25-29]證實，mTOR 信號轉導異常見于多種疾病如癌癥、心血管疾病和糖尿病。
本研究結果顯示，各時點 3 組胰腺組織中的 p-mTOR 和 p-S6K1 的表達水平順序均為 SO 組<RAPA 組<SAP 組，且在 SAP 組和 RAPA 組中，隨時間延長，胰腺組織中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表達水平升高。而 mTOR 和 S6K1 作為 mTOR 信號通路中下游的關鍵蛋白分子，其磷酸化水平反映了該通路的激活情況，這提示在 SAP 時，mTOR 信號通路被廣泛激活。本實驗結果顯示，SAP 組血清 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 含量隨時間延長總體升高，而 RAPA 組隨時間延長呈下降趨勢，36 和 48 h 時，RAPA 組和 SAP 組的上述 3 項指標總體高于 SO 組，且 RAPA 組的 3 項指標均低于 SAP 組，該結果一方面提示在 SAP 時，炎癥因子 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 大量釋放入血，參與 SAP 的發生；另一方面提示雷帕霉素可能通過抑制 mTOR 信號通路減少炎癥因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的合成及釋放。此外，24、36 和 48 h 時，SAP 組胰腺組織的病理評分都顯著高于 SO 組相應時點，而 RAPA 組胰腺組織的病理評分卻介于 SO 組和 SAP 組相應亞組之間。經相關性分析，胰腺組織中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表達水平與胰腺組織的損害程度呈線性正相關關系，且二者的相關系數r均大于 0.8，故可以認為，在 SAP 時，胰腺組織中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表達水平與胰腺組織損害程度具有較高的相關性。
綜上所述，在 SAP 中，炎癥因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 被大量釋放入血，參與 SAP 的發病過程；mTOR 信號通路被廣泛激活，且胰腺組織中p-mTOR 和 p-S6K1 的表達水平與胰腺組織的損害程度呈線性正相關關系；雷帕霉素可減輕 SAP 中胰腺組織損害程度，其機制可能為下調胰腺組織中p-mTOR 和 p-S6K1 的表達，或者減少炎癥介質IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的合成及釋放，進而減輕胰腺損傷。
重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是臨床中較為危重的急腹癥之一，以發病急、進展快和病死率高為特點，死亡率高達 10%～25%[1]。SAP 的病理改變主要表現為胰腺組織廣泛性出血壞死[2]，大多數 SAP 是由急性水腫性胰腺炎發展而來[3]，治療方面主要是積極治療原發病、禁食水、抑制胰酶、抗感染、補液、糾正水電解質紊亂、防治并發癥及止痛對癥支持治療，充分讓胰腺休息[4-5]；當胰腺大面積壞死繼發感染時，需要外科手術治療[6-8]。相關研究已經證實，在 SAP 中多種信號通路被激活，如 p38 分裂原激活的蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinases，p38MAPK）、核因子 kB（nuclear factor kB，NF-kB）等信號通路，但關于雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路與 SAP 關系的報道并不多見。mTOR 信號通路在維持蛋白合成、細胞存活、生長、凋亡、調節炎癥反應等方面發揮重要作用[9]。mTOR 是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是多種信號通路的樞紐，通過對信號的整合從而對細胞的生長、周期及營養代謝進行調節。在哺乳動物中，mTOR 以 mTORC1-mTORC2 復合物的形式存在，激活的 mTORC1-mTORC2 復合物可使信號通路下游的核糖體 S6 激酶（S6K1）磷酸化，進而發揮其生理作用。相關研究[10]已經證實，mTORC1 具有雷帕霉素敏感性的特點，可被雷帕霉素抑制。此外，mTOR 抑制劑可以調節炎癥反應，緩解系統性紅斑狼瘡癥狀，對骨性關節炎也具有保護作用[11-12]。SAP 以無菌性炎癥為主要病理改變，隨著疾病的進展和加重，可以繼發細菌感染，嚴重者可以并發全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），最終可發展為多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），預后極差。mTOR 信號通路作為調節炎癥反應的重要信號通路之一，是否參與了 SAP 的發生發展、其抑制劑雷帕霉素是否對 SAP 患者的胰腺損害具有保護作用等，目前還不清楚。本實驗通過動物實驗，研究雷帕霉素對 SAP 胰腺損害的保護性作用，并進一步闡述其保護機制。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、材料和設備
清潔級雄性 SD 大鼠 90 只，雄性，280～320 g，7～8 周齡（購自遼寧長生生物技術股份有限公司）。動物手術器械和動物手術操作臺系上海玉研科學儀器有限公司產品，TDL-5 臺式大容量低速離心機系上海安亭科學儀器廠產品，顯微止血夾購自寧波醫用縫針有限公司，可吸收性外科縫線購自上海浦東金環醫療用品股份有限公司，pH 試紙購自上海馨晟試化工科技有限公司，采血管、載玻片、蓋玻片及 1/5 mL 注射器均系山東威高集團醫用高分子制品股份有限公司產品。5% 牛磺膽酸鈉購自北京索萊寶科技有限公司；水合氯醛、亞甲藍注射液和 0.9% 生理鹽水均系四川科倫藥業有限責任公司產品；雷帕霉素，HE 染色及 Western blot 相關試劑，IL-1β、IL-6 及 TNF-α ELISA 檢測試劑盒等均購自美國 Sigma 公司。
1.2 方法
1.2.1 實驗動物分組
90 只 SD 大鼠購回后適應性喂養 1 周，隨后按照拆信封法隨機分配成 3 組：假手術組（SO 組）、SAP 組和雷帕霉素組（RAPA 組），每組 30 只大鼠；每組大鼠再按照隨機數字表隨機分為 24、36 和 48 h 亞組，每個亞組 10 只大鼠。
1.2.2 SD 大鼠 SAP 模型的制備
參照相關 SAP 大鼠模型制備法建模[13-16]，具體步驟如下（圖 1）。手術器械消毒，操作過程嚴格無菌，實驗大鼠術前 12 h 禁食、不禁水。采用 10% 水合氯醛腹腔注射麻醉（3.3 mL/kg），待麻醉滿意后將大鼠固定于手術臺，腹部術區備皮，75% 乙醇消毒，鋪無菌洞巾，取上腹正中切口長約 3 cm 入腹；顯露十二指腸，將十二指腸順時針翻轉，暴露胰腺背側，手術燈光照向胰腺背側，從胰腺腹側辨認膽管系統及十二指腸乳頭，顯微止血夾暫時阻閉肝門部膽管；用棉簽鈍性分離胰頭，暴露胰膽管-十二指腸腸匯合部，于乳頭開口處十二指腸對系膜緣腸壁無血管區作為穿刺點，用直徑 0.3 mm 穿刺針頭與腸管壁成 10° 角刺入十二指腸壁內，調整穿刺針方向平行于胰膽管，經乳頭部插入胰膽管內約 5 mm（此處一般無主胰管）；以顯微止血夾封閉胰膽管十二指腸開口端，穿刺針連接 1 mL 注射器，由專人以 0.3 mL/min 的速度勻速向胰膽管內注射 5% 牛磺膽酸鈉（2 mL/kg）與亞甲藍的（0.1 mL）混合液，注射完畢后 5 min，去除肝門部膽管及乳頭處顯微止血夾，以 8-0 可吸線“8”字縫合腸壁穿刺口；用 5 mL 注射器抽取溫鹽水沖洗穿刺口及乳頭部位，5 min 后用 pH 試紙蘸取穿刺口周圍腸壁及乳頭部組織液，與標準卡比色，判斷是否出現腸瘺或膽汁漏（比色后呈現堿性，則認為出現腸瘺或膽汁漏）；用干紗布擦凈腹腔內沖洗液及滲液，查無活動性出血后逐層關腹，術畢背部皮下注射 5 mL 生理鹽水補液。大鼠蘇醒后禁食，可飲水，分組飼養。以上所有操作均由同一名術者完成。
圖1
示 SAP 建模操作
a：順時針翻轉胰腺，充分暴露膽胰管（黑箭）；b：以顯微止血夾暫時夾閉肝門部膽管（黑箭）；c：注射藥液后膽胰管及分支胰管清晰可見（黑箭）
1.2.3 建模大鼠的選擇
納入標準：① 穿刺過程中無肉眼可見的胰膽管穿透性損傷；② 無胰腺及其被膜損傷；③ 無胰腺及穿刺部位的活動性出血；④ 穿刺口及十二指腸乳頭周圍無膽汁漏或腸瘺；⑤ 操作過程中無其他器官組織的副損傷；⑥ 大鼠在處死的各時間點仍然存活。對符合以上全部條件的大鼠納入本研究。排除標準：① 穿刺過程中有肉眼可見的胰膽管穿透性損傷；② 穿刺十二指腸后針頭脫出或反復穿刺；③ 有胰腺及其被膜損傷；④ 有胰腺及穿刺部位活動性出血且按壓止血后仍有出血；⑤ 穿刺口及十二指腸乳頭周圍有膽汁漏或腸瘺；⑥ 操作過程中有其他器官組織的副損傷；⑦ 在處死的各時間點大鼠已經死亡。對符合以上任何 1 條的大鼠均不納入研究范圍。本實驗 SAP 組和 RAPA 組大鼠均建模成功。
1.2.4 3 組大鼠的處理
SO 組 SD 大鼠（共 30 只，24、36 和 48 h 3 個亞組各 10 只）的操作方法均與 SAP 組相同，只是將注射的藥物替換為 0.9% 生理鹽水（2 mL/kg）與亞甲藍的（0.1 mL）混合液；RAPA 組 SD 大鼠（共 30 只，24、36 和 48 h 3 個亞組各 10 只）的操作方法和注射藥物均與 SAP 組相同，只是在手術麻醉前 30 min 經腹腔注射雷帕霉素（1 mg/kg）。
1.2.5 胰腺組織中磷酸化的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）和磷酸化的核糖體 S6 蛋白激酶 1（p-S6K1）的表達量檢測
SAP 組、SO 組及 RAPA 組中的各時段亞組大鼠分別于術后 24、36 及 48 h 腹腔注射 10% 的水合氯醛溶液（3.3 mL/kg），麻醉滿意后開胸，直視下行右心房穿刺采血并放血處死相應亞組存活的全部大鼠。各組大鼠放血處死后立即完整切取相應胰腺組織，分為兩部分，一部分用 10% 中性甲醛溶液固定 48 h 以上，待行組織染色；另一部分放置于–80 ℃ 超低溫冰箱冷凍保存，采用 Western blot 法檢測胰腺組織中 p-mTOR 和p-S6K1 的表達量（操作按試劑盒說明書進行）。
1.2.6 血清標本的采集及炎癥因子的檢測
按上述方法行右心房穿刺采血并放血處死大鼠后，血液標本離心（2 500 r/min，r=12 cm，15 min）后移液器抽取上層血清置于 EP 管中，采用 ELISA 方法檢測血清 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的含量，操作根據試劑盒說明書進行。
1.2.7 胰腺組織的 HE 染色
將以 10% 中性甲醛溶液固定好的胰腺組織（胰頭部）行 HE 染色，將組織塊修整成統一大小，脫水透明，石蠟包埋，置于切片機上，以厚度 4 μm 的標準連續性切片，每個蠟塊切片 5 張，取其中之一作常規 HE 染色。
1.2.8 胰腺組織光鏡下病理評分
取各時間點存活大鼠的胰腺標本，行 HE 染色后，采用盲法由專科醫師在光鏡下閱片，每張切片隨機選擇 10 個高倍視野（200 倍），觀察胰腺組織的病理變化，參照 Schmidt 等[17]的光鏡下評分法進行評分（表 1）。
表1
胰腺病變光鏡下評分標準
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件進行統計分析。計量資料采用均數±標準差（±s）表示。多個樣本均數比較時，經方差齊性檢驗后，若滿足方差齊性，使用方差分析，兩兩比較采用 LSD-t 檢驗；若方差不齊，則采用 t′ 檢驗；關系的分析采用線性相關性分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
SO 組各時間點亞組的大鼠均存活，總體存活率為 100%；SAP 組中，24 h 亞組大鼠存活 8 只，36 h 亞組大鼠存活 6 只，48 h 亞組大鼠存活 4 只，總體存活率為 60%；RAPA 組中，24 h 亞組大鼠存活 9 只，36 h 亞組大鼠存活 8 只，48 h 亞組大鼠存活 7 只，總體存活率為 80%。
2.1 胰腺組織中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表達量
2.1.1 胰腺組織中 p-mTOR 的表達量
在 24、36 及 48 h 時點，SO 組、SAP 組和 RAPA 組大鼠胰腺組織中的 p-mTOR 表達量順序均為：SO 組<RAPA 組<SAP 組，3 組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。SO 組內的 3 個時間點亞組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）；在 SAP 組和 RAPA 組，均是 24 h<36 h<48 h，同組內的 3 個時間點間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。具體見圖 2a和圖 2b。
圖2
示胰腺組織中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表達
a：胰腺組織中 p-mTOR 表達的電泳圖片；b：3 組胰腺組織中 p-mTOR 的表達水平；c：胰腺組織中 p-S6K1 表達的電泳圖片；d：3 組胰腺組織中 p-S6K1 的表達水平；同時點與 SO 組比較，*
2.1.2 胰腺組織中 p-S6K1 的表達量
在 24、36 及 48 h 時點，SO 組、SAP 組和 RAPA 組大鼠胰腺組織中的 p-S6K1 表達量順序均為：SO 組<RAPA 組<SAP 組，3 組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。SO 組內的 3 個時間點亞組比較差異無統計學意義（P>0.05）；在 SAP 組和 RAPA 組，均是 24 h<36 h<48 h，同組內的 3 個時間點間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。具體見圖 2c和圖 2d。
2.2 血清炎癥因子含量
2.2.1 血清 IL-1β 含量
SO 組中，隨著時間的延長，血清 IL-1β 含量總體呈下降趨勢；SAP 組中，隨著時間的延長，血清 IL-1β 含量總體呈上升趨勢；RAPA 組中，隨著時間的延長，血清 IL-1β 含量大致呈下降趨勢。在 24 h 亞組中，SO 組、RAPA 組及 SAP 組大鼠的血清 IL-1β 含量比較差異無統計學意義（P>0.05）；在 36 h 亞組中，3 組大鼠的血清 IL-1β 含量順序為：RAPA 組<SAP 組<SO 組，3 組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）；在 48 h 亞組中，3 組大鼠的血清 IL-1β 含量順序為：SO 組<RAPA 組<SAP 組，3 組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。具體見圖 3a。
圖3
示 3 組大鼠各時點的血清 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 含量、胰腺組織的病理學檢查結果以及胰腺組織中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表達水平與胰腺組織病理評分的關系的散點圖
a：3 組大鼠各時點血清 IL-1β 含量；b：3 組大鼠各時點血清 IL-6 含量；c：3 組大鼠各時點血清 TNF-α 含量；同時點與 SO 組比較，*
2.2.2 血清 IL-6 含量
SO 組中，隨著時間的延長，血清 IL-6 含量總體呈下降趨勢；SAP 組中，隨著時間的延長，血清 IL-6 含量總體呈上升趨勢；RAPA 組中，隨著時間的延長，血清 IL-6 含量總體呈下降趨勢。在 24 h 亞組中，3 組的血清 IL-6 含量順序依次為：SO 組/SAP 組<RAPA 組，RAPA 組與另 2 組比較差異均有統計學意義（P<0.05），而 SO 組與 SAP 組比較差異無統計學意義（P>0.05）；在 36 h 和 48 h 亞組中，3 組的血清 IL-6 含量順序依次為：SO 組<RAPA 組<SAP 組，3 組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05），具體見圖 3b。
2.2.3 血清 TNF-α 含量
SO 組中，隨著時間的延長，血清 TNF-α 含量總體呈下降趨勢；SAP 組中，隨著時間的延長，血清 TNF-α 含量總體呈上升趨勢；RAPA 組中，隨著時間的延長，血清 TNF-α 含量總體呈下降趨勢。在 24 h 亞組中， SO 組、SAP 組及 RAPA 組的血清 TNF-α 含量比較差異無統計學意義（P>0.05）；在 36 h 亞組中，3 組的血清 TNF-α 含量順序依次為：SO 組<RAPA 組<SAP 組，3 組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）；在 48 h 亞組中，血清 TNF-α 含量為 SO/RAPA 組<SAP 組，SAP 組與其余 2 組比較差異均有統計學意義（P<0.05），而 SO 組與 RAPA 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 3c。
2.3 胰腺組織的病理學改變及其病理評分
同時點與 SO 組比較，SAP 組和 RAPA 組的胰腺組織的病理學損傷較重，RAPA 組損傷較 SAP 組輕；同組內隨時間延長，SO 組的病理學改變不大，但 SAP 組和 RAPA 組有加重趨勢，具體見 3d–3j。SO 組、SAP 組及 RAPA 組內 3 個時間點的病理學評分依次為：SO 組，48 h 組<36 h 組<24 h 組，3 個時點間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）；SAP 組：24 h 組<36 h 組<48 h 組，3 個時點間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）；RAPA 組，24 h 組<36 h 組<48 h 組，3 個時點間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。24 h、36 h 及 48 h 時，同時點下 3 組胰腺組織的病理學評分依次為：SO組<RAPA 組<SAP 組，3 組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。具體見表 2。
表2
3 組大鼠胰腺組織的病理學評分（分，）
2.4 胰腺組織中 p-mTOR、p-S6K1 的表達水平與胰腺組織病理評分的相關性
胰腺組織中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表達水平與胰腺組織的病理學評分均呈正相關（r=0.97，P<0.01；r=0.89，P<0.01），見圖 3k 和圖 3l（根據3 組大鼠 3 個時點結果的均值繪制）。
3 討論
SAP 是臨床常見的急腹癥之一，該病發病快，呈惡性發展趨勢，治療極為復雜，晚期階段同時合并 SIRS，引起廣泛的器官組織損傷，最終發展為多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[18-20]。約有 25% 的急性胰腺炎可發展為 SAP[21]。mTOR 是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶，存在于 2 個不同的復合體中，第 1 個為 mTORC1，由 mTOR、Raptor、GβL 和 DEPTOR 構成，它是一主要的生長調節分子，可感受并結合不同的營養因素和環境因素，包括生長因子、能量水平、細胞應激及氨基酸，可被雷帕霉素抑制，而激活的 mTOR 可使下游 S6K1 磷酸化而發揮其生理作用[22-24]。第 2 種復合體是 mTORC2，由 mTOR、Rictor、GβL、Sin1、PRR5/Protor-1 和 DEPTOR 構成。有研究[25-29]證實，mTOR 信號轉導異常見于多種疾病如癌癥、心血管疾病和糖尿病。
本研究結果顯示，各時點 3 組胰腺組織中的 p-mTOR 和 p-S6K1 的表達水平順序均為 SO 組<RAPA 組<SAP 組，且在 SAP 組和 RAPA 組中，隨時間延長，胰腺組織中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表達水平升高。而 mTOR 和 S6K1 作為 mTOR 信號通路中下游的關鍵蛋白分子，其磷酸化水平反映了該通路的激活情況，這提示在 SAP 時，mTOR 信號通路被廣泛激活。本實驗結果顯示，SAP 組血清 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 含量隨時間延長總體升高，而 RAPA 組隨時間延長呈下降趨勢，36 和 48 h 時，RAPA 組和 SAP 組的上述 3 項指標總體高于 SO 組，且 RAPA 組的 3 項指標均低于 SAP 組，該結果一方面提示在 SAP 時，炎癥因子 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 大量釋放入血，參與 SAP 的發生；另一方面提示雷帕霉素可能通過抑制 mTOR 信號通路減少炎癥因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的合成及釋放。此外，24、36 和 48 h 時，SAP 組胰腺組織的病理評分都顯著高于 SO 組相應時點，而 RAPA 組胰腺組織的病理評分卻介于 SO 組和 SAP 組相應亞組之間。經相關性分析，胰腺組織中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表達水平與胰腺組織的損害程度呈線性正相關關系，且二者的相關系數r均大于 0.8，故可以認為，在 SAP 時，胰腺組織中 p-mTOR 和 p-S6K1 的表達水平與胰腺組織損害程度具有較高的相關性。
綜上所述，在 SAP 中，炎癥因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 被大量釋放入血，參與 SAP 的發病過程；mTOR 信號通路被廣泛激活，且胰腺組織中p-mTOR 和 p-S6K1 的表達水平與胰腺組織的損害程度呈線性正相關關系；雷帕霉素可減輕 SAP 中胰腺組織損害程度，其機制可能為下調胰腺組織中p-mTOR 和 p-S6K1 的表達，或者減少炎癥介質IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的合成及釋放，進而減輕胰腺損傷。
