引用本文： 孫晗, 陳武, 王云, 王亦秋, 饒建華, 劉霞, 劉鵬, 田慶中. 肝細胞性肝癌組織中甲胎蛋白的表達對化療耐藥的預測價值. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(4): 432-437. doi: 10.7507/1007-9424.201811053 復制
肝細胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床常見的惡性腫瘤，全世界每年有 30～50 萬例新發患者，其發病率逐年上升，并且呈現年輕化趨勢[1]。我國屬肝癌高發國家，發病率居世界首位[2]，其給個人和家庭帶來了沉重的負擔。由于 HCC 具有多血管、惡性程度高、生長速度快、轉移范圍廣、復發率高等特點，僅有 20%～25% 的患者可以通過肝切除和肝移植治療，大多數患者初次就診時已經喪失了手術機會。肝動脈插管栓塞化療（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）是治療中晚期 HCC 常用的方法[3]，但化療多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）現象嚴重阻礙了 HCC 的化療效果。因此，研究引起肝癌 MDR 的相關因素、作用機制并逆轉 MDR，提高肝癌化療效果成為了亟待解決的問題之一。本研究從術前穿刺取得的肝臟腫瘤組織樣本中篩選出 HCC，利用免疫組織化學技術對其進行甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）檢測，同時評估 TACE 后的治療效果，旨在探討腫瘤組織中 AFP 的表達與化療耐藥的關系。
1 資料與方法
1.1 研究對象
對 2008 年 1 月至 2017 年 12 月期間東南大學附屬徐州醫院實施 TACE 治療的原發性肝癌患者進行篩選，入組標準為：① 術前行肝臟穿刺活檢或術中姑息性手術腫瘤活檢，病理學檢查結果提示原發性 HCC；② TACE 治療前未行根治性手術切除；③ TACE 前后均未行腫瘤微波消融或者射頻消融治療；④ 根據第 7 版美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）癌癥分期指南[4]，患者的臨床分期為 Ⅲ 期（ⅢA–ⅢC 期）；⑤ 患者手術前后臨床資料完整（包括手術前后影像資料以及檢驗結果）；⑥ 患者在 TACE 治療前未口服索拉非尼等靶向藥物。排除標準為：① 美國東部腫瘤協作組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG） 評分[5]>2 分；② 合并其他臟器如心、肺、腎功能不全者；③ DSA 造影發現中重度肝動脈-門靜脈瘺或肝動脈-肝靜脈瘺者；④ 合并有其他惡性腫瘤；⑤ 合并有糖尿病等內分泌或免疫系統疾病；⑥ 穿刺活檢結果為假陰性。共有 62 例患者符合上述條件納入研究，收集這些患者的臨床信息、影像資料及其腫瘤石蠟標本。本研究通過了醫院倫理委員會審批。
1.2 TACE 治療
62 例 HCC 患者行 TACE 前經穿刺或活檢留取 HCC 組織標本 3～4 條組織條備檢（其中 45 例行肝臟穿刺活檢，17 例患者術中探查發現無法行根治性手術而僅行肝腫瘤組織活檢）。TACE 治療過程為：采用 Seldinger 方法，于右側腹股溝區消毒、1% 利多卡因局部浸潤麻醉后，行右側股動脈穿刺，成功后置入導管鞘，導管選擇性插入肝動脈后行 DSA 造影，了解腫瘤的大小、位置、腫瘤血管分布、有無動靜脈瘺等，然后根據病灶大小和患者的肝功能狀況經導管分別注入絲裂霉素 C （MMC） 4～8 mg+5-氟尿嘧啶 （5-Fu） 500～1 000 mg+表阿霉素（E-ADM）10～30 mg 以及超液化碘油 20 mL，注射結束后拔出導管，對穿刺部位進行加壓包扎。17 例剖腹探查活檢患者根據其術后恢復情況，于術后 1 個月內行 TACE 治療，其 TACE 的治療過程與 45 例行肝臟穿刺活檢的患者一致。
1.3 TACE 療效觀察
患者于 TACE 治療前及治療后 1 個月均行 CT 檢查，使用的機器型號為 Brilliance 64 排螺旋 CT（美國 Philips 公司）或 Discovery CT750 HD 64 排螺旋 CT（美國 GE 公司）。由兩位高年資影像科醫師進行雙盲法圖像分析。觀察指標包括：腫瘤部位、大小、形態、強化程度、強化形式以及腫瘤與周圍血管的關系。按照歐洲肝病學會（European Association for the study of the liver，EASL）標準進行療效評價[6-7]：完全緩解（complete response，CR）定義為腫瘤沒有強化區域，反映了腫瘤完全壞死；部分緩解（partial response，PR）定義為強化區面積減少 50%以上，代表腫瘤部分壞死；穩定（stable disease，SD）定義為腫瘤反應在 PR 和 PD 之間；進展（progressive disease，PD）定義為 1 個可測量病灶增大 25%以上或新病灶出現。將療效達到 CR 和 PR 的患者歸入化療敏感組，而療效屬于 SD 和 PD 的患者歸入化療耐藥組。
1.4 HCC 組織中 AFP 表達的檢測
首先對獲取的 HCC 組織標本行蘇木精-尹紅（hematoxylin and eosin，HE）染色以明確 HCC 診斷，然后采用 EnVision 二步法行免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）染色檢測 HCC 組織中 AFP 的表達。AFP 抗體購自 Roche 公司，由 Roche Benchmark XT 全自動免疫組化儀完成檢測。根據陽性細胞在全部組織細胞中所占比例判定染色結果，其中腫瘤細胞無染色判為陰性；陽性細胞占比<10% 判為局灶陽性；陽性細胞占比為 10%～30% 判為弱陽性；陽性細胞占比 30%～70% 判為中度陽性；陽性細胞占比>70% 判為強陽性。將腫瘤細胞無染色、局灶陽性以及弱陽性病例判為 AFP 表達陰性，而腫瘤細胞中度陽性以及強陽性的病例則判為 AFP 表達陽性。
1.5 統計學方法
采用 STATA10.0 軟件進行分析。計量指標以均數±標準差（
±s）表示，2 組間比較采用 t 檢驗；計數資料的比較采用 χ2 檢驗或 Fisher 檢驗；腫瘤組織中 AFP 的表達與化療耐藥之間的相關性采用 logistic 回歸分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 HCC 組織中 AFP 表達與腫瘤耐藥的關系
將 62 例患者行 TACE 治療前與治療后 1 個月的 CT 檢查結果進行比較，結果顯示有 26 例患者（41.9%）TACE 治療后符合化療敏感標準，其中符合 CR 標準 0 例，符合 PR 標準 26 例，其余 36 例患者（58.1%）考慮化療耐藥，其中符合 SD 標準 24 例，PD 標準 12 例，即化療敏感組 26 例，化療耐藥組 36 例。免疫組化染色結果顯示，原發性 HCC 組織中 AFP 陽性染色主要位于細胞質，部分胞膜也有著色（圖 1），62 例中 AFP 染色陽性者 42 例（67.7%），AFP 染色陰性者 20 例（32.3%）。在 42 例 AFP 染色陽性者中，化療耐藥者有 29 例（69.0%），在 20 例 AFP 染色陰性者中，化療耐藥者有 7 例（35.0%），見表 1。該結果提示：HCC 組織中 AFP 表達陽性與腫瘤耐藥具有相關性。
圖1
示 HCC 組織中 AFP 免疫組化染色結果
a：示 HCC 組織中 AFP 強陽性染色，染色部位位于細胞質，部分在細胞膜（IHC ×100）；b：示 HCC 組織中 AFP 陰性染色（IHC ×100）
表1
62 例 HCC 患者的 AFP 表達與 TACE 療效的關系［例（%）］
2.2 HCC 患者臨床病理特征與腫瘤耐藥的關系
結果見表 2。由表 2 可見，化療敏感組與化療耐藥組患者在性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤分化程度、肝功能 Child-Pugh 分級以及是否合并肝炎 ［乙型肝炎和（或）丙型肝炎］ 方面之間的差異均無統計學意義（P>0.05），而在患者血清 AFP 水平、是否合并門靜脈癌栓（portal veinous tumor thrombus，PVTT）以及腫瘤數量方面 2 組間比較差異有統計學意義（P<0.05），化療敏感組的 AFP 水平陽性、合并門靜脈癌栓以及腫瘤單發患者的占比顯著低于化療耐藥組。
表2
62 例 HCC 患者臨床病理學特征與腫瘤耐藥的關系
2.3 HCC 化療耐藥影響因素的 logistic 回歸分析結果
對可能影響 HCC 化療耐藥的因素進一步行 logistic 回歸單因素和多因素分析，其單因素分析結果顯示，腫瘤組織的 AFP 陽性表達，血清 AFP 水平升高、合并 PVTT 以及腫瘤數量是 HCC 化療耐藥的相關危險因素（P<0. 05) ；多因素分析結果顯示，腫瘤組織的 AFP 陽性表達和合并 PVTT 是 HCC 化療耐藥的獨立危險因素（P<0.05)，見表 3。
表3
HCC 化療耐藥影響因素的 logistic 回歸分析
3 討論
AFP 是一種分子量約為 70×103的胚胎性糖蛋白，由 500 個氨基酸組成，由 Halbrecht 等[8]于 1956 年從胎兒血清中首次發現，1964 年 Tatarinov[9]首次從 HCC 患者的血清中檢測到 AFP，1978 年在第 12 屆國際癌癥大會上正式確認 AFP 是一種特異性的肝癌標志物，其作用至今尚無其他標志物可以取代。既往國內外對 AFP 的診斷價值及其與 HCC 臨床病理之間的關系進行了大量的研究報道，結果發現無論是手術還是姑息性治療，高表達 AFP 的患者均較低表達 AFP 的患者預后更差，甚至一些肝臟腫瘤分期系統（如 CLIP 分期系統）都將 AFP 水平作為一個預后因素[10]。然而，關于 AFP 與 HCC 化療耐藥之間的關系卻鮮有報道。因此，本研究通過分析 HCC 的組織中 AFP 表達、腫瘤分化程度、血清 AFP 水平以及臨床特征，探討 HCC 化療耐藥的影響因素，有助于為逆轉 MDR 提供新的理論線索和潛在的干預靶標。
本研究結果表明，HCC 組織中 AFP 表達陽性是影響其化療耐藥的一個重要因素。其作用機制可能與以下因素有關：① 通過上調 MDR1 基因的表達誘導肝臟腫瘤耐藥。體外實驗[11]顯示，在 AFP 陰性的肝癌細胞系 SMMC-7721 中轉染 AFP 表達顆粒后，發現其 MDR1 的表達產物 P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）顯著增高。而通過反義 RNA 重組腺病毒載體靶向逆轉 AFP 陽性的肝癌多藥耐藥細胞 HepG2R 后，能夠有效降低 P-gp 的表達[12]。鑒于 P-gp 蛋白具有 ATP 依賴性跨膜轉運活性，可將藥物轉運至細胞外，因此可使得細胞獲得耐藥性。② 通過抗凋亡作用引起耐藥。目前已知腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）及其受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）和 Fas 及其配體（Fas ligand，FasL）均在細胞凋亡中起到重要的作用。而在 HCC 組織中 AFP 能夠下調肝臟腫瘤細胞 TNFR 的表達、上調 FasL 的表達以及抑制淋巴細胞中 TNF 的分泌[13-15]，這種主動防御方式，不僅可以使得腫瘤凋亡減少，還可以導致腫瘤周圍淋巴細胞凋亡增多。除了 TNF/TNFR 和 Fas/FasL 系統外，有研究[16]發現，AFP 可以促進肝癌細胞突變型 p53 基因的表達，導致其失去野生型 p53 基因所具有的抑制 survivin 基因表達的功能，survivin 表達產物能夠抑制 caspase-3,7,9 的活性，阻礙細胞凋亡的發生。上述這些抗腫瘤細胞凋亡作用減弱了化療藥物對 HCC 的影響。③ 促進腫瘤細胞增殖的作用。目前已知磷酸肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，AKT）/雷帕霉素靶蛋白（the mammalian target of rapamycin，mTOR）通路可以促進細胞增殖并抑制其凋亡，在腫瘤的發生發展過程中起到極其重要的作用。而第 10 號染色體磷酸酶和張力蛋白同源丟失性基因（phosphatase and tension homolog deleted on chromosome ten，PTEN）被認為是繼 p53 基因后，另一種與腫瘤發生關系密切的抑癌基因，其編碼的產物可以對上述通路產生抑制作用[17]；在前列腺癌、子宮內膜癌、腎癌、膠質母細胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、甲狀腺癌、肺癌、膀胱癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤等多種腫瘤中均已發現該基因異常[17-18]。在 HCC 中已有研究[19]發現，AFP 與腫瘤細胞膜上受體結合后，能夠抑制 PTEN 活性，從而激活 P13K/AKT/mTOR 信號通路，促進 Src、Ras 等癌基因的表達。此外，AFP 還可以通過影響細胞內的第 2 信息物質 cAMP 和 Ca2+等的濃度，從而調控轉錄調節因子的作用，促進 Ras、C-fos、C-jun 等癌基因的表達[20]。這些癌基因最終將導致 HCC 的惡性轉化及腫瘤增殖[21-22]。
本研究中需要引起我們注意的是，血清 AFP 陽性在多因素回歸分析中并無顯著意義。考慮是因為部分 HCC 腫瘤組織中雖然表達 AFP，但并未分泌入血或者分泌入血極少，使得血清中 AFP 檢測為陰性。但是目前已知 AFP 在細胞內也可與 caspase-3 結合，通過抑制其活性，阻斷凋亡信號的轉導，從而使得肝癌細胞耐受化學藥物誘導的凋亡[23-24]。該結果提示：HCC 組織的 AFP 陽性表達較血清 AFP 陽性對明確腫瘤耐藥具有更高的特異度及臨床應用價值。
目前已知 PVTT 是 HCC 患者預后較差的主要原因之一，而在本研究中我們發現其也是 HCC 化療耐藥的獨立危險因素。這主要是因為：① HCC 腫瘤中心區的血供來自于肝動脈，而包括 PVTT 在內的腫瘤周圍組織血供主要來自于門靜脈，因此 TACE 對于門靜脈出現癌栓治療效果甚微。② PVTT 形成后會增大門靜脈壓力，減少門靜脈血供，使得肝臟的儲備能力降低。雖然門靜脈和肝動脈之間存在廣泛的吻合支[25]，但是 TACE 治療后動脈栓塞則必然會進一步損傷肝功能，從而限制了具有肝毒性的化療藥物使用的劑量，最終導致化療效果不佳。③ PVTT 可引起腫瘤血管的功能異常，形成缺氧的微環境，促進缺氧誘導因子 1α 的生成（hypoxia-inducible factor，HIF-1α）。體外實驗[26]中已經證實 HepG2 肝癌細胞可通過 HIF-1α 調控 MDR 基因的表達，導致耐藥表型形成；而在體內實驗[27]中，HIF-1α 蛋白的表達水平在耐藥肝癌組織中顯著高于化療敏感肝癌組織，這也間接說明了 HIF-1α 在 HCC 化療耐藥的形成過程中起了重要作用。
本研究也存在一些局限性：① 樣本量較少；② 化療方案單一；③ 不能排除超液化碘油對腫瘤治療的影響，使得結果出現偏倚；④ 單中心研究；⑤ 沒有對患者進行生存分析；⑥ 給藥途徑單一，沒有進行門靜脈化療或者門靜脈化療聯合肝動脈化療的比較研究；⑦ 標本的取材部位和取材量沒有進行控制和統一，而腫瘤不同部位其蛋白表達水平可能不同，使得結果可能出現偏倚。而通過完善上述缺陷，是否能夠得出相同結論還需要進一步證實。總之，在現有技術條件下，我們認為腫瘤組織 AFP 表達陽性是判斷 HCC 化療耐藥的一個重要指標，而其具體作用機制尚有待進一步研究。
肝細胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床常見的惡性腫瘤，全世界每年有 30～50 萬例新發患者，其發病率逐年上升，并且呈現年輕化趨勢[1]。我國屬肝癌高發國家，發病率居世界首位[2]，其給個人和家庭帶來了沉重的負擔。由于 HCC 具有多血管、惡性程度高、生長速度快、轉移范圍廣、復發率高等特點，僅有 20%～25% 的患者可以通過肝切除和肝移植治療，大多數患者初次就診時已經喪失了手術機會。肝動脈插管栓塞化療（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）是治療中晚期 HCC 常用的方法[3]，但化療多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）現象嚴重阻礙了 HCC 的化療效果。因此，研究引起肝癌 MDR 的相關因素、作用機制并逆轉 MDR，提高肝癌化療效果成為了亟待解決的問題之一。本研究從術前穿刺取得的肝臟腫瘤組織樣本中篩選出 HCC，利用免疫組織化學技術對其進行甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）檢測，同時評估 TACE 后的治療效果，旨在探討腫瘤組織中 AFP 的表達與化療耐藥的關系。
1 資料與方法
1.1 研究對象
對 2008 年 1 月至 2017 年 12 月期間東南大學附屬徐州醫院實施 TACE 治療的原發性肝癌患者進行篩選，入組標準為：① 術前行肝臟穿刺活檢或術中姑息性手術腫瘤活檢，病理學檢查結果提示原發性 HCC；② TACE 治療前未行根治性手術切除；③ TACE 前后均未行腫瘤微波消融或者射頻消融治療；④ 根據第 7 版美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）癌癥分期指南[4]，患者的臨床分期為 Ⅲ 期（ⅢA–ⅢC 期）；⑤ 患者手術前后臨床資料完整（包括手術前后影像資料以及檢驗結果）；⑥ 患者在 TACE 治療前未口服索拉非尼等靶向藥物。排除標準為：① 美國東部腫瘤協作組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG） 評分[5]>2 分；② 合并其他臟器如心、肺、腎功能不全者；③ DSA 造影發現中重度肝動脈-門靜脈瘺或肝動脈-肝靜脈瘺者；④ 合并有其他惡性腫瘤；⑤ 合并有糖尿病等內分泌或免疫系統疾病；⑥ 穿刺活檢結果為假陰性。共有 62 例患者符合上述條件納入研究，收集這些患者的臨床信息、影像資料及其腫瘤石蠟標本。本研究通過了醫院倫理委員會審批。
1.2 TACE 治療
62 例 HCC 患者行 TACE 前經穿刺或活檢留取 HCC 組織標本 3～4 條組織條備檢（其中 45 例行肝臟穿刺活檢，17 例患者術中探查發現無法行根治性手術而僅行肝腫瘤組織活檢）。TACE 治療過程為：采用 Seldinger 方法，于右側腹股溝區消毒、1% 利多卡因局部浸潤麻醉后，行右側股動脈穿刺，成功后置入導管鞘，導管選擇性插入肝動脈后行 DSA 造影，了解腫瘤的大小、位置、腫瘤血管分布、有無動靜脈瘺等，然后根據病灶大小和患者的肝功能狀況經導管分別注入絲裂霉素 C （MMC） 4～8 mg+5-氟尿嘧啶 （5-Fu） 500～1 000 mg+表阿霉素（E-ADM）10～30 mg 以及超液化碘油 20 mL，注射結束后拔出導管，對穿刺部位進行加壓包扎。17 例剖腹探查活檢患者根據其術后恢復情況，于術后 1 個月內行 TACE 治療，其 TACE 的治療過程與 45 例行肝臟穿刺活檢的患者一致。
1.3 TACE 療效觀察
患者于 TACE 治療前及治療后 1 個月均行 CT 檢查，使用的機器型號為 Brilliance 64 排螺旋 CT（美國 Philips 公司）或 Discovery CT750 HD 64 排螺旋 CT（美國 GE 公司）。由兩位高年資影像科醫師進行雙盲法圖像分析。觀察指標包括：腫瘤部位、大小、形態、強化程度、強化形式以及腫瘤與周圍血管的關系。按照歐洲肝病學會（European Association for the study of the liver，EASL）標準進行療效評價[6-7]：完全緩解（complete response，CR）定義為腫瘤沒有強化區域，反映了腫瘤完全壞死；部分緩解（partial response，PR）定義為強化區面積減少 50%以上，代表腫瘤部分壞死；穩定（stable disease，SD）定義為腫瘤反應在 PR 和 PD 之間；進展（progressive disease，PD）定義為 1 個可測量病灶增大 25%以上或新病灶出現。將療效達到 CR 和 PR 的患者歸入化療敏感組，而療效屬于 SD 和 PD 的患者歸入化療耐藥組。
1.4 HCC 組織中 AFP 表達的檢測
首先對獲取的 HCC 組織標本行蘇木精-尹紅（hematoxylin and eosin，HE）染色以明確 HCC 診斷，然后采用 EnVision 二步法行免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）染色檢測 HCC 組織中 AFP 的表達。AFP 抗體購自 Roche 公司，由 Roche Benchmark XT 全自動免疫組化儀完成檢測。根據陽性細胞在全部組織細胞中所占比例判定染色結果，其中腫瘤細胞無染色判為陰性；陽性細胞占比<10% 判為局灶陽性；陽性細胞占比為 10%～30% 判為弱陽性；陽性細胞占比 30%～70% 判為中度陽性；陽性細胞占比>70% 判為強陽性。將腫瘤細胞無染色、局灶陽性以及弱陽性病例判為 AFP 表達陰性，而腫瘤細胞中度陽性以及強陽性的病例則判為 AFP 表達陽性。
1.5 統計學方法
采用 STATA10.0 軟件進行分析。計量指標以均數±標準差（±s）表示，2 組間比較采用 t 檢驗；計數資料的比較采用 χ2 檢驗或 Fisher 檢驗；腫瘤組織中 AFP 的表達與化療耐藥之間的相關性采用 logistic 回歸分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 HCC 組織中 AFP 表達與腫瘤耐藥的關系
將 62 例患者行 TACE 治療前與治療后 1 個月的 CT 檢查結果進行比較，結果顯示有 26 例患者（41.9%）TACE 治療后符合化療敏感標準，其中符合 CR 標準 0 例，符合 PR 標準 26 例，其余 36 例患者（58.1%）考慮化療耐藥，其中符合 SD 標準 24 例，PD 標準 12 例，即化療敏感組 26 例，化療耐藥組 36 例。免疫組化染色結果顯示，原發性 HCC 組織中 AFP 陽性染色主要位于細胞質，部分胞膜也有著色（圖 1），62 例中 AFP 染色陽性者 42 例（67.7%），AFP 染色陰性者 20 例（32.3%）。在 42 例 AFP 染色陽性者中，化療耐藥者有 29 例（69.0%），在 20 例 AFP 染色陰性者中，化療耐藥者有 7 例（35.0%），見表 1。該結果提示：HCC 組織中 AFP 表達陽性與腫瘤耐藥具有相關性。
圖1
示 HCC 組織中 AFP 免疫組化染色結果
a：示 HCC 組織中 AFP 強陽性染色，染色部位位于細胞質，部分在細胞膜（IHC ×100）；b：示 HCC 組織中 AFP 陰性染色（IHC ×100）
表1
62 例 HCC 患者的 AFP 表達與 TACE 療效的關系［例（%）］
2.2 HCC 患者臨床病理特征與腫瘤耐藥的關系
結果見表 2。由表 2 可見，化療敏感組與化療耐藥組患者在性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤分化程度、肝功能 Child-Pugh 分級以及是否合并肝炎 ［乙型肝炎和（或）丙型肝炎］ 方面之間的差異均無統計學意義（P>0.05），而在患者血清 AFP 水平、是否合并門靜脈癌栓（portal veinous tumor thrombus，PVTT）以及腫瘤數量方面 2 組間比較差異有統計學意義（P<0.05），化療敏感組的 AFP 水平陽性、合并門靜脈癌栓以及腫瘤單發患者的占比顯著低于化療耐藥組。
表2
62 例 HCC 患者臨床病理學特征與腫瘤耐藥的關系
2.3 HCC 化療耐藥影響因素的 logistic 回歸分析結果
對可能影響 HCC 化療耐藥的因素進一步行 logistic 回歸單因素和多因素分析，其單因素分析結果顯示，腫瘤組織的 AFP 陽性表達，血清 AFP 水平升高、合并 PVTT 以及腫瘤數量是 HCC 化療耐藥的相關危險因素（P<0. 05) ；多因素分析結果顯示，腫瘤組織的 AFP 陽性表達和合并 PVTT 是 HCC 化療耐藥的獨立危險因素（P<0.05)，見表 3。
表3
HCC 化療耐藥影響因素的 logistic 回歸分析
3 討論
AFP 是一種分子量約為 70×103的胚胎性糖蛋白，由 500 個氨基酸組成，由 Halbrecht 等[8]于 1956 年從胎兒血清中首次發現，1964 年 Tatarinov[9]首次從 HCC 患者的血清中檢測到 AFP，1978 年在第 12 屆國際癌癥大會上正式確認 AFP 是一種特異性的肝癌標志物，其作用至今尚無其他標志物可以取代。既往國內外對 AFP 的診斷價值及其與 HCC 臨床病理之間的關系進行了大量的研究報道，結果發現無論是手術還是姑息性治療，高表達 AFP 的患者均較低表達 AFP 的患者預后更差，甚至一些肝臟腫瘤分期系統（如 CLIP 分期系統）都將 AFP 水平作為一個預后因素[10]。然而，關于 AFP 與 HCC 化療耐藥之間的關系卻鮮有報道。因此，本研究通過分析 HCC 的組織中 AFP 表達、腫瘤分化程度、血清 AFP 水平以及臨床特征，探討 HCC 化療耐藥的影響因素，有助于為逆轉 MDR 提供新的理論線索和潛在的干預靶標。
本研究結果表明，HCC 組織中 AFP 表達陽性是影響其化療耐藥的一個重要因素。其作用機制可能與以下因素有關：① 通過上調 MDR1 基因的表達誘導肝臟腫瘤耐藥。體外實驗[11]顯示，在 AFP 陰性的肝癌細胞系 SMMC-7721 中轉染 AFP 表達顆粒后，發現其 MDR1 的表達產物 P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）顯著增高。而通過反義 RNA 重組腺病毒載體靶向逆轉 AFP 陽性的肝癌多藥耐藥細胞 HepG2R 后，能夠有效降低 P-gp 的表達[12]。鑒于 P-gp 蛋白具有 ATP 依賴性跨膜轉運活性，可將藥物轉運至細胞外，因此可使得細胞獲得耐藥性。② 通過抗凋亡作用引起耐藥。目前已知腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）及其受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）和 Fas 及其配體（Fas ligand，FasL）均在細胞凋亡中起到重要的作用。而在 HCC 組織中 AFP 能夠下調肝臟腫瘤細胞 TNFR 的表達、上調 FasL 的表達以及抑制淋巴細胞中 TNF 的分泌[13-15]，這種主動防御方式，不僅可以使得腫瘤凋亡減少，還可以導致腫瘤周圍淋巴細胞凋亡增多。除了 TNF/TNFR 和 Fas/FasL 系統外，有研究[16]發現，AFP 可以促進肝癌細胞突變型 p53 基因的表達，導致其失去野生型 p53 基因所具有的抑制 survivin 基因表達的功能，survivin 表達產物能夠抑制 caspase-3,7,9 的活性，阻礙細胞凋亡的發生。上述這些抗腫瘤細胞凋亡作用減弱了化療藥物對 HCC 的影響。③ 促進腫瘤細胞增殖的作用。目前已知磷酸肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，AKT）/雷帕霉素靶蛋白（the mammalian target of rapamycin，mTOR）通路可以促進細胞增殖并抑制其凋亡，在腫瘤的發生發展過程中起到極其重要的作用。而第 10 號染色體磷酸酶和張力蛋白同源丟失性基因（phosphatase and tension homolog deleted on chromosome ten，PTEN）被認為是繼 p53 基因后，另一種與腫瘤發生關系密切的抑癌基因，其編碼的產物可以對上述通路產生抑制作用[17]；在前列腺癌、子宮內膜癌、腎癌、膠質母細胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、甲狀腺癌、肺癌、膀胱癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤等多種腫瘤中均已發現該基因異常[17-18]。在 HCC 中已有研究[19]發現，AFP 與腫瘤細胞膜上受體結合后，能夠抑制 PTEN 活性，從而激活 P13K/AKT/mTOR 信號通路，促進 Src、Ras 等癌基因的表達。此外，AFP 還可以通過影響細胞內的第 2 信息物質 cAMP 和 Ca2+等的濃度，從而調控轉錄調節因子的作用，促進 Ras、C-fos、C-jun 等癌基因的表達[20]。這些癌基因最終將導致 HCC 的惡性轉化及腫瘤增殖[21-22]。
本研究中需要引起我們注意的是，血清 AFP 陽性在多因素回歸分析中并無顯著意義。考慮是因為部分 HCC 腫瘤組織中雖然表達 AFP，但并未分泌入血或者分泌入血極少，使得血清中 AFP 檢測為陰性。但是目前已知 AFP 在細胞內也可與 caspase-3 結合，通過抑制其活性，阻斷凋亡信號的轉導，從而使得肝癌細胞耐受化學藥物誘導的凋亡[23-24]。該結果提示：HCC 組織的 AFP 陽性表達較血清 AFP 陽性對明確腫瘤耐藥具有更高的特異度及臨床應用價值。
目前已知 PVTT 是 HCC 患者預后較差的主要原因之一，而在本研究中我們發現其也是 HCC 化療耐藥的獨立危險因素。這主要是因為：① HCC 腫瘤中心區的血供來自于肝動脈，而包括 PVTT 在內的腫瘤周圍組織血供主要來自于門靜脈，因此 TACE 對于門靜脈出現癌栓治療效果甚微。② PVTT 形成后會增大門靜脈壓力，減少門靜脈血供，使得肝臟的儲備能力降低。雖然門靜脈和肝動脈之間存在廣泛的吻合支[25]，但是 TACE 治療后動脈栓塞則必然會進一步損傷肝功能，從而限制了具有肝毒性的化療藥物使用的劑量，最終導致化療效果不佳。③ PVTT 可引起腫瘤血管的功能異常，形成缺氧的微環境，促進缺氧誘導因子 1α 的生成（hypoxia-inducible factor，HIF-1α）。體外實驗[26]中已經證實 HepG2 肝癌細胞可通過 HIF-1α 調控 MDR 基因的表達，導致耐藥表型形成；而在體內實驗[27]中，HIF-1α 蛋白的表達水平在耐藥肝癌組織中顯著高于化療敏感肝癌組織，這也間接說明了 HIF-1α 在 HCC 化療耐藥的形成過程中起了重要作用。
本研究也存在一些局限性：① 樣本量較少；② 化療方案單一；③ 不能排除超液化碘油對腫瘤治療的影響，使得結果出現偏倚；④ 單中心研究；⑤ 沒有對患者進行生存分析；⑥ 給藥途徑單一，沒有進行門靜脈化療或者門靜脈化療聯合肝動脈化療的比較研究；⑦ 標本的取材部位和取材量沒有進行控制和統一，而腫瘤不同部位其蛋白表達水平可能不同，使得結果可能出現偏倚。而通過完善上述缺陷，是否能夠得出相同結論還需要進一步證實。總之，在現有技術條件下，我們認為腫瘤組織 AFP 表達陽性是判斷 HCC 化療耐藥的一個重要指標，而其具體作用機制尚有待進一步研究。
