引用本文： 房偉, 馬世勛, 馬云濤, 詹渭鵬, 李淵, 李一平, 狐鳴. 氧化苦參堿誘導胃癌 BGC-823 細胞發生 caspase-12 依賴性內質網應激凋亡的機制研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(4): 399-404. doi: 10.7507/1007-9424.201811043 復制
胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一[1]。由于化療藥物治療胃癌存在毒副作用、耐藥性等許多局限性[2-3]，我們需要找到既有抗腫瘤活性并且低毒性的藥物。氧化苦參堿是從傳統中藥苦參中提取的一種生物堿，具有抗腫瘤等多種藥理作用。凋亡是細胞死亡的主要形式之一[4]。目前已闡明的細胞凋亡途徑有線粒體途徑、死亡受體途徑和內質網應激途徑[5-7]。內質網應激介導的細胞凋亡有自身的信號傳導通路，能獨立誘導細胞凋亡，是目前的研究熱點之一[8]。氧化苦參堿是否可以通過內質網應激途徑誘導胃癌細胞凋亡目前仍未闡明。本研究擬通過觀察氧化苦參堿對胃癌 BGC-823 細胞增殖和凋亡的影響來證明內質網應激參與氧化苦參堿誘導的胃癌細胞的凋亡，為氧化苦參堿抗腫瘤機制研究提供新的思路，為中藥單體及聯合用藥治療胃癌提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 細胞系和主要試劑及設備
人胃癌 BGC-823 細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所。氧化苦參堿由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供，為分析標準品。RPMI 1640 和 DMEM 培養基，Hyclone 公司；胎牛血清，元亨金馬公司。Western blot 全部抗體及內質網應激抑制劑 salubrinal，Sigma 公司；逆轉錄（RT-PCR）試劑盒，北京全式金生物技術公司；二氧化碳（CO2）孵箱、離心機、低溫離心機及酶標儀，Thermo 公司；普通 PCR 儀、聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）儀和電轉印系統，Bio-Rad 公司；流式細胞儀，BD Biosciences。
1.2 細胞培養及分組
人胃癌 BGC-823 細胞被培養在含 10% 的胎牛血清的 DMEM 培養液中，培養基含硫酸鏈霉素（100 U/mL）、青霉素（100 U/mL）。培養條件為 37 ℃、5% CO2，飽和濕度。于 24 h 后觀察細胞的生長及貼壁情況并更換培養液。將對數生長期的胃癌 BGC-823 細胞分為對照組、氧化苦參堿單藥組（簡稱“單藥組”，10、30、60 和 90 μmol/L 濃度的氧化苦參堿處理）和聯合組（各濃度的氧化苦參堿聯合 2 μmol/L 內質網應激抑制劑 salubrinal處理）。
1.3 MTT 法檢測氧化苦參堿對人胃癌 BGC-823 細胞生長的抑制作用
收集對數生長期細胞，調整細胞懸液濃度，在 96 孔平底板中每孔加入 100 μL 細胞懸液，鋪板調待測細胞密度至（1 000～10 000）個/孔，邊緣孔用無菌磷酸鹽緩沖溶液（PBS）填充，于 5% CO2、37 ℃ 孵育至細胞單層鋪滿孔底。對照組每孔加入培養液 110 μL；單藥組每孔分別加入 10、30、60 和 90 μmol/L 濃度的氧化苦參堿溶液 100 μL 及培養液 10 μL；聯合組每孔分別加入不同濃度的氧化苦參堿 100 μL 及 2 μmol/L 內質網應激抑制劑 salubrinal 10 μL。各組均設 5 個復孔。于 5% CO2、37 ℃ 孵育 24、48 及 72 h 時分別于倒置顯微鏡下觀察。每孔加入 20 μL MTT 溶液（5 mg/mL，即 0.5% MTT）繼續培養 4 h 后終止培養，小心吸去孔內培養液。每孔加入 150 μL 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩 10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀 490 nm 處測量各孔的吸光度值并計算細胞抑制率，細胞抑制率=（1–吸光度值處理組/吸光度值對照組）×100%。
1.4 流式細胞術檢測細胞周期
取對數生長期的細胞，按 1×106個/mL 以 2 mL 接種于 6 孔板內，給予不同濃度藥物處理 48 h 后終止培養。800 r/min（r=10 cm）離心 5 min，收集細胞沉淀，棄上清，用預冷 PBS 洗滌 2 次，加入預冷 75% 乙醇，于 4 ℃ 固定 4 h 以上；再以 1 500 r/min（r=10 cm）離心 5 min，棄上清，以 3 mL 的 PBS 洗滌 1 次，加入 400 μL 溴化乙錠（PI，50 μg/mL），100 μL RNase A（100 μg/mL），4 ℃ 避光孵育 30 min。以標準程序用流式細胞儀檢測，一般計數（2～3）×104個細胞，結果用細胞周期擬和軟件 ModFit 分析。
1.5 流式細胞 Annexin V-PI 雙標染色法檢測細胞凋亡
對照組采用胰酶消化細胞，單藥組用 60 μmol/L 氧化苦參堿處理細胞，聯合組采用60 μmol/L 氧化苦參堿聯合2 μmol/L salubrinal處理細胞，處理 48 h 時收集上述溶液并離心，細胞沉淀用 PBS 洗 2 次，加入 500 μL Binding Buffer 制成 1×106個/mL 單細胞懸液，加入 5 μL Annexin V，再加入 5 μL PI，室溫，避光，反應 10 min。用流式細胞儀在激發波長 488 nm、吸收波長 600 nm 測定細胞凋亡，實驗重復 5 次。
1.6 Western blot 法檢測 GRP78/Bip 和 caspase-12 蛋白表達
收集對照組、單藥組（10、30、60 和 90 μmol/L 氧化苦參堿）和聯合組（各濃度的氧化苦參堿聯合 2 μmol/L salubrinal）處理 48 h 的細胞（1×106個/mL 單細胞懸液各 2 mL），3 000 r/min （r=10 cm）離心5 min，沉淀加入適量蛋白裂解液，冰上裂解 10 min。4 ℃ 12 000×g 離心 10 min，吸取上清，用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。制備電泳樣品，配制 10% 的 SDS-PAGE 分離膠及濃縮膠，上樣（根據樣品蛋白濃度調整上樣量為 20～30 μL，對照孔中加入 Marker 3～5 μL），電泳（先恒壓 60 V 電泳，跑出濃縮膠后調至 90 V，恒壓電泳至蛋白樣品中的溴酚藍跑至距分離膠下緣 1 cm 處），準備 PVDF 膜，電轉移（恒壓 60 V，轉印 180 min）。取出 PVDF 膜，5% 的脫脂牛奶室溫封閉 60 min。TBST 洗 3 遍，每次 10 min。取出 PVDF 膜，分別用 1∶1 000 比例 GRP78/Bip、caspase-12 和 GAPDH 的抗體 4 ℃ 旋轉孵育過夜。再用 TBST 洗 3 遍，每次 10 min。用稀釋比例為 1∶10 000 二抗室溫孵育 1 h。用 TBST 洗 3 遍，每次 10 min。取出 PVDF 膜，ECL 發光液 A 液和 B 液 1∶1 混勻后，均勻滴在 PVDF 膜上，再將 PVDF 膜放入 Chemiscope 凝膠成像系統進行拍照并進行分析處理。
1.7 RT-PCR 法檢測 GRP78/Bip 和 caspase-12 基因的表達
收集對照組、單藥組（10、30、60 和 90 μmol/L 氧化苦參堿）和聯合組（各濃度的氧化苦參堿聯合 2 μmol/L salubrinal）處理 48 h 時的細胞，移入 1.5 mLEP 管中，3 000 r/min（r=10 cm）離心 5 min，去上清，加入 1 mL Trizol 混勻；加入 200 μL 三氯甲烷，振蕩 15 s，室溫放置 10 min，4 ℃ 12 000×g 離心 15 min，吸取上層液體移入 1.5 mL EP 管中，加入 500 μL 異丙醇后混勻，室溫放置 10 min，4 ℃ 12 000×g 離心 15 min，棄上清，加入 1 mL 75% 乙醇混勻，4 ℃ 7 500×g 離心 5 min，沉淀加入 20 μL 水溶解，通過紫外分光光度計測定 RNA 濃度和純度。通過反轉錄試劑盒用普通 PCR 儀將提取的 mRNA 反轉錄為 cDNA。mRNA 為 50 ng，反應體系為 20 μL：2×TS Reaction Mix 10 μL，Random Primer 1 μL，Trans-Script RT/RI Enzyme Mix 1 μL，H2O 和 RNA 8 μL。使用普通 PCR 儀對 cDNA 進行擴增。反應體系為 20 μL：上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，Taq 酶 10 μL，H2O 8 μL，cDNA 1 μL。所有引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成，引物序列見表 1。配制 DNA 電泳凝膠，將擴增好的 cDNA 加入電泳槽中，上樣量 20 μL，電壓 120 V，電流 80 mA，電泳結束后用紫外分析儀進行拍照保存，各基因表達水平按該基因條帶與 GAPDH 條帶的吸光度值比表示。
表1
PCR 引物序列
1.8 統計學方法
采用 SPSS 21.0 統計軟件對數據進行分析。實驗數據以均數±標準差（
±s）表示，采用單因素方差分析和最小顯著差異 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 氧化苦參堿對胃癌 BGC-823 細胞生長的影響
隨著氧化苦參堿濃度升高，與對照組比較，各觀察時間點單藥組胃癌 BGC-823 細胞的吸光度值呈下降趨勢（P<0.05），相應地細胞抑制率呈上升趨勢（P<0.05），見圖 1a、1b；經分析，氧化苦參堿作用 48 h 時對 BGC-823 細胞的抑制率影響最明顯，此時的 IC50 為（59.5±0.5） μmol/L。不同濃度氧化苦參堿聯合 2 μmol/L salubrinal 處理 48 h 時的胃癌 BGC-823 細胞生長情況見圖 1c、1d，從圖中可見，與單藥比較，聯合用藥時的吸光度值升高、抑制率明顯降低，尤其是氧化苦參堿為 30、60 和 90 μmol/L 濃度時差異有統計學意義（P<0.05）。
圖1
示氧化苦參堿對胃癌 BGC-823 細胞生長、細胞周期及凋亡影響的結果
a、b：分別為不同濃度氧化苦參堿處理胃癌 BGC-823 細胞 24、48、72 h 時的吸光度值（a）和抑制率（b），與相應時間點對照組比較，*
2.2 氧化苦參堿對胃癌 BGC-823 細胞周期和凋亡的影響
① 與對照組比較，隨著氧化苦參堿濃度的增加，G2/M 期細胞數和細胞凋亡率呈增加（或增高）趨勢（P<0.05），G0/G1 期細胞數呈下降趨勢（P<0.05），S 期細胞數變化不明顯（P>0.05），見圖 1e。② 與對照組比較，處理 48 h 后，單藥組及聯合組的胃癌 BGC-823 細胞的 G0/G1 期和 S 期細胞數均明顯減少（P<0.05），G2/M 期細胞數增多（P<0.05），細胞凋亡率增高（P<0.05）；與單藥組比較，聯合組的胃癌 BGC-823 細胞 G0/G1 期和 S 期細胞增多（P<0.05），G2/M 期細胞數減少（P<0.05），細胞凋亡率降低（P<0.05），見圖 1f。
2.3 Western blot 和RT-PCR法檢測 GRP78/Bip 和 caspase-12 蛋白和基因表達結果
① 經不同濃度氧化苦參堿單獨處理 48 h 后各組胃癌 BGC-823 細胞中 GRP78/Bip 和 caspase-12 蛋白和基因表達結果見圖 2a–2c ，從圖中可見，與對照組比較，隨著氧化苦參堿藥物濃度的增加（除 10 μmol/L 氧化苦參堿組 caspase-12 蛋白和基因外），GRP78/Bip 和 caspase-12 蛋白和基因表達水平均呈升高趨勢且呈劑量依賴性（P<0.05）。② 經不同濃度氧化苦參堿聯合 2 μmol/L salubrinal 處理 48 h 后各組胃癌 BGC-823 細胞中 GRP78/Bip 和 caspase-12 蛋白和基因表達結果見圖 2d–2f，從圖中可見，與對照組比較，單獨 2 μmol/L salubrinal 處理組的 GRP78/Bip 和 caspase-12 蛋白和基因表達變化均不明顯（P>0.05），但隨著氧化苦參堿濃度的增加（除 60 μmol/L 氧化苦參堿聯合組中 GRP78/Bip 蛋白和基因外），聯合用藥各組細胞中 GRP78/Bip 和 caspase-12 蛋白和基因表達水平均呈升高趨勢且呈劑量依賴性（P<0.05）。③ 與相應濃度單藥比較，30、60 及 90 μmol/L 濃度氧化苦參堿聯合 2 μmol/L salubrinal 處理 48 h 后各組細胞中 GRP78/Bip 蛋白（除外 30 μmol/L 濃度氧化苦參堿聯合組）和 caspase-12 蛋白和基因表達均降低（P<0.05），見圖 2g–2j。
圖2
示?Western blot 和 RT-PCR 法檢測 GRP78/Bip和 caspase-12 蛋白和基因表達結果
a–c：分別為經不同濃度氧化苦參堿單藥處理48 h后各組胃癌 BGC-823 細胞中 GRP78/Bip 和 caspase-12 蛋白（a、b）和基因（c）表達結果，與對照組比較，*
3 討論
目前胃癌的治療措施主要有手術、化療、放療、免疫治療等，我們需要找到既有抗腫瘤活性且又低毒性的藥物，尤其是從天然產品中提取活性有效成分已成為一種趨勢[9]。氧化苦參堿是從傳統中藥苦參中提取的一種生物堿，具有多種藥理作用[10]。有研究[11]表明，氧化苦參堿可抑制胰酶活性、抗炎、抑菌、抗氧化、利尿、免疫調節、保護肝腎、松弛血管、促進胃腸蠕動、抑制血小板聚集、改善微循環等；另有研究[12]認為，氧化苦參堿可抑制多種腫瘤細胞增殖及誘導腫瘤細胞凋亡，可逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性，還可抑制腫瘤血管生成及腫瘤侵襲及轉移，而且還具有明顯的腫瘤化療增敏及減毒作用。盡管目前關于氧化苦參堿抗腫瘤作用的研究較多，然而其抗腫瘤的分子機制仍不完全清楚。
本研究對氧化苦參堿的抗腫瘤作用的分子機制進行了研究，研究目標是中藥誘導胃癌細胞凋亡的內質網應激途徑[13]。采用 MTT 法檢測細胞生長情況、流式細胞術檢測細胞周期改變、Annexin Ⅴ-PI 雙標染色法檢測細胞凋亡情況，同時聯用內質網應激抑制劑 salubrinal 調控氧化苦參堿誘導的胃癌細胞凋亡，以期為胃癌的治療和預后提供基礎資料；又從蛋白水平和基因水平分別檢測 GRP78 和 caspase-12 表達，以證明氧化苦參堿誘導腫瘤細胞凋亡的信號傳導通路并闡明氧化苦參堿對胃癌治療的作用機制，為其治療胃癌提供理論依據。本研究結果發現，氧化苦參堿對人胃癌 BGC-823 細胞具有明顯的生長抑制作用，該作用可能與 caspase-12 依賴性誘導凋亡及 GRP78/Bip 表達水平上調有關；而內質網應激抑制劑 salubrinal 聯合作用時能夠有效逆轉由氧化苦參堿引起的腫瘤細胞生長抑制、凋亡增加及 GRP78/Bip 和 caspase-12 蛋白及基因表達水平的升高，結果提示，氧化苦參堿對人胃癌 BGC-823 細胞生長抑制及凋亡誘導機制可能是其通過激活 caspase-12 依賴性內質網應激、上調 GRP78/Bip 表達水平，從而引起細胞周期阻滯，最終誘導細胞凋亡，但仍需進一步實驗驗證。
凋亡是細胞死亡的主要形式之一。目前已闡明的細胞凋亡途徑主要有線粒體途徑、死亡受體途徑和內質網應激途徑 3 個[14]。內質網應激是真核細胞內正常存在的一種應激機制，維持細胞的生存，而過度的內質網應激則可導致細胞凋亡。內質網應激介導的細胞凋亡有自身的信號傳導通路，能獨立誘導細胞凋亡。已有的研究[15]證明，氧化苦參堿可通過線粒體途徑介導多種細胞的凋亡，但氧化苦參堿是否可以通過內質網應激途徑誘導細胞凋亡還未見闡明。Hu 等[14]研究發現，在內質網應激凋亡通路中 caspase-12 激活介導的大鼠肝細胞凋亡的纖維化肝臟中 GRP78、GRP94、Procaspase-12、活性 caspase-12 蛋白表達仍保持在高水平。在本研究中發現，氧化苦參堿可抑制人胃癌細胞株 BGC-823 的生長且呈時間-濃度依賴性，與文獻[16]報道一致；還通過流式細胞儀探討了氧化苦參堿抑制胃癌 BGC-823 細胞增殖的機制[17]，結果發現，氧化苦參堿能誘導該細胞凋亡，發生 G2/M 期細胞阻滯。Western blot 和 RT-PCR 檢測結果顯示，內質網應激抑制劑 salubrinal 聯合作用時能夠有效逆轉由氧化苦參堿引起 GRP78/Bip 和 caspase-12 蛋白及基因表達水平的升高。因此我們推測，氧化苦參堿抑制胃癌 BGC-823 細胞增殖及誘導凋亡可能與 caspase-12 作用激活 GRP78 信號分子從而啟動凋亡程序有關，這也是在后期的實驗中需要進一步證實的。
從本研究初步研究的結果提示，氧化苦參堿具有抑制細胞增殖及凋亡的作用，其在開發和選擇胃癌化療藥物的過程中具有很大的潛力，這為從中藥成分中研制和開發新的有效化療藥物開拓了新思路。
胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一[1]。由于化療藥物治療胃癌存在毒副作用、耐藥性等許多局限性[2-3]，我們需要找到既有抗腫瘤活性并且低毒性的藥物。氧化苦參堿是從傳統中藥苦參中提取的一種生物堿，具有抗腫瘤等多種藥理作用。凋亡是細胞死亡的主要形式之一[4]。目前已闡明的細胞凋亡途徑有線粒體途徑、死亡受體途徑和內質網應激途徑[5-7]。內質網應激介導的細胞凋亡有自身的信號傳導通路，能獨立誘導細胞凋亡，是目前的研究熱點之一[8]。氧化苦參堿是否可以通過內質網應激途徑誘導胃癌細胞凋亡目前仍未闡明。本研究擬通過觀察氧化苦參堿對胃癌 BGC-823 細胞增殖和凋亡的影響來證明內質網應激參與氧化苦參堿誘導的胃癌細胞的凋亡，為氧化苦參堿抗腫瘤機制研究提供新的思路，為中藥單體及聯合用藥治療胃癌提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 細胞系和主要試劑及設備
人胃癌 BGC-823 細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所。氧化苦參堿由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供，為分析標準品。RPMI 1640 和 DMEM 培養基，Hyclone 公司；胎牛血清，元亨金馬公司。Western blot 全部抗體及內質網應激抑制劑 salubrinal，Sigma 公司；逆轉錄（RT-PCR）試劑盒，北京全式金生物技術公司；二氧化碳（CO2）孵箱、離心機、低溫離心機及酶標儀，Thermo 公司；普通 PCR 儀、聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）儀和電轉印系統，Bio-Rad 公司；流式細胞儀，BD Biosciences。
1.2 細胞培養及分組
人胃癌 BGC-823 細胞被培養在含 10% 的胎牛血清的 DMEM 培養液中，培養基含硫酸鏈霉素（100 U/mL）、青霉素（100 U/mL）。培養條件為 37 ℃、5% CO2，飽和濕度。于 24 h 后觀察細胞的生長及貼壁情況并更換培養液。將對數生長期的胃癌 BGC-823 細胞分為對照組、氧化苦參堿單藥組（簡稱“單藥組”，10、30、60 和 90 μmol/L 濃度的氧化苦參堿處理）和聯合組（各濃度的氧化苦參堿聯合 2 μmol/L 內質網應激抑制劑 salubrinal處理）。
1.3 MTT 法檢測氧化苦參堿對人胃癌 BGC-823 細胞生長的抑制作用
收集對數生長期細胞，調整細胞懸液濃度，在 96 孔平底板中每孔加入 100 μL 細胞懸液，鋪板調待測細胞密度至（1 000～10 000）個/孔，邊緣孔用無菌磷酸鹽緩沖溶液（PBS）填充，于 5% CO2、37 ℃ 孵育至細胞單層鋪滿孔底。對照組每孔加入培養液 110 μL；單藥組每孔分別加入 10、30、60 和 90 μmol/L 濃度的氧化苦參堿溶液 100 μL 及培養液 10 μL；聯合組每孔分別加入不同濃度的氧化苦參堿 100 μL 及 2 μmol/L 內質網應激抑制劑 salubrinal 10 μL。各組均設 5 個復孔。于 5% CO2、37 ℃ 孵育 24、48 及 72 h 時分別于倒置顯微鏡下觀察。每孔加入 20 μL MTT 溶液（5 mg/mL，即 0.5% MTT）繼續培養 4 h 后終止培養，小心吸去孔內培養液。每孔加入 150 μL 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩 10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀 490 nm 處測量各孔的吸光度值并計算細胞抑制率，細胞抑制率=（1–吸光度值處理組/吸光度值對照組）×100%。
1.4 流式細胞術檢測細胞周期
取對數生長期的細胞，按 1×106個/mL 以 2 mL 接種于 6 孔板內，給予不同濃度藥物處理 48 h 后終止培養。800 r/min（r=10 cm）離心 5 min，收集細胞沉淀，棄上清，用預冷 PBS 洗滌 2 次，加入預冷 75% 乙醇，于 4 ℃ 固定 4 h 以上；再以 1 500 r/min（r=10 cm）離心 5 min，棄上清，以 3 mL 的 PBS 洗滌 1 次，加入 400 μL 溴化乙錠（PI，50 μg/mL），100 μL RNase A（100 μg/mL），4 ℃ 避光孵育 30 min。以標準程序用流式細胞儀檢測，一般計數（2～3）×104個細胞，結果用細胞周期擬和軟件 ModFit 分析。
1.5 流式細胞 Annexin V-PI 雙標染色法檢測細胞凋亡
對照組采用胰酶消化細胞，單藥組用 60 μmol/L 氧化苦參堿處理細胞，聯合組采用60 μmol/L 氧化苦參堿聯合2 μmol/L salubrinal處理細胞，處理 48 h 時收集上述溶液并離心，細胞沉淀用 PBS 洗 2 次，加入 500 μL Binding Buffer 制成 1×106個/mL 單細胞懸液，加入 5 μL Annexin V，再加入 5 μL PI，室溫，避光，反應 10 min。用流式細胞儀在激發波長 488 nm、吸收波長 600 nm 測定細胞凋亡，實驗重復 5 次。
1.6 Western blot 法檢測 GRP78/Bip 和 caspase-12 蛋白表達
收集對照組、單藥組（10、30、60 和 90 μmol/L 氧化苦參堿）和聯合組（各濃度的氧化苦參堿聯合 2 μmol/L salubrinal）處理 48 h 的細胞（1×106個/mL 單細胞懸液各 2 mL），3 000 r/min （r=10 cm）離心5 min，沉淀加入適量蛋白裂解液，冰上裂解 10 min。4 ℃ 12 000×g 離心 10 min，吸取上清，用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。制備電泳樣品，配制 10% 的 SDS-PAGE 分離膠及濃縮膠，上樣（根據樣品蛋白濃度調整上樣量為 20～30 μL，對照孔中加入 Marker 3～5 μL），電泳（先恒壓 60 V 電泳，跑出濃縮膠后調至 90 V，恒壓電泳至蛋白樣品中的溴酚藍跑至距分離膠下緣 1 cm 處），準備 PVDF 膜，電轉移（恒壓 60 V，轉印 180 min）。取出 PVDF 膜，5% 的脫脂牛奶室溫封閉 60 min。TBST 洗 3 遍，每次 10 min。取出 PVDF 膜，分別用 1∶1 000 比例 GRP78/Bip、caspase-12 和 GAPDH 的抗體 4 ℃ 旋轉孵育過夜。再用 TBST 洗 3 遍，每次 10 min。用稀釋比例為 1∶10 000 二抗室溫孵育 1 h。用 TBST 洗 3 遍，每次 10 min。取出 PVDF 膜，ECL 發光液 A 液和 B 液 1∶1 混勻后，均勻滴在 PVDF 膜上，再將 PVDF 膜放入 Chemiscope 凝膠成像系統進行拍照并進行分析處理。
1.7 RT-PCR 法檢測 GRP78/Bip 和 caspase-12 基因的表達
收集對照組、單藥組（10、30、60 和 90 μmol/L 氧化苦參堿）和聯合組（各濃度的氧化苦參堿聯合 2 μmol/L salubrinal）處理 48 h 時的細胞，移入 1.5 mLEP 管中，3 000 r/min（r=10 cm）離心 5 min，去上清，加入 1 mL Trizol 混勻；加入 200 μL 三氯甲烷，振蕩 15 s，室溫放置 10 min，4 ℃ 12 000×g 離心 15 min，吸取上層液體移入 1.5 mL EP 管中，加入 500 μL 異丙醇后混勻，室溫放置 10 min，4 ℃ 12 000×g 離心 15 min，棄上清，加入 1 mL 75% 乙醇混勻，4 ℃ 7 500×g 離心 5 min，沉淀加入 20 μL 水溶解，通過紫外分光光度計測定 RNA 濃度和純度。通過反轉錄試劑盒用普通 PCR 儀將提取的 mRNA 反轉錄為 cDNA。mRNA 為 50 ng，反應體系為 20 μL：2×TS Reaction Mix 10 μL，Random Primer 1 μL，Trans-Script RT/RI Enzyme Mix 1 μL，H2O 和 RNA 8 μL。使用普通 PCR 儀對 cDNA 進行擴增。反應體系為 20 μL：上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，Taq 酶 10 μL，H2O 8 μL，cDNA 1 μL。所有引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成，引物序列見表 1。配制 DNA 電泳凝膠，將擴增好的 cDNA 加入電泳槽中，上樣量 20 μL，電壓 120 V，電流 80 mA，電泳結束后用紫外分析儀進行拍照保存，各基因表達水平按該基因條帶與 GAPDH 條帶的吸光度值比表示。
表1
PCR 引物序列
1.8 統計學方法
采用 SPSS 21.0 統計軟件對數據進行分析。實驗數據以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析和最小顯著差異 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 氧化苦參堿對胃癌 BGC-823 細胞生長的影響
隨著氧化苦參堿濃度升高，與對照組比較，各觀察時間點單藥組胃癌 BGC-823 細胞的吸光度值呈下降趨勢（P<0.05），相應地細胞抑制率呈上升趨勢（P<0.05），見圖 1a、1b；經分析，氧化苦參堿作用 48 h 時對 BGC-823 細胞的抑制率影響最明顯，此時的 IC50 為（59.5±0.5） μmol/L。不同濃度氧化苦參堿聯合 2 μmol/L salubrinal 處理 48 h 時的胃癌 BGC-823 細胞生長情況見圖 1c、1d，從圖中可見，與單藥比較，聯合用藥時的吸光度值升高、抑制率明顯降低，尤其是氧化苦參堿為 30、60 和 90 μmol/L 濃度時差異有統計學意義（P<0.05）。
圖1
示氧化苦參堿對胃癌 BGC-823 細胞生長、細胞周期及凋亡影響的結果
a、b：分別為不同濃度氧化苦參堿處理胃癌 BGC-823 細胞 24、48、72 h 時的吸光度值（a）和抑制率（b），與相應時間點對照組比較，*
2.2 氧化苦參堿對胃癌 BGC-823 細胞周期和凋亡的影響
① 與對照組比較，隨著氧化苦參堿濃度的增加，G2/M 期細胞數和細胞凋亡率呈增加（或增高）趨勢（P<0.05），G0/G1 期細胞數呈下降趨勢（P<0.05），S 期細胞數變化不明顯（P>0.05），見圖 1e。② 與對照組比較，處理 48 h 后，單藥組及聯合組的胃癌 BGC-823 細胞的 G0/G1 期和 S 期細胞數均明顯減少（P<0.05），G2/M 期細胞數增多（P<0.05），細胞凋亡率增高（P<0.05）；與單藥組比較，聯合組的胃癌 BGC-823 細胞 G0/G1 期和 S 期細胞增多（P<0.05），G2/M 期細胞數減少（P<0.05），細胞凋亡率降低（P<0.05），見圖 1f。
2.3 Western blot 和RT-PCR法檢測 GRP78/Bip 和 caspase-12 蛋白和基因表達結果
① 經不同濃度氧化苦參堿單獨處理 48 h 后各組胃癌 BGC-823 細胞中 GRP78/Bip 和 caspase-12 蛋白和基因表達結果見圖 2a–2c ，從圖中可見，與對照組比較，隨著氧化苦參堿藥物濃度的增加（除 10 μmol/L 氧化苦參堿組 caspase-12 蛋白和基因外），GRP78/Bip 和 caspase-12 蛋白和基因表達水平均呈升高趨勢且呈劑量依賴性（P<0.05）。② 經不同濃度氧化苦參堿聯合 2 μmol/L salubrinal 處理 48 h 后各組胃癌 BGC-823 細胞中 GRP78/Bip 和 caspase-12 蛋白和基因表達結果見圖 2d–2f，從圖中可見，與對照組比較，單獨 2 μmol/L salubrinal 處理組的 GRP78/Bip 和 caspase-12 蛋白和基因表達變化均不明顯（P>0.05），但隨著氧化苦參堿濃度的增加（除 60 μmol/L 氧化苦參堿聯合組中 GRP78/Bip 蛋白和基因外），聯合用藥各組細胞中 GRP78/Bip 和 caspase-12 蛋白和基因表達水平均呈升高趨勢且呈劑量依賴性（P<0.05）。③ 與相應濃度單藥比較，30、60 及 90 μmol/L 濃度氧化苦參堿聯合 2 μmol/L salubrinal 處理 48 h 后各組細胞中 GRP78/Bip 蛋白（除外 30 μmol/L 濃度氧化苦參堿聯合組）和 caspase-12 蛋白和基因表達均降低（P<0.05），見圖 2g–2j。
圖2
示?Western blot 和 RT-PCR 法檢測 GRP78/Bip和 caspase-12 蛋白和基因表達結果
a–c：分別為經不同濃度氧化苦參堿單藥處理48 h后各組胃癌 BGC-823 細胞中 GRP78/Bip 和 caspase-12 蛋白（a、b）和基因（c）表達結果，與對照組比較，*
3 討論
目前胃癌的治療措施主要有手術、化療、放療、免疫治療等，我們需要找到既有抗腫瘤活性且又低毒性的藥物，尤其是從天然產品中提取活性有效成分已成為一種趨勢[9]。氧化苦參堿是從傳統中藥苦參中提取的一種生物堿，具有多種藥理作用[10]。有研究[11]表明，氧化苦參堿可抑制胰酶活性、抗炎、抑菌、抗氧化、利尿、免疫調節、保護肝腎、松弛血管、促進胃腸蠕動、抑制血小板聚集、改善微循環等；另有研究[12]認為，氧化苦參堿可抑制多種腫瘤細胞增殖及誘導腫瘤細胞凋亡，可逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性，還可抑制腫瘤血管生成及腫瘤侵襲及轉移，而且還具有明顯的腫瘤化療增敏及減毒作用。盡管目前關于氧化苦參堿抗腫瘤作用的研究較多，然而其抗腫瘤的分子機制仍不完全清楚。
本研究對氧化苦參堿的抗腫瘤作用的分子機制進行了研究，研究目標是中藥誘導胃癌細胞凋亡的內質網應激途徑[13]。采用 MTT 法檢測細胞生長情況、流式細胞術檢測細胞周期改變、Annexin Ⅴ-PI 雙標染色法檢測細胞凋亡情況，同時聯用內質網應激抑制劑 salubrinal 調控氧化苦參堿誘導的胃癌細胞凋亡，以期為胃癌的治療和預后提供基礎資料；又從蛋白水平和基因水平分別檢測 GRP78 和 caspase-12 表達，以證明氧化苦參堿誘導腫瘤細胞凋亡的信號傳導通路并闡明氧化苦參堿對胃癌治療的作用機制，為其治療胃癌提供理論依據。本研究結果發現，氧化苦參堿對人胃癌 BGC-823 細胞具有明顯的生長抑制作用，該作用可能與 caspase-12 依賴性誘導凋亡及 GRP78/Bip 表達水平上調有關；而內質網應激抑制劑 salubrinal 聯合作用時能夠有效逆轉由氧化苦參堿引起的腫瘤細胞生長抑制、凋亡增加及 GRP78/Bip 和 caspase-12 蛋白及基因表達水平的升高，結果提示，氧化苦參堿對人胃癌 BGC-823 細胞生長抑制及凋亡誘導機制可能是其通過激活 caspase-12 依賴性內質網應激、上調 GRP78/Bip 表達水平，從而引起細胞周期阻滯，最終誘導細胞凋亡，但仍需進一步實驗驗證。
凋亡是細胞死亡的主要形式之一。目前已闡明的細胞凋亡途徑主要有線粒體途徑、死亡受體途徑和內質網應激途徑 3 個[14]。內質網應激是真核細胞內正常存在的一種應激機制，維持細胞的生存，而過度的內質網應激則可導致細胞凋亡。內質網應激介導的細胞凋亡有自身的信號傳導通路，能獨立誘導細胞凋亡。已有的研究[15]證明，氧化苦參堿可通過線粒體途徑介導多種細胞的凋亡，但氧化苦參堿是否可以通過內質網應激途徑誘導細胞凋亡還未見闡明。Hu 等[14]研究發現，在內質網應激凋亡通路中 caspase-12 激活介導的大鼠肝細胞凋亡的纖維化肝臟中 GRP78、GRP94、Procaspase-12、活性 caspase-12 蛋白表達仍保持在高水平。在本研究中發現，氧化苦參堿可抑制人胃癌細胞株 BGC-823 的生長且呈時間-濃度依賴性，與文獻[16]報道一致；還通過流式細胞儀探討了氧化苦參堿抑制胃癌 BGC-823 細胞增殖的機制[17]，結果發現，氧化苦參堿能誘導該細胞凋亡，發生 G2/M 期細胞阻滯。Western blot 和 RT-PCR 檢測結果顯示，內質網應激抑制劑 salubrinal 聯合作用時能夠有效逆轉由氧化苦參堿引起 GRP78/Bip 和 caspase-12 蛋白及基因表達水平的升高。因此我們推測，氧化苦參堿抑制胃癌 BGC-823 細胞增殖及誘導凋亡可能與 caspase-12 作用激活 GRP78 信號分子從而啟動凋亡程序有關，這也是在后期的實驗中需要進一步證實的。
從本研究初步研究的結果提示，氧化苦參堿具有抑制細胞增殖及凋亡的作用，其在開發和選擇胃癌化療藥物的過程中具有很大的潛力，這為從中藥成分中研制和開發新的有效化療藥物開拓了新思路。
