引用本文： 趙斌, 張覃, 李莊, 張本斯, 李艷嬌, 黃煜. 分泌 EphrinAl-Caspase-3 的 T 淋巴細胞抑制乳腺癌細胞生長的動物研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(3): 288-293. doi: 10.7507/1007-9424.201811027 復制
目前公認，人乳腺癌不是單一的疾病，而是在多種致癌因子作用下，發生基因突變，致使細胞增生失控的惡性腫瘤[1-7]。2016 年女性中最常見的癌癥是乳腺癌，預計在不久的將來，乳腺癌將約占女性所有新診斷癌癥的 29%[8]。由于早期診斷的進步和更有效的治療方法，乳腺癌成為慢性疾病而不是威脅生命的疾病。盡管乳腺癌的綜合治療取得長足的進步，但其發病率高、侵襲性強、極易復發和轉移。靶向治療是繼手術、放療及化療三大傳統治療手段之外的治療方法，已成為研究熱點。目前臨床上傳統的化學治療有選擇性差、毒副反應大、易耐藥等缺點，而靶向治療乳腺癌能最大限度地降低并發癥發生率，改善患者的生活質量，具有安全、可靠及高效的特點。本研究通過將分泌 EphrinAl-Caspase-3 的淋巴細胞作用于荷瘤動物，對其腫瘤生長情況以及 EphrinAl-Caspase-3 和 Ki-67 的表達情況進行研究，希望對以后乳腺癌的靶向治療及預后評估提供依據。
1 材料與方法
1.1 試驗動物
實驗用健康 6 周齡的 BALB/c 雌性裸鼠 35 只，由昆明醫科大學呈貢校區醫學實驗學部提供，動物使用許可證號：SCXK（滇）K2015-0002。所選實驗用裸鼠于實驗動物中心動物房中、在無特定病原體條件下飼養。
1.2 主要材料和試劑
主要材料：單層培養的 EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴細胞（前期實驗備置，實驗室保存）、未感染腺病毒的 T 淋巴細胞和酪氨酸激酶 EphrinA2 受體（EphA2）陽性乳腺腫瘤細胞 ［前期分離培養的人乳腺癌細胞 EphA2 鑒定為陽性，實驗室保存］。主要試劑：胰酶、PBS、RIPA 裂解液 ［含苯甲基磺酰氟（ PMSF）］、3, 3′, 5, 5′-四甲基聯苯胺（TMB）、OCT 包埋劑、生物素化抗體工作液和非免疫正常山羊血清（購于索萊寶公司）；雌二醇（98%，E808987，購于麥克林公司）、Matrige 膠（購于 Corning 公司）、Caspase-3 和 Ki-67 的一抗（購于 biopsydig 公司）及異硫氰酸熒光素（FITC）標記的二抗工作液（購于 ABnerve 公司）。
1.3 方法
1.3.1 裸鼠乳腺癌模型的建立
取對數生長期的單層培養的 EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴細胞以 0.25% 胰酶消化后，用 PBS 洗 2 次，細胞計數后制備成細胞懸液 100 μL（含 5×106 個細胞）。分離培養的人乳腺癌細胞，經EphA2 鑒定為陽性乳腺癌細胞后，取對數生長期細胞制作成細胞懸液（1×105 個/mL），計算活細胞數，再用生理鹽水稀釋至所需濃度（細胞數多為 1×106 個/mL ～1×107 個/mL）。將其與 Matrige 膠和雌激素混合，按每只雌性裸鼠 0.2 mL 注射（含 1×107 個細胞），緩慢注入裸鼠的左乳腺脂肪墊內。操作中要使細胞積聚成團，在皮下要形成皮丘。裸鼠于實驗動物中心動物房中、無特定病原體條件下飼養，同時觀察動物的神態、進食和活動狀態。
1.3.2 荷瘤動物的治療
乳腺癌細胞接種至裸鼠1 周后，可見腫瘤體積達到 0.1 cm3 左右大小，表示成瘤（接種了 35 只小鼠，其中 31 只成瘤，選擇腫瘤大小均一的 30 只）。將 30 只荷瘤鼠按隨機數字表隨機分為 3 個組，每組 10 只裸鼠：PBS 組、未感染腺病毒組（陰性對照組）以及感染 EphrinAl-Caspase-3 的 T 淋巴細胞組（感染組）。隨機分組完成后，將 T 淋巴細胞接種于 T75 細胞培養瓶中，以感染復數（MOI）為 800 的 pAd-EphrinAl-Caspase-3 病毒液感染 T 淋巴細胞（操作按試劑盒說明書進行），3 d 后收集細胞，即 EphrinAl-Caspase3-T 淋巴細胞。PBS 組裸鼠瘤內注射 PBS 溶液，陰性對照組裸鼠瘤內注射 1×106 個未感染腺病毒的 T 淋巴細胞，感染組裸鼠瘤內注射 1×106 個 EphrinAl-Caspase3-T 淋巴細胞，體積均是 10 μL。
1.3.3 荷瘤動物的腫瘤生長狀況觀察
3 組（n=5，隨機取其中 5 只）荷瘤裸鼠接受不同的 T 淋巴細胞（或 PBS 液）移植治療后，每隔 3 天用游標卡尺測量腫瘤的大小（0、3、6、9、12 及 15 d），腫瘤體積（cm3）=長（cm）×寬（cm）2/2。以各時間點的平均瘤體積繪制 3 組大鼠的生長曲線圖。實驗結束時荷瘤裸鼠斷頸處死。
1.3.4 腫瘤組織的病理學檢查
實驗結束后 3 組裸鼠被斷頸處死（用于生存曲線繪制的 5 只裸鼠），剝離腫瘤，將腫瘤組織于 4% 多聚甲醛中固定 48 h 后分別轉入 15% 和 30% 的蔗糖溶液中脫水，脫水完成后以 OCT 包埋（冰凍切片包埋），于–20 ℃ 恒溫箱中切片，在熒光顯微鏡下觀察表達綠色熒光蛋白的 T 淋巴細胞的存在。此外，將固定好的腫瘤組織常規切片，65 ℃ 烤片 2 h 后，二甲苯（Ⅰ）中脫蠟 10 min，再于二甲苯（Ⅱ）中脫蠟 10 min；100% 乙醇（Ⅰ）中 5 min 以洗去二甲苯，100% 乙醇（Ⅱ）中 5 min 洗去二甲苯；95% 乙醇中水化 5 min，85% 乙醇中水化 5 min，75% 乙醇中水化 5 min，蒸餾水中水化待用；使用 0.01 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復，將修復好的切片用 PBS 液清洗 2 次，每次各 5 min；然后滴加非免疫正常山羊血清 100 μL 進行封閉，室溫孵育 60 min；用移液槍吸去封閉液，然后分別滴加 Caspase-3 和 Ki-67 的一抗，4 ℃ 孵育過夜。PBS 液充分清洗 4 次，每次 5 min；滴加 FITC 標記的二抗工作液 100 μL，室溫孵育 15 min；PBS 液充分淋洗 4 次，各 5 min；在石蠟切片的中央滴加適量中性樹膠，蓋上蓋玻片封固后以熒光顯微鏡觀察。
1.3.5 腫瘤組織中 EphrinAl-Caspase-3 的含量檢測
3 組內剩余的 5 只裸鼠經上述的細胞移植后，分別在 3、6、9、12 及 15 d 獲取裸鼠皮下腫瘤組織勻漿，行 ELISA 檢測 EphrinAl-Caspase-3 的含量。首先將少量組織塊（100 mg）置于 2 mL 勻漿器中球狀部位，用剪刀將組織塊剪碎，加 400 μL 單去污劑裂解液裂（RIPA 裂解液）于勻漿器中進行勻漿。裂解 30 min 后，用移液器將裂解液移至 1.5 mL 離心管中，并在 4 ℃ 下 12 000 r/min 離心 5 min（r=10 cm），取上清進行檢測或是置于 –20 ℃ 保存。將標準品工作液依次加入到酶標板的前 2 列孔中，每個濃度的工作液并列加 2 孔，每孔 100 μL；待測樣品加入到其他孔，每孔 100 μL。給酶標板覆膜，37 ℃ 孵育 90 min。棄去液體，甩干，不用洗滌。每個孔中加入生物素化抗體工作液 100 μL，混勻；酶標板加上覆膜，37 ℃ 溫育 1 h。甩盡孔內液體，每孔加洗滌液 350 μL，浸泡 2 min，甩掉酶標板內的液體，厚吸水紙上拍干。重復此洗板步驟 3 次。每孔加酶結合物工作液 100 μL，加上覆膜，37 ℃ 溫育 30 min。棄去孔內液體，甩干，洗板 5 次。每孔加 90 μL 底物溶液（TMB），酶標板加上覆膜、37 ℃ 避光孵育 15 min。每孔加終止液 50 μL，終止反應。立即用酶標儀在 450 nm 波長測量各孔的光密度（A）值，根據樣品 A 值，計算樣品滴度。
1.4 統計學方法
本實驗數據的統計分析使用 SPSS 20.0 統計軟件進行。統計方法采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 方法。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 荷瘤鼠的腫瘤生長狀況
乳腺癌細胞接種裸鼠 1 周后可觸及皮下腫瘤，測得 3 組裸鼠不同時間點的腫瘤體積（圖 1a）。總體而言，PBS 組和陰性對照組裸鼠的腫瘤體積增長較快且兩組間的差異不大；而感染組裸鼠的腫瘤生長總體平穩、其增長速度低于 PBS 組和陰性對照。第 0 天和第 3 天時，3 組裸鼠的腫瘤體積比較差異均無統計學意義（P>0.05）；第6 天時 3 組的腫瘤體積差異變大，感染組和 PBS 組/陰性對照組比較差異均有統計學意義（P=0.002，P=0.036），隨后感染組和 PBS 組/陰性對照組的腫瘤體積差異進一步變大，且隨著時間的延長越來越明顯，但各時點 PBS 組和陰性對照組的腫瘤體積比較差異均無統計學意義（P>0.05）。實驗結束后剝離 3 組裸鼠的腫瘤，結果感染組的腫瘤體積與 PBS 組/陰性對照組相比明顯縮小（圖 1b–1d）。
圖1
示 3 組裸鼠腫瘤體積變化及大體外觀，以及示 3 組腫瘤組織中的 EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴細胞分布、Caspase-3 陽性細胞及 Ki-67 陽性細胞情況（免疫熒光染色 ×100）
a：3 組裸鼠腫瘤體積的變化趨勢，與其余2組比較，*
2.2 腫瘤組織的病理學檢查結果
在熒光顯微鏡下觀察到，感染組裸鼠的腫瘤組織中可見到散在的綠色熒光蛋白標記的 EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴細胞的存在，而在 PBS 組和陰性對照組裸鼠的腫瘤組織中則均沒有檢測到綠色熒光蛋白的存在（圖 1e–1g）。腫瘤組織的免疫熒光檢測結果顯示，感染組相對于陰性對照組或 PBS 組，其Caspase-3 陽性細胞比例較高（圖 1h–1j），Ki-67 陽性細胞比例較低（圖 1k–1m）。
2.3 腫瘤組織中 EphrinAl-Caspase-3 的滴度檢測
感染組裸鼠腫瘤組織中在第 3 天就可以檢測到 EphrinAl-Caspase-3 的表達，在第 6 天時達到高峰，隨后分泌量逐漸降低（圖 2）；PBS 組和陰性對照組裸鼠腫瘤組織中各時點均沒有檢測到 EphrinAl-Caspase-3 的表達。
圖2
不同時間點 EphrinAl-Caspase-3 在感染組腫瘤組織中的表達
3 討論
乳腺癌是危害婦女健康的最常見的惡性腫瘤之一。隨著乳腺癌的臨床管理顯著改善，近年來乳腺癌診斷率較前提高。盡管如此，乳腺癌仍是全球女性擔心的重點問題[9]。雖然乳腺癌是大多數女性最害怕的疾病，但它并不是女性死亡的主要原因。乳腺癌患者的存活率在過去的 20 年中急劇提升，這主要是由于乳腺攝影篩查技術的早期檢測、患者意識的提高以及更有效的治療方式所致[10]。
雖然目前新舊多種抗腫瘤藥物的開發及應用顯著提高了乳腺癌的生存率，但是使用化學治療劑有可能引起心血管并發癥，其中以心臟衰竭（CHF）、心肌缺血及高血壓較為常見[11-15]。多項研究[16-19]表明，當曲妥珠單抗納入治療方案時，人類表皮生長因子-2（HER-2）陽性患者的死亡率降低，總生存（OS）率增加；曲妥珠單抗的最嚴重的并發癥是其潛在心臟毒性，然而其心臟毒性的確切機制仍不清楚。因此，研究開發對乳腺癌抗癌活性強、低甚至無毒副作用的新制劑是大勢所趨。
人 Caspase-3 基因位于 4q33-q35.1 上，具有2 635 個堿基對，7 個外顯子。它選擇性剪接產生2 種轉錄物，即 Caspase-3 和 Caspase-3s，其中 Caspase-3 是 Caspase 家族中最重要的凋亡執行者之一，它可激活脫氧核糖核酸酶（CAD），繼而引起細胞核濃縮及 DNA 裂解，使細胞發生凋亡。在許多腫瘤細胞的凋亡中發現有 Caspase 的活化。目前也已經采用一系列新的與 Caspase 有關的誘導凋亡的方法來治療腫瘤。酪氨酸激酶蛋白家族與許多類型癌癥相關聯，包括前列腺癌、肺癌、食管癌、黑色素瘤、白血病、結直腸癌、宮頸癌、卵巢癌和乳腺癌[20-21]。此外，在乳腺癌中跨膜 Eph 受體 EphA2 的亞類呈過表達[22]。本實驗的目標是通過與 EphrinAl（一種 EphA2 受體的天然配體）偶聯的 Caspase-3，誘導癌變細胞再次進入細胞凋亡途徑，以抑制增殖，達到靶向治療的目的。在本實驗中筆者觀察到，第 6 天時感染組的腫瘤體積與 PBS 組/陰性對照組的差異存在統計學意義（P<0.05），隨后測得的腫瘤體積差異進一步變大，且隨著時間的延長越來越明顯；之后剝離 3 組裸鼠的腫瘤發現，感染組與 PBS 組/陰性對照組比較其腫瘤體積明顯縮小。該結果表明，EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴細胞移植對裸鼠乳腺癌的荷瘤生長具有明顯的抑制作用，提示其有著較好的抑瘤作用，但腫瘤并沒有完全消失。
EphrinAl-Caspase-3 體系的相關性研究主要是探討其對乳腺癌荷瘤裸鼠模型的體內抑制作用。本實驗通過 ELSIA 法檢測發現：感染組在第 3 天就可以檢測出 EphrinAl-Caspase-3 的表達，第 6 天時達到高峰，隨后分泌量逐漸降低，另外 2 組未檢測到 EphrinAl-Caspase-3 的表達；腫瘤冰凍切片熒光結果顯示，感染組的腫瘤組織中可見散在的綠色熒光蛋白標記的 EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴細胞的存在，其余 2 組未見。該結果表明，EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴細胞在乳腺癌腫瘤組織中具有良好的分泌 EphrinAl-Caspase-3 的效果。
Nakopoulou 等[23]報道，約有 75.2%（137 例中有 103 例）的乳腺浸潤性腫瘤樣本存在 Caspase-3 蛋白的高表達。目前的研究[24]結果表明，高 Caspase-3 表達與乳腺癌患者的乳腺癌特異性生存率相關。Ki-67 水平被認為是乳腺癌患者中有價值的生物標志物，可以用于治療以及隨訪監測[25]。Ki-67 是與細胞周期相關的核抗原，通常用于測量細胞增殖率，可用于評估乳腺癌的增殖活性，是乳腺癌患者復發和生存的預后生物標志物。本實驗對 3 組腫瘤組織中 Caspase-3 和 Ki-67 抗體的表達進行了免疫熒光檢測，結果發現，感染組中 Caspase-3 陽性細胞比例上升，Ki-67 陽性細胞比例下降。該實驗結果提示，誘導腫瘤細胞凋亡可能是 EphrinAl-Caspase-3 抗腫瘤的重要機制之一，表明 EphrinAl-Caspase-3 可能通過誘導細胞凋亡來抑制腫瘤的生長。這為低甚至無毒副作用新制劑的研究提供了一定的研究基礎。
綜上所述，筆者推測，EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴細胞移植可以有效地抑制乳腺癌荷瘤動物體內腫瘤的生長。隨著實驗研究的不斷深入，相信 EphrinAl-Caspase-3 抑瘤的機制將會進一步明確，本實驗結果希望能為乳腺癌的治療提供新方向，但由于本實驗的樣本量、地域、設備等因素的原因，EphrinAl-Caspase-3 抑制乳腺腫瘤生長的確切機制還有待進一步考證。
目前公認，人乳腺癌不是單一的疾病，而是在多種致癌因子作用下，發生基因突變，致使細胞增生失控的惡性腫瘤[1-7]。2016 年女性中最常見的癌癥是乳腺癌，預計在不久的將來，乳腺癌將約占女性所有新診斷癌癥的 29%[8]。由于早期診斷的進步和更有效的治療方法，乳腺癌成為慢性疾病而不是威脅生命的疾病。盡管乳腺癌的綜合治療取得長足的進步，但其發病率高、侵襲性強、極易復發和轉移。靶向治療是繼手術、放療及化療三大傳統治療手段之外的治療方法，已成為研究熱點。目前臨床上傳統的化學治療有選擇性差、毒副反應大、易耐藥等缺點，而靶向治療乳腺癌能最大限度地降低并發癥發生率，改善患者的生活質量，具有安全、可靠及高效的特點。本研究通過將分泌 EphrinAl-Caspase-3 的淋巴細胞作用于荷瘤動物，對其腫瘤生長情況以及 EphrinAl-Caspase-3 和 Ki-67 的表達情況進行研究，希望對以后乳腺癌的靶向治療及預后評估提供依據。
1 材料與方法
1.1 試驗動物
實驗用健康 6 周齡的 BALB/c 雌性裸鼠 35 只，由昆明醫科大學呈貢校區醫學實驗學部提供，動物使用許可證號：SCXK（滇）K2015-0002。所選實驗用裸鼠于實驗動物中心動物房中、在無特定病原體條件下飼養。
1.2 主要材料和試劑
主要材料：單層培養的 EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴細胞（前期實驗備置，實驗室保存）、未感染腺病毒的 T 淋巴細胞和酪氨酸激酶 EphrinA2 受體（EphA2）陽性乳腺腫瘤細胞 ［前期分離培養的人乳腺癌細胞 EphA2 鑒定為陽性，實驗室保存］。主要試劑：胰酶、PBS、RIPA 裂解液 ［含苯甲基磺酰氟（ PMSF）］、3, 3′, 5, 5′-四甲基聯苯胺（TMB）、OCT 包埋劑、生物素化抗體工作液和非免疫正常山羊血清（購于索萊寶公司）；雌二醇（98%，E808987，購于麥克林公司）、Matrige 膠（購于 Corning 公司）、Caspase-3 和 Ki-67 的一抗（購于 biopsydig 公司）及異硫氰酸熒光素（FITC）標記的二抗工作液（購于 ABnerve 公司）。
1.3 方法
1.3.1 裸鼠乳腺癌模型的建立
取對數生長期的單層培養的 EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴細胞以 0.25% 胰酶消化后，用 PBS 洗 2 次，細胞計數后制備成細胞懸液 100 μL（含 5×106 個細胞）。分離培養的人乳腺癌細胞，經EphA2 鑒定為陽性乳腺癌細胞后，取對數生長期細胞制作成細胞懸液（1×105 個/mL），計算活細胞數，再用生理鹽水稀釋至所需濃度（細胞數多為 1×106 個/mL ～1×107 個/mL）。將其與 Matrige 膠和雌激素混合，按每只雌性裸鼠 0.2 mL 注射（含 1×107 個細胞），緩慢注入裸鼠的左乳腺脂肪墊內。操作中要使細胞積聚成團，在皮下要形成皮丘。裸鼠于實驗動物中心動物房中、無特定病原體條件下飼養，同時觀察動物的神態、進食和活動狀態。
1.3.2 荷瘤動物的治療
乳腺癌細胞接種至裸鼠1 周后，可見腫瘤體積達到 0.1 cm3 左右大小，表示成瘤（接種了 35 只小鼠，其中 31 只成瘤，選擇腫瘤大小均一的 30 只）。將 30 只荷瘤鼠按隨機數字表隨機分為 3 個組，每組 10 只裸鼠：PBS 組、未感染腺病毒組（陰性對照組）以及感染 EphrinAl-Caspase-3 的 T 淋巴細胞組（感染組）。隨機分組完成后，將 T 淋巴細胞接種于 T75 細胞培養瓶中，以感染復數（MOI）為 800 的 pAd-EphrinAl-Caspase-3 病毒液感染 T 淋巴細胞（操作按試劑盒說明書進行），3 d 后收集細胞，即 EphrinAl-Caspase3-T 淋巴細胞。PBS 組裸鼠瘤內注射 PBS 溶液，陰性對照組裸鼠瘤內注射 1×106 個未感染腺病毒的 T 淋巴細胞，感染組裸鼠瘤內注射 1×106 個 EphrinAl-Caspase3-T 淋巴細胞，體積均是 10 μL。
1.3.3 荷瘤動物的腫瘤生長狀況觀察
3 組（n=5，隨機取其中 5 只）荷瘤裸鼠接受不同的 T 淋巴細胞（或 PBS 液）移植治療后，每隔 3 天用游標卡尺測量腫瘤的大小（0、3、6、9、12 及 15 d），腫瘤體積（cm3）=長（cm）×寬（cm）2/2。以各時間點的平均瘤體積繪制 3 組大鼠的生長曲線圖。實驗結束時荷瘤裸鼠斷頸處死。
1.3.4 腫瘤組織的病理學檢查
實驗結束后 3 組裸鼠被斷頸處死（用于生存曲線繪制的 5 只裸鼠），剝離腫瘤，將腫瘤組織于 4% 多聚甲醛中固定 48 h 后分別轉入 15% 和 30% 的蔗糖溶液中脫水，脫水完成后以 OCT 包埋（冰凍切片包埋），于–20 ℃ 恒溫箱中切片，在熒光顯微鏡下觀察表達綠色熒光蛋白的 T 淋巴細胞的存在。此外，將固定好的腫瘤組織常規切片，65 ℃ 烤片 2 h 后，二甲苯（Ⅰ）中脫蠟 10 min，再于二甲苯（Ⅱ）中脫蠟 10 min；100% 乙醇（Ⅰ）中 5 min 以洗去二甲苯，100% 乙醇（Ⅱ）中 5 min 洗去二甲苯；95% 乙醇中水化 5 min，85% 乙醇中水化 5 min，75% 乙醇中水化 5 min，蒸餾水中水化待用；使用 0.01 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復，將修復好的切片用 PBS 液清洗 2 次，每次各 5 min；然后滴加非免疫正常山羊血清 100 μL 進行封閉，室溫孵育 60 min；用移液槍吸去封閉液，然后分別滴加 Caspase-3 和 Ki-67 的一抗，4 ℃ 孵育過夜。PBS 液充分清洗 4 次，每次 5 min；滴加 FITC 標記的二抗工作液 100 μL，室溫孵育 15 min；PBS 液充分淋洗 4 次，各 5 min；在石蠟切片的中央滴加適量中性樹膠，蓋上蓋玻片封固后以熒光顯微鏡觀察。
1.3.5 腫瘤組織中 EphrinAl-Caspase-3 的含量檢測
3 組內剩余的 5 只裸鼠經上述的細胞移植后，分別在 3、6、9、12 及 15 d 獲取裸鼠皮下腫瘤組織勻漿，行 ELISA 檢測 EphrinAl-Caspase-3 的含量。首先將少量組織塊（100 mg）置于 2 mL 勻漿器中球狀部位，用剪刀將組織塊剪碎，加 400 μL 單去污劑裂解液裂（RIPA 裂解液）于勻漿器中進行勻漿。裂解 30 min 后，用移液器將裂解液移至 1.5 mL 離心管中，并在 4 ℃ 下 12 000 r/min 離心 5 min（r=10 cm），取上清進行檢測或是置于 –20 ℃ 保存。將標準品工作液依次加入到酶標板的前 2 列孔中，每個濃度的工作液并列加 2 孔，每孔 100 μL；待測樣品加入到其他孔，每孔 100 μL。給酶標板覆膜，37 ℃ 孵育 90 min。棄去液體，甩干，不用洗滌。每個孔中加入生物素化抗體工作液 100 μL，混勻；酶標板加上覆膜，37 ℃ 溫育 1 h。甩盡孔內液體，每孔加洗滌液 350 μL，浸泡 2 min，甩掉酶標板內的液體，厚吸水紙上拍干。重復此洗板步驟 3 次。每孔加酶結合物工作液 100 μL，加上覆膜，37 ℃ 溫育 30 min。棄去孔內液體，甩干，洗板 5 次。每孔加 90 μL 底物溶液（TMB），酶標板加上覆膜、37 ℃ 避光孵育 15 min。每孔加終止液 50 μL，終止反應。立即用酶標儀在 450 nm 波長測量各孔的光密度（A）值，根據樣品 A 值，計算樣品滴度。
1.4 統計學方法
本實驗數據的統計分析使用 SPSS 20.0 統計軟件進行。統計方法采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 方法。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 荷瘤鼠的腫瘤生長狀況
乳腺癌細胞接種裸鼠 1 周后可觸及皮下腫瘤，測得 3 組裸鼠不同時間點的腫瘤體積（圖 1a）。總體而言，PBS 組和陰性對照組裸鼠的腫瘤體積增長較快且兩組間的差異不大；而感染組裸鼠的腫瘤生長總體平穩、其增長速度低于 PBS 組和陰性對照。第 0 天和第 3 天時，3 組裸鼠的腫瘤體積比較差異均無統計學意義（P>0.05）；第6 天時 3 組的腫瘤體積差異變大，感染組和 PBS 組/陰性對照組比較差異均有統計學意義（P=0.002，P=0.036），隨后感染組和 PBS 組/陰性對照組的腫瘤體積差異進一步變大，且隨著時間的延長越來越明顯，但各時點 PBS 組和陰性對照組的腫瘤體積比較差異均無統計學意義（P>0.05）。實驗結束后剝離 3 組裸鼠的腫瘤，結果感染組的腫瘤體積與 PBS 組/陰性對照組相比明顯縮小（圖 1b–1d）。
圖1
示 3 組裸鼠腫瘤體積變化及大體外觀，以及示 3 組腫瘤組織中的 EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴細胞分布、Caspase-3 陽性細胞及 Ki-67 陽性細胞情況（免疫熒光染色 ×100）
a：3 組裸鼠腫瘤體積的變化趨勢，與其余2組比較，*
2.2 腫瘤組織的病理學檢查結果
在熒光顯微鏡下觀察到，感染組裸鼠的腫瘤組織中可見到散在的綠色熒光蛋白標記的 EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴細胞的存在，而在 PBS 組和陰性對照組裸鼠的腫瘤組織中則均沒有檢測到綠色熒光蛋白的存在（圖 1e–1g）。腫瘤組織的免疫熒光檢測結果顯示，感染組相對于陰性對照組或 PBS 組，其Caspase-3 陽性細胞比例較高（圖 1h–1j），Ki-67 陽性細胞比例較低（圖 1k–1m）。
2.3 腫瘤組織中 EphrinAl-Caspase-3 的滴度檢測
感染組裸鼠腫瘤組織中在第 3 天就可以檢測到 EphrinAl-Caspase-3 的表達，在第 6 天時達到高峰，隨后分泌量逐漸降低（圖 2）；PBS 組和陰性對照組裸鼠腫瘤組織中各時點均沒有檢測到 EphrinAl-Caspase-3 的表達。
圖2
不同時間點 EphrinAl-Caspase-3 在感染組腫瘤組織中的表達
3 討論
乳腺癌是危害婦女健康的最常見的惡性腫瘤之一。隨著乳腺癌的臨床管理顯著改善，近年來乳腺癌診斷率較前提高。盡管如此，乳腺癌仍是全球女性擔心的重點問題[9]。雖然乳腺癌是大多數女性最害怕的疾病，但它并不是女性死亡的主要原因。乳腺癌患者的存活率在過去的 20 年中急劇提升，這主要是由于乳腺攝影篩查技術的早期檢測、患者意識的提高以及更有效的治療方式所致[10]。
雖然目前新舊多種抗腫瘤藥物的開發及應用顯著提高了乳腺癌的生存率，但是使用化學治療劑有可能引起心血管并發癥，其中以心臟衰竭（CHF）、心肌缺血及高血壓較為常見[11-15]。多項研究[16-19]表明，當曲妥珠單抗納入治療方案時，人類表皮生長因子-2（HER-2）陽性患者的死亡率降低，總生存（OS）率增加；曲妥珠單抗的最嚴重的并發癥是其潛在心臟毒性，然而其心臟毒性的確切機制仍不清楚。因此，研究開發對乳腺癌抗癌活性強、低甚至無毒副作用的新制劑是大勢所趨。
人 Caspase-3 基因位于 4q33-q35.1 上，具有2 635 個堿基對，7 個外顯子。它選擇性剪接產生2 種轉錄物，即 Caspase-3 和 Caspase-3s，其中 Caspase-3 是 Caspase 家族中最重要的凋亡執行者之一，它可激活脫氧核糖核酸酶（CAD），繼而引起細胞核濃縮及 DNA 裂解，使細胞發生凋亡。在許多腫瘤細胞的凋亡中發現有 Caspase 的活化。目前也已經采用一系列新的與 Caspase 有關的誘導凋亡的方法來治療腫瘤。酪氨酸激酶蛋白家族與許多類型癌癥相關聯，包括前列腺癌、肺癌、食管癌、黑色素瘤、白血病、結直腸癌、宮頸癌、卵巢癌和乳腺癌[20-21]。此外，在乳腺癌中跨膜 Eph 受體 EphA2 的亞類呈過表達[22]。本實驗的目標是通過與 EphrinAl（一種 EphA2 受體的天然配體）偶聯的 Caspase-3，誘導癌變細胞再次進入細胞凋亡途徑，以抑制增殖，達到靶向治療的目的。在本實驗中筆者觀察到，第 6 天時感染組的腫瘤體積與 PBS 組/陰性對照組的差異存在統計學意義（P<0.05），隨后測得的腫瘤體積差異進一步變大，且隨著時間的延長越來越明顯；之后剝離 3 組裸鼠的腫瘤發現，感染組與 PBS 組/陰性對照組比較其腫瘤體積明顯縮小。該結果表明，EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴細胞移植對裸鼠乳腺癌的荷瘤生長具有明顯的抑制作用，提示其有著較好的抑瘤作用，但腫瘤并沒有完全消失。
EphrinAl-Caspase-3 體系的相關性研究主要是探討其對乳腺癌荷瘤裸鼠模型的體內抑制作用。本實驗通過 ELSIA 法檢測發現：感染組在第 3 天就可以檢測出 EphrinAl-Caspase-3 的表達，第 6 天時達到高峰，隨后分泌量逐漸降低，另外 2 組未檢測到 EphrinAl-Caspase-3 的表達；腫瘤冰凍切片熒光結果顯示，感染組的腫瘤組織中可見散在的綠色熒光蛋白標記的 EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴細胞的存在，其余 2 組未見。該結果表明，EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴細胞在乳腺癌腫瘤組織中具有良好的分泌 EphrinAl-Caspase-3 的效果。
Nakopoulou 等[23]報道，約有 75.2%（137 例中有 103 例）的乳腺浸潤性腫瘤樣本存在 Caspase-3 蛋白的高表達。目前的研究[24]結果表明，高 Caspase-3 表達與乳腺癌患者的乳腺癌特異性生存率相關。Ki-67 水平被認為是乳腺癌患者中有價值的生物標志物，可以用于治療以及隨訪監測[25]。Ki-67 是與細胞周期相關的核抗原，通常用于測量細胞增殖率，可用于評估乳腺癌的增殖活性，是乳腺癌患者復發和生存的預后生物標志物。本實驗對 3 組腫瘤組織中 Caspase-3 和 Ki-67 抗體的表達進行了免疫熒光檢測，結果發現，感染組中 Caspase-3 陽性細胞比例上升，Ki-67 陽性細胞比例下降。該實驗結果提示，誘導腫瘤細胞凋亡可能是 EphrinAl-Caspase-3 抗腫瘤的重要機制之一，表明 EphrinAl-Caspase-3 可能通過誘導細胞凋亡來抑制腫瘤的生長。這為低甚至無毒副作用新制劑的研究提供了一定的研究基礎。
綜上所述，筆者推測，EphrinAl-Caspase-3-T 淋巴細胞移植可以有效地抑制乳腺癌荷瘤動物體內腫瘤的生長。隨著實驗研究的不斷深入，相信 EphrinAl-Caspase-3 抑瘤的機制將會進一步明確，本實驗結果希望能為乳腺癌的治療提供新方向，但由于本實驗的樣本量、地域、設備等因素的原因，EphrinAl-Caspase-3 抑制乳腺腫瘤生長的確切機制還有待進一步考證。
