引用本文： 王建, 安華松, 宋正霞, 何躍君, 郭貞. 曲妥珠單抗對 SW-620 人結腸癌細胞增殖凋亡的影響及其與奧沙利鉑協同作用的研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(12): 1433-1438. doi: 10.7507/1007-9424.201808044 復制
結腸癌是一種發病率為 9.7% 的異質性疾病，為世界第 3 大常見腫瘤，患者死亡率排名第 4[1]。預計從 2012 年至 2035 年，每年新發的結腸癌患者數量可從 140 萬增至 240 萬，有 90%～95% 的結腸癌患者是由基因突變演變所導致的[2]。除了手術治療，大多數結腸癌患者采用放療和化療治療，然而效果欠佳。截止目前（2018 年），在與腫瘤發生有關的多種生物標志物中，許多研究顯示這些生物標志物與預后相關，說明這些腫瘤標志物在促進腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用[3]。由于基因突變、基因擴增或蛋白過表達等原因，人表皮生長因子受體（her）家族可表達在一些特定的腫瘤組織中，如結腸癌。her 家族成員包括 her-1、her-2、her-3 及 her-4。her 可通過促進酪氨酸激酶受體介導的信號通路，從而發揮促進細胞增殖的作用[4-5]。許多研究證實，her-2 蛋白過表達促進了腫瘤的發生發展過程[6-9]。針對 her-2 基因的靶向藥物曲妥珠單抗（herceptin）已經廣泛應用于乳腺癌和胃癌的治療，但對于結腸癌的治療效果尚未明確。本實驗將曲妥珠單抗應用于 SW-620 細胞，觀察其對細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響，并探討了曲妥珠單抗聯合奧沙利鉑（oxaliplatin）的協同作用情況，以明確其作為手術、化療和放療的輔助治療的應用前景。
1 材料和方法
1.1 實驗材料、主要試劑及設備
人結腸癌細胞株 SW-620 購自上海細胞生物研究所細胞庫；DMEM 培養基和胎牛血清均購自美國 Hyclone 公司；細胞計數試劑盒（CCK-8 試劑盒）購自日本同仁化學研究所；流式凋亡檢測試劑盒和膜聯蛋白-V/碘化丙啶（Annexin-V/PI）購自杭州聯科生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自北京寶杰羅生物科技有限公司；曲妥珠單抗購自羅氏制藥公司；奧沙利鉑購自江蘇奧賽康藥業有限公司。流式細胞儀（型號 BD FACS Calibur）系美國 BD 公司產品。
1.2 細胞培養
人結腸癌細胞株 SW-620 使用含 10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培養基，在 37 ℃ 和 5% CO2 條件下常規培養。
1.3 CCK-8 法檢測細胞增殖
取對數生長期的 SW-620 細胞制成單細胞懸液并計數細胞密度。之后細胞的分組分為 2 個板塊。① 將細胞分為 8 個濃度小組（每個小組設 5 個復孔），曲妥珠單抗的濃度依次為 0、0.001、0.01、0.1、1、10、100 及 1 000 μg/mL。② 將細胞分為 2 個大組：曲妥珠單抗組和曲妥珠單抗+奧沙利鉑組，每個大組內設 6 個濃度小組（每個小組設 5 個復孔），曲妥珠單抗的濃度依次為 0、0.001、0.01、0.1、1 及 10 μg/mL，對應的曲妥珠單抗+奧沙利鉑組的曲妥珠單抗的濃度與前相同，不同之處在于均加入了奧沙利鉑（10 μmol/L）。在 96 孔板中每孔加入 200 μL 細胞懸液（5 000 個細胞），分別加入上述濃度的曲妥珠單抗及奧沙利鉑。同時設置培養液對照孔以用于整塊培養板的調零。在細胞培養箱內孵育 48 h 后，每孔加入 CCK-8 溶液 20 μL，在細胞培養箱內繼續孵育 4 h。在 450 nm 處測定吸光度（A）值，根據 A 值比較各組細胞的增殖能力。
1.4 流式細胞術檢測細胞的凋亡
取對數生長期的 SW-620 細胞制成單細胞懸液并計數，操作同上。組別設置同上，由于實驗經費與時間有限，曲妥珠單抗的濃度僅取 0、0.1、1 及 10 μg/mL。于 24 孔板中每孔加入 1×105個細胞，給予相應的處理，在細胞培養箱內孵育 48 h 后，使用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化收集貼壁細胞，以 1 200 r/min 的轉速離心 5 min 收集細胞（r=6 cm）。使用流式凋亡檢測試劑盒進行避光染色，在 1 h 內上流式細胞儀進行檢測。結果判斷：活細胞，Annexin-V（–）/PI（–）；早期凋亡細胞，Annexin-V（+）/PI（–）；晚期凋亡細胞，Annexin-V（+）/PI（+）。細胞總凋亡率=早期凋亡細胞率+晚期凋亡細胞率[10-11]。
1.5 流式細胞術檢測細胞周期
細胞處理及分組同 1.4，即 0、0.1、1 以及10 μg/mL。各組細胞在細胞培養箱內孵育 48 h 后，收集細胞，加入–20 ℃ 預冷的 75% 乙醇中，4 ℃ 固定過夜；用 PBS 緩沖液洗滌細胞 2 次；加入 100 μL PBS 液重懸細胞，再加入 0.5% PI 5 μL，4 ℃ 避光孵育 15 min；使用流式細胞儀進行細胞周期檢測。
1.6 Western blot 法檢測各組 SW-620 細胞中 her-2蛋白的表達
根據前述研究結果，分別以 0、100 及 1 000 μg/ml 曲妥珠單抗，以及 0、1 及 10 μg/mL 曲妥珠單抗聯合奧沙利鉑（10 μmol/L）處理 SW-620 細胞后，按照蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白，一抗加入 her-2 抗體，4 ℃ 孵育過夜。洗膜 3 次，每次 5 min，然后跟辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG（二抗）室溫孵育 2 h，洗膜 3 次，每次 5 min；最后在暗室中顯影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參對照。利用 Image J 軟件進行灰度分析：her-2 蛋白的相對表達水平以目的蛋白與對應的內參蛋白的灰度值的比值表示。
1.7 統計學方法
采用 SPSS 16.0 軟件進行統計分析，計量資料采用 Shapiro-Wilk 檢驗行正態分布檢驗，符合正態分布者以均數±標準差（
±s）表示，否則以中位數表示。采用 Levene 檢驗行方差齊性檢驗。多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用 LSD-t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 曲妥珠單抗對 SW-620 細胞增殖的影響
CCK-8 細胞增殖實驗結果（圖 1）表明，曲妥珠單抗對 SW-620 細胞的增殖具有抑制作用，但是低濃度時作用較微弱，只有在高濃度（100 μg/mL 和 1 000 μg/mL）時才具有顯著的抑制作用，即 100 μg/mL 和 1 000 μg/mL 濃度下的 A 值與 0 μg/mL 比較，差異有統計學意義（P<0.05），見圖 1a。曲妥珠單抗聯合奧沙利鉑對 SW-620 細胞的抑制作用明顯增強，同種曲妥珠單抗濃度下曲妥珠單抗+奧沙利鉑組的 A 值均低于曲妥珠單抗組（P<0.05），且在曲妥珠單抗+奧沙利鉑組中，隨著曲妥珠單抗濃度的增加，A 值在逐漸降低，具有劑量依賴性（圖 1b），表明曲妥珠單抗和奧沙利鉑協同抑制細胞的增殖。
圖1
示不同濃度曲妥珠單抗單獨或者聯合奧沙利鉑組的SW-620 細胞的 A 值
a：示不同濃度曲妥珠單抗組細胞的
2.2 曲妥珠單抗對 SW-620 細胞凋亡的影響
細胞凋亡實驗結果表明，同種曲妥珠單抗濃度下，曲妥珠單抗組+奧沙利鉑組的細胞凋亡率均較曲妥珠單抗組高（P<0.05）。在曲妥珠單抗組中，總體而言隨曲妥珠單抗濃度增加，細胞凋亡率增加，但僅在 10 μg/mL 時，細胞凋亡率與 0 μg/mL 比較差異才有統計學意義（P<0.05）；在曲妥珠單抗+奧沙利鉑組中，總體而言隨曲妥珠單抗濃度增加，細胞凋亡率也逐漸增加，在 1 μg/mL 和 10 μg/mL 時，細胞凋亡率與 0 μg/mL 比較差異均有統計學意義（P<0.05）。該結果提示，曲妥珠單抗對 SW-620 細胞的凋亡具有促進作用；曲妥珠單抗和奧沙利鉑具有協同抗凋亡的作用，且呈劑量依賴性，見圖 2。
圖2
示不同濃度曲妥珠單抗單獨或者聯合奧沙利鉑組 SW-620 細胞的凋亡率
a：示不同濃度曲妥珠單抗單獨或者聯合奧沙利鉑組 SW-620 細胞凋亡的流式細胞儀檢測結果；b：不同濃度曲妥珠單抗單獨或者聯合奧沙利鉑組的細胞凋亡率結果，*和#表示
2.3 曲妥珠單抗對 SW-620 細胞周期的影響
細胞周期實驗表明，不同濃度的曲妥珠單抗處理 SW-620 細胞后，4 種濃度組細胞的 G1、S 及 G2 期細胞比例比較差異均無統計學意義（P>0.05）；但是不同濃度的曲妥珠單抗+奧沙利鉑處理后，隨曲妥珠單抗濃度的增加，G1 期細胞比例呈下降趨勢，S 期細胞比例呈上升趨勢，且呈劑量依賴性，1 μg/mL 和 10 μg/mL 時的 G1 期細胞比例和 S 期細胞比例與 0 μg/mL 比較，差異均有統計學意義（P<0.05），前者（1 μg/mL 和 10 μg/mL）的 G1 期細胞比例較低，而 S 期細胞比例較高（圖 3a–3c）。在 1 μg/mL 和 10 μg/mL 曲妥珠單抗條件下，曲妥珠單抗聯合奧沙利鉑組的 G1 期細胞比例較曲妥珠單抗單藥組低，而 S 期細胞比例較高（P<0.05）；在 0.1、1 和 10 μg/mL 濃度的曲妥珠單抗條件下，曲妥珠單抗聯合奧沙利鉑組的 G2 期細胞比例較曲妥珠單抗單藥組降低（P<0.01）。具體見圖 3d–3f。該結果表明，曲妥珠單抗和奧沙利鉑具有協同抑制細胞周期的作用。
圖3
示不同濃度曲妥珠單抗單獨或聯合奧沙利鉑對 SW-620 細胞周期和 her-2 蛋白表達的影響
a：不同濃度曲妥珠單抗單獨或聯合奧沙利鉑組細胞周期的流式細胞儀檢測結果；b 和 c：不同濃度曲妥珠單抗組（b）和不同濃度曲妥珠單抗+奧沙利鉑組（c）的細胞周期結果；d–f：不同濃度曲妥珠單抗組和不同濃度曲妥珠單抗+奧沙利鉑組的 G1 期（d）、S 期（e）和 G2 期（f）細胞占比比較；g：her-2 蛋白表達的電泳圖；h：不用濃度曲妥珠單抗組 SW-620 細胞中 her-2 蛋白的相對表達水平；i：不同濃度曲妥珠單抗聯合奧沙利鉑組 SW-620 細胞中 her-2 蛋白的相對表達水平；*表示
2.4 Western blot 檢測 SW-620 細胞中 her-2 蛋白的表達
Western blot 結果顯示，1、100 及 1 000 μg/mL 曲妥珠單抗組細胞中 her-2 蛋白的表達水平逐漸降低，3 組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）；0、1 及 10 μg/mL 曲妥珠單抗+奧沙利鉑組中 her-2 蛋白的表達水平也逐漸降低，3 組間兩兩比較差異也有統計學意義（P<0.05）。具體見圖 3g–3i。
3 討論
生物治療是現今腫瘤腫瘤的一個熱門研究方向。隨著生物學研究的深入發展，人們發現，編碼生長因子及其受體的原癌基因在一些人類惡性腫瘤的發生和發展中起著重要作用[12-13]，抑制這些生長因子及其受體的功能是目前腫瘤綜合治療的一個新策略。有研究[14]發現，her-2/neu 基因在許多惡性腫瘤中出現不同程度的表達，尤其是上皮源性的腫瘤，如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、結直腸癌等[15]。梁霞等[16]以聚合酶鏈反應片段長度來研究her-2/neu 基因多態性在密碼子 655 上的分布及其與中國人結腸癌易感性的關系，2 種基因型（亮氨酸/纈氨酸基因型和纈氨酸/纈氨酸）的頻率（25.34%）和纈氨酸等位基因頻率（13.36%）的增高均與直腸癌的發生有關。近年來，有關 her-2 蛋白的過度表達與結腸癌生物學行為關系的研究日益增多，雖未達成統一的意見，但普遍認為，有 10%～47% 的結腸癌存在 her-2 蛋白的過表達[2, 17]。有研究[18]表明，her-2 蛋白的表達水平不僅與 Dukes 分期和生存期有關，還與腫瘤的分化程度及是否有淋巴結轉移有關，可以作為結腸癌獨立的預后因素。曲妥珠單抗就是針對 her-2 蛋白設計的人源化鼠嵌合型抗體，是一種新型、高效、低毒及選擇性強的靶向治療藥物，1988 年被美國 FDA 批準上市，已通過Ⅲ期臨床試驗，取得了令人鼓舞的療效[19]。單用曲妥珠單抗或者與多種化療藥物如順鉑、奧沙利鉑等聯合應用，具有良好的協同效應及相加作用[20-21]，優于單藥，且不增加化療的毒性[22]。
曲妥珠單抗主要用于乳腺癌的治療，目前國內在曲妥珠單抗對結腸癌細胞的作用方面研究較少。研究[23]認為，her-2/neu 基因過表達可使內皮細胞收縮，細胞間隙增寬，腫瘤細胞易于從內皮細胞間穿越，腫瘤細胞發生移位或轉移。本實驗的 Western blot 結果顯示，SW-620 結腸癌細胞中 her-2 蛋白的表達呈陽性，高濃度（100 μg/mL 和 1 000 μg/mL）曲妥珠單抗能顯著抑制her-2 蛋白的表達水平；且高濃度（100 μg/mL 和 1 000 μg/mL）曲妥珠單抗較對 SW-620 細胞增殖的抑制作用較 0 μg/mL 顯著；曲妥珠單抗聯合奧沙利鉑后，隨著曲妥珠單抗藥物濃度的增加，對 SW-620 細胞增殖的抑制作用逐漸增強。研究[24]表明，her-2 蛋白過表達細胞表現出對腫瘤壞死因子（TNF）處理的敏感性，這一結果提示 her-2 蛋白過表達可以通過誘導腫瘤細胞對宿主抗腫瘤機制的耐受而促進腫瘤的發生。曲妥珠單抗可以增強免疫細胞的攻擊作用，促進殺傷腫瘤靶細胞及促進其凋亡[25]。流式細胞術結果顯示，10 μg/mL 曲妥珠單抗組的 SW-620 細胞凋亡率較0 μg/mL 曲妥珠單抗組高；曲妥珠單抗聯合奧沙利鉑后，SW-620 細胞凋亡率隨曲妥珠單抗的藥物濃度增加而呈逐漸增高趨勢。流式細胞術結果還表明，不同濃度曲妥珠單抗組間的各細胞周期比例比較差異均無統計學意義，曲妥珠單抗聯合奧沙利鉑后，隨著曲妥珠單抗藥物濃度的升高，SW-620 人結腸癌細胞中 G1 期的比例呈逐漸降低趨勢，S 期細胞比例呈逐漸增高趨勢，表明曲妥珠單抗和奧沙利鉑具有協同抑制細胞周期的作用。綜上所述，曲妥珠單抗可能通過下調 her-2 蛋白的表達來抑制腫瘤細胞的增殖、促進其凋亡。
綜上所述，抗 her-2 人源單克隆抗體曲妥珠單抗能夠抑制結腸癌細胞 SW-620 細胞的增殖，促進其凋亡，同時與奧沙利鉑具有協同作用。故而，曲妥珠單抗有望成為高表達 her-2 蛋白結腸癌的靶向性治療藥物，且在手術、化療和放療的輔佐治療方面有著廣闊的應用前景。
結腸癌是一種發病率為 9.7% 的異質性疾病，為世界第 3 大常見腫瘤，患者死亡率排名第 4[1]。預計從 2012 年至 2035 年，每年新發的結腸癌患者數量可從 140 萬增至 240 萬，有 90%～95% 的結腸癌患者是由基因突變演變所導致的[2]。除了手術治療，大多數結腸癌患者采用放療和化療治療，然而效果欠佳。截止目前（2018 年），在與腫瘤發生有關的多種生物標志物中，許多研究顯示這些生物標志物與預后相關，說明這些腫瘤標志物在促進腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用[3]。由于基因突變、基因擴增或蛋白過表達等原因，人表皮生長因子受體（her）家族可表達在一些特定的腫瘤組織中，如結腸癌。her 家族成員包括 her-1、her-2、her-3 及 her-4。her 可通過促進酪氨酸激酶受體介導的信號通路，從而發揮促進細胞增殖的作用[4-5]。許多研究證實，her-2 蛋白過表達促進了腫瘤的發生發展過程[6-9]。針對 her-2 基因的靶向藥物曲妥珠單抗（herceptin）已經廣泛應用于乳腺癌和胃癌的治療，但對于結腸癌的治療效果尚未明確。本實驗將曲妥珠單抗應用于 SW-620 細胞，觀察其對細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響，并探討了曲妥珠單抗聯合奧沙利鉑（oxaliplatin）的協同作用情況，以明確其作為手術、化療和放療的輔助治療的應用前景。
1 材料和方法
1.1 實驗材料、主要試劑及設備
人結腸癌細胞株 SW-620 購自上海細胞生物研究所細胞庫；DMEM 培養基和胎牛血清均購自美國 Hyclone 公司；細胞計數試劑盒（CCK-8 試劑盒）購自日本同仁化學研究所；流式凋亡檢測試劑盒和膜聯蛋白-V/碘化丙啶（Annexin-V/PI）購自杭州聯科生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自北京寶杰羅生物科技有限公司；曲妥珠單抗購自羅氏制藥公司；奧沙利鉑購自江蘇奧賽康藥業有限公司。流式細胞儀（型號 BD FACS Calibur）系美國 BD 公司產品。
1.2 細胞培養
人結腸癌細胞株 SW-620 使用含 10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培養基，在 37 ℃ 和 5% CO2 條件下常規培養。
1.3 CCK-8 法檢測細胞增殖
取對數生長期的 SW-620 細胞制成單細胞懸液并計數細胞密度。之后細胞的分組分為 2 個板塊。① 將細胞分為 8 個濃度小組（每個小組設 5 個復孔），曲妥珠單抗的濃度依次為 0、0.001、0.01、0.1、1、10、100 及 1 000 μg/mL。② 將細胞分為 2 個大組：曲妥珠單抗組和曲妥珠單抗+奧沙利鉑組，每個大組內設 6 個濃度小組（每個小組設 5 個復孔），曲妥珠單抗的濃度依次為 0、0.001、0.01、0.1、1 及 10 μg/mL，對應的曲妥珠單抗+奧沙利鉑組的曲妥珠單抗的濃度與前相同，不同之處在于均加入了奧沙利鉑（10 μmol/L）。在 96 孔板中每孔加入 200 μL 細胞懸液（5 000 個細胞），分別加入上述濃度的曲妥珠單抗及奧沙利鉑。同時設置培養液對照孔以用于整塊培養板的調零。在細胞培養箱內孵育 48 h 后，每孔加入 CCK-8 溶液 20 μL，在細胞培養箱內繼續孵育 4 h。在 450 nm 處測定吸光度（A）值，根據 A 值比較各組細胞的增殖能力。
1.4 流式細胞術檢測細胞的凋亡
取對數生長期的 SW-620 細胞制成單細胞懸液并計數，操作同上。組別設置同上，由于實驗經費與時間有限，曲妥珠單抗的濃度僅取 0、0.1、1 及 10 μg/mL。于 24 孔板中每孔加入 1×105個細胞，給予相應的處理，在細胞培養箱內孵育 48 h 后，使用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化收集貼壁細胞，以 1 200 r/min 的轉速離心 5 min 收集細胞（r=6 cm）。使用流式凋亡檢測試劑盒進行避光染色，在 1 h 內上流式細胞儀進行檢測。結果判斷：活細胞，Annexin-V（–）/PI（–）；早期凋亡細胞，Annexin-V（+）/PI（–）；晚期凋亡細胞，Annexin-V（+）/PI（+）。細胞總凋亡率=早期凋亡細胞率+晚期凋亡細胞率[10-11]。
1.5 流式細胞術檢測細胞周期
細胞處理及分組同 1.4，即 0、0.1、1 以及10 μg/mL。各組細胞在細胞培養箱內孵育 48 h 后，收集細胞，加入–20 ℃ 預冷的 75% 乙醇中，4 ℃ 固定過夜；用 PBS 緩沖液洗滌細胞 2 次；加入 100 μL PBS 液重懸細胞，再加入 0.5% PI 5 μL，4 ℃ 避光孵育 15 min；使用流式細胞儀進行細胞周期檢測。
1.6 Western blot 法檢測各組 SW-620 細胞中 her-2蛋白的表達
根據前述研究結果，分別以 0、100 及 1 000 μg/ml 曲妥珠單抗，以及 0、1 及 10 μg/mL 曲妥珠單抗聯合奧沙利鉑（10 μmol/L）處理 SW-620 細胞后，按照蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白，一抗加入 her-2 抗體，4 ℃ 孵育過夜。洗膜 3 次，每次 5 min，然后跟辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG（二抗）室溫孵育 2 h，洗膜 3 次，每次 5 min；最后在暗室中顯影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參對照。利用 Image J 軟件進行灰度分析：her-2 蛋白的相對表達水平以目的蛋白與對應的內參蛋白的灰度值的比值表示。
1.7 統計學方法
采用 SPSS 16.0 軟件進行統計分析，計量資料采用 Shapiro-Wilk 檢驗行正態分布檢驗，符合正態分布者以均數±標準差（±s）表示，否則以中位數表示。采用 Levene 檢驗行方差齊性檢驗。多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用 LSD-t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 曲妥珠單抗對 SW-620 細胞增殖的影響
CCK-8 細胞增殖實驗結果（圖 1）表明，曲妥珠單抗對 SW-620 細胞的增殖具有抑制作用，但是低濃度時作用較微弱，只有在高濃度（100 μg/mL 和 1 000 μg/mL）時才具有顯著的抑制作用，即 100 μg/mL 和 1 000 μg/mL 濃度下的 A 值與 0 μg/mL 比較，差異有統計學意義（P<0.05），見圖 1a。曲妥珠單抗聯合奧沙利鉑對 SW-620 細胞的抑制作用明顯增強，同種曲妥珠單抗濃度下曲妥珠單抗+奧沙利鉑組的 A 值均低于曲妥珠單抗組（P<0.05），且在曲妥珠單抗+奧沙利鉑組中，隨著曲妥珠單抗濃度的增加，A 值在逐漸降低，具有劑量依賴性（圖 1b），表明曲妥珠單抗和奧沙利鉑協同抑制細胞的增殖。
圖1
示不同濃度曲妥珠單抗單獨或者聯合奧沙利鉑組的SW-620 細胞的 A 值
a：示不同濃度曲妥珠單抗組細胞的
2.2 曲妥珠單抗對 SW-620 細胞凋亡的影響
細胞凋亡實驗結果表明，同種曲妥珠單抗濃度下，曲妥珠單抗組+奧沙利鉑組的細胞凋亡率均較曲妥珠單抗組高（P<0.05）。在曲妥珠單抗組中，總體而言隨曲妥珠單抗濃度增加，細胞凋亡率增加，但僅在 10 μg/mL 時，細胞凋亡率與 0 μg/mL 比較差異才有統計學意義（P<0.05）；在曲妥珠單抗+奧沙利鉑組中，總體而言隨曲妥珠單抗濃度增加，細胞凋亡率也逐漸增加，在 1 μg/mL 和 10 μg/mL 時，細胞凋亡率與 0 μg/mL 比較差異均有統計學意義（P<0.05）。該結果提示，曲妥珠單抗對 SW-620 細胞的凋亡具有促進作用；曲妥珠單抗和奧沙利鉑具有協同抗凋亡的作用，且呈劑量依賴性，見圖 2。
圖2
示不同濃度曲妥珠單抗單獨或者聯合奧沙利鉑組 SW-620 細胞的凋亡率
a：示不同濃度曲妥珠單抗單獨或者聯合奧沙利鉑組 SW-620 細胞凋亡的流式細胞儀檢測結果；b：不同濃度曲妥珠單抗單獨或者聯合奧沙利鉑組的細胞凋亡率結果，*和#表示
2.3 曲妥珠單抗對 SW-620 細胞周期的影響
細胞周期實驗表明，不同濃度的曲妥珠單抗處理 SW-620 細胞后，4 種濃度組細胞的 G1、S 及 G2 期細胞比例比較差異均無統計學意義（P>0.05）；但是不同濃度的曲妥珠單抗+奧沙利鉑處理后，隨曲妥珠單抗濃度的增加，G1 期細胞比例呈下降趨勢，S 期細胞比例呈上升趨勢，且呈劑量依賴性，1 μg/mL 和 10 μg/mL 時的 G1 期細胞比例和 S 期細胞比例與 0 μg/mL 比較，差異均有統計學意義（P<0.05），前者（1 μg/mL 和 10 μg/mL）的 G1 期細胞比例較低，而 S 期細胞比例較高（圖 3a–3c）。在 1 μg/mL 和 10 μg/mL 曲妥珠單抗條件下，曲妥珠單抗聯合奧沙利鉑組的 G1 期細胞比例較曲妥珠單抗單藥組低，而 S 期細胞比例較高（P<0.05）；在 0.1、1 和 10 μg/mL 濃度的曲妥珠單抗條件下，曲妥珠單抗聯合奧沙利鉑組的 G2 期細胞比例較曲妥珠單抗單藥組降低（P<0.01）。具體見圖 3d–3f。該結果表明，曲妥珠單抗和奧沙利鉑具有協同抑制細胞周期的作用。
圖3
示不同濃度曲妥珠單抗單獨或聯合奧沙利鉑對 SW-620 細胞周期和 her-2 蛋白表達的影響
a：不同濃度曲妥珠單抗單獨或聯合奧沙利鉑組細胞周期的流式細胞儀檢測結果；b 和 c：不同濃度曲妥珠單抗組（b）和不同濃度曲妥珠單抗+奧沙利鉑組（c）的細胞周期結果；d–f：不同濃度曲妥珠單抗組和不同濃度曲妥珠單抗+奧沙利鉑組的 G1 期（d）、S 期（e）和 G2 期（f）細胞占比比較；g：her-2 蛋白表達的電泳圖；h：不用濃度曲妥珠單抗組 SW-620 細胞中 her-2 蛋白的相對表達水平；i：不同濃度曲妥珠單抗聯合奧沙利鉑組 SW-620 細胞中 her-2 蛋白的相對表達水平；*表示
2.4 Western blot 檢測 SW-620 細胞中 her-2 蛋白的表達
Western blot 結果顯示，1、100 及 1 000 μg/mL 曲妥珠單抗組細胞中 her-2 蛋白的表達水平逐漸降低，3 組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）；0、1 及 10 μg/mL 曲妥珠單抗+奧沙利鉑組中 her-2 蛋白的表達水平也逐漸降低，3 組間兩兩比較差異也有統計學意義（P<0.05）。具體見圖 3g–3i。
3 討論
生物治療是現今腫瘤腫瘤的一個熱門研究方向。隨著生物學研究的深入發展，人們發現，編碼生長因子及其受體的原癌基因在一些人類惡性腫瘤的發生和發展中起著重要作用[12-13]，抑制這些生長因子及其受體的功能是目前腫瘤綜合治療的一個新策略。有研究[14]發現，her-2/neu 基因在許多惡性腫瘤中出現不同程度的表達，尤其是上皮源性的腫瘤，如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、結直腸癌等[15]。梁霞等[16]以聚合酶鏈反應片段長度來研究her-2/neu 基因多態性在密碼子 655 上的分布及其與中國人結腸癌易感性的關系，2 種基因型（亮氨酸/纈氨酸基因型和纈氨酸/纈氨酸）的頻率（25.34%）和纈氨酸等位基因頻率（13.36%）的增高均與直腸癌的發生有關。近年來，有關 her-2 蛋白的過度表達與結腸癌生物學行為關系的研究日益增多，雖未達成統一的意見，但普遍認為，有 10%～47% 的結腸癌存在 her-2 蛋白的過表達[2, 17]。有研究[18]表明，her-2 蛋白的表達水平不僅與 Dukes 分期和生存期有關，還與腫瘤的分化程度及是否有淋巴結轉移有關，可以作為結腸癌獨立的預后因素。曲妥珠單抗就是針對 her-2 蛋白設計的人源化鼠嵌合型抗體，是一種新型、高效、低毒及選擇性強的靶向治療藥物，1988 年被美國 FDA 批準上市，已通過Ⅲ期臨床試驗，取得了令人鼓舞的療效[19]。單用曲妥珠單抗或者與多種化療藥物如順鉑、奧沙利鉑等聯合應用，具有良好的協同效應及相加作用[20-21]，優于單藥，且不增加化療的毒性[22]。
曲妥珠單抗主要用于乳腺癌的治療，目前國內在曲妥珠單抗對結腸癌細胞的作用方面研究較少。研究[23]認為，her-2/neu 基因過表達可使內皮細胞收縮，細胞間隙增寬，腫瘤細胞易于從內皮細胞間穿越，腫瘤細胞發生移位或轉移。本實驗的 Western blot 結果顯示，SW-620 結腸癌細胞中 her-2 蛋白的表達呈陽性，高濃度（100 μg/mL 和 1 000 μg/mL）曲妥珠單抗能顯著抑制her-2 蛋白的表達水平；且高濃度（100 μg/mL 和 1 000 μg/mL）曲妥珠單抗較對 SW-620 細胞增殖的抑制作用較 0 μg/mL 顯著；曲妥珠單抗聯合奧沙利鉑后，隨著曲妥珠單抗藥物濃度的增加，對 SW-620 細胞增殖的抑制作用逐漸增強。研究[24]表明，her-2 蛋白過表達細胞表現出對腫瘤壞死因子（TNF）處理的敏感性，這一結果提示 her-2 蛋白過表達可以通過誘導腫瘤細胞對宿主抗腫瘤機制的耐受而促進腫瘤的發生。曲妥珠單抗可以增強免疫細胞的攻擊作用，促進殺傷腫瘤靶細胞及促進其凋亡[25]。流式細胞術結果顯示，10 μg/mL 曲妥珠單抗組的 SW-620 細胞凋亡率較0 μg/mL 曲妥珠單抗組高；曲妥珠單抗聯合奧沙利鉑后，SW-620 細胞凋亡率隨曲妥珠單抗的藥物濃度增加而呈逐漸增高趨勢。流式細胞術結果還表明，不同濃度曲妥珠單抗組間的各細胞周期比例比較差異均無統計學意義，曲妥珠單抗聯合奧沙利鉑后，隨著曲妥珠單抗藥物濃度的升高，SW-620 人結腸癌細胞中 G1 期的比例呈逐漸降低趨勢，S 期細胞比例呈逐漸增高趨勢，表明曲妥珠單抗和奧沙利鉑具有協同抑制細胞周期的作用。綜上所述，曲妥珠單抗可能通過下調 her-2 蛋白的表達來抑制腫瘤細胞的增殖、促進其凋亡。
綜上所述，抗 her-2 人源單克隆抗體曲妥珠單抗能夠抑制結腸癌細胞 SW-620 細胞的增殖，促進其凋亡，同時與奧沙利鉑具有協同作用。故而，曲妥珠單抗有望成為高表達 her-2 蛋白結腸癌的靶向性治療藥物，且在手術、化療和放療的輔佐治療方面有著廣闊的應用前景。
