引用本文： 邢智遠, 張鳳娟, 王志偉. 泛素特異性蛋白酶 39 對人結直腸癌細胞增殖的調控研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(12): 1439-1444. doi: 10.7507/1007-9424.201805087 復制
近年來，我國結直腸癌（colorectal cancer，CRC）的發病率呈上升趨勢，已成為引起癌癥死亡的最常見原因之一[1]。手術、放療和化療是 CRC 的主要治療手段，但療效已達到平臺期[2]。許多基因在腫瘤組織中表達過度或缺失，且這些基因在腫瘤的發生和發展過程中起關鍵作用。采取抑制或加強這些基因的表達的生物靶向治療策略在 CRC 的治療中已取得了良好的治療效果，成為繼手術、化療和放療后腫瘤治療的第 4 種模式[3]。目前有 50 多種靶向治療藥物已經被美國 FDA 批準，從針對腫瘤細胞分化的癌蛋白，到靶向特征性腫瘤抗原；從改變腫瘤微環境，到阻斷免疫監測點；從精確阻斷腫瘤異常信號通路，到抑制多靶點多通路，人類抗腫瘤藥物越來越精準[4-6]。篩選更多的目的基因以提高腫瘤治療的靶向性是目前研究的熱點。泛素特異性蛋白酶 39（USP39）是一類去泛素化酶，包括 1 個位于中心的鋅指結構和 2 個泛素 C 末端的水解酶結構域，盡管其沒有泛素特異性蛋白酶活性，但在 mRNA 前體的剪接過程中起重要作用[7]。USP39 蛋白是一類分子量為 65×103的具有 U4/U6.U5 三小核核糖核蛋白復合物結構的剪接因子相關蛋白，與成熟剪接復合體的組裝和保證有絲分裂紡錘體檢查點的完整性有關[8]。最近有研究報道[9]稱，在 U2OS 細胞中抑制 USP39 蛋白的表達會引起染色體分離和細胞質分裂發生錯誤，表明 USP39 蛋白在調控有絲分裂過程中起重要作用。此外，USP39 分子在腫瘤細胞中的促生長作用被廣泛研究。學者[10-11]的研究表明，USP39 蛋白的過表達能夠促進前列腺癌和乳腺癌細胞的增殖。另外，在肝癌和甲狀腺髓樣癌細胞中，抑制 USP39 蛋白的表達會引起 G2/M 期細胞周期停滯和細胞凋亡，這表明 USP39 蛋白是治療多種腫瘤潛在的分子治療靶點[12-13]。但是 USP39 分子在 CRC 中的生物學功能并未研究清楚。因此，本研究的目的是探索 USP39 分子對 CRC 細胞生長的潛在作用。為了探討 USP39 蛋白作為靶點的可能性，本研究首先檢測了 USP39 蛋白在 CRC 組織中的表達；然后采用慢病毒介導的短發夾 RNA（shRNA）轉染 CRC 細胞，再進行功能失活分析研究，最后觀察 USP39 蛋白對 CRC 細胞生長形成能力的影響。
1 材料和方法
1.1 標本來源
回顧性收集青島大學醫學院第二附屬醫院 2013–2015年期間的 80 例 CRC 組織及其癌旁組織（距癌組織以遠 5 cm）石蠟樣本。80 例 CRC 患者中，男 55 例，女 25 例；年齡 41～72 歲，中位年齡為 53 歲；高分化 12 例，中分化 22 例，低分化 45 例，都是腺癌；浸潤深度：T1+T2 期 44 例，T3+T4 期 36 例；淋巴結轉移陰性 51 例，陽性 29 例；未遠處轉移 58 例，遠處轉移 22 例。所有患者均未接受過術前放療及化療。本研究經青島大學醫學院第二附屬醫院倫理委員會批準。
1.2 主要材料、試劑和設備
人 CRC 細胞株 SW1116 和 HCT116，以及人胚腎細胞株 293T（HEK293T）均購自中國科學院細胞庫；pFH-L 載體、針對 USP39 基因的小干擾 RNA 序列（shRNA1：5′-GATTTGGAAGAGGCGAGATAACTCGAGTTATCTCGCCTCTTCCAAATCTTTTT-3′；shRNA2：5′-CCTTCCAGACAACTATGAGATCTCGAGATCTCATAGTTGTCTGGAAGGTTTTT-3′）及對照序列（5′-GCGGAGGGTTTGAAAGAATATCTCGAGATATTCTTTCAAACCCTCCGCTTTTTT-3′）由上海黃離生物科技有限公司設計并合成；四唑鹽（MTT）比色法試劑盒購自碧云天公司。兔單克隆抗體 USP39 購自 Abcam 公司，工作滴度為 1∶200；BD FACSCalibur 流式細胞儀購自美國 BD 公司；雷杜 RT-6000 酶標儀系深圳雷杜公司產品。
1.3 免疫組織化學染色法檢測 USP39 蛋白的表達
4 μm 厚的石蠟切片常規脫蠟水化后，經檸檬酸鈉緩沖液微波抗原修復，用 3% H2O2 反應 10 min，去除內源性過氧化物酶。加入一抗工作液 4 ℃ 過夜孵育，然后加生物素標記的二抗工作液，37 ℃ 干燥箱孵育 30 min，DAB 顯色，蘇木精復染，透明，封片。光鏡下觀察染色情況，用已知腎癌陽性標本作為陽性對照，用 PBS 夜代替一抗作陰性對照。USP39 蛋白染色由 2 位有經驗的病理科醫生進行評分。每張切片隨機選擇 5 個不重疊的高倍視野（20 倍），結果判讀采用半定量積分分級方法[14]，積分=染色強度×染色細胞比例。染色強度：陰性為0 分，淺灰色為 1 分，淡黃色為 2 分，黃色為 3 分，棕黃色為 4 分；染色細胞比例：無陽性細胞為0 分，1%～25% 為 1 分，26%～50% 為 2 分，51%～75% 為 3 分，76%～100% 為 4 分；總分為兩者相乘，其中 0～11 分為低表達，12～16 分為高表達。
1.4 細胞培養
SW1116 和 HEK293T 細胞采用含有 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培養基培養，HCT116 細胞采用含有 10% FBS 的 RPMI 1640 培養基培養。所有的細胞都在 37 ℃ 飽和濕度和 5% CO2 條件下常規培養。
1.5 慢病毒構建與轉染
為了實現 USP39 基因的敲低表達，本實驗設計了 2 條靶向人 USP39 基因的序列和對照序列。將寡核酸片段退火后插入到 pFH-L 載體中，pFH-L 載體上帶有綠色熒光蛋白標簽以作為報告基因。慢病毒的構建方法參照之前的報道[15]。構建的慢病毒 Lv-shUSP39 用于特異性敲低 USP39 基因的表達，Lv-shCon 用作陰性對照。
將密度為 5×104個/mL 的 SW1116 和 HCT116 細胞懸液鋪于 96 孔板中，慢病毒依次稀釋成 1×108、1×107和 1×106 TU/mL，各取 50 μL 感染細胞，感染 96 h 后觀察熒光并記錄熒光效率，確定慢病毒的復感染指數（MOI）為 30。轉染細胞所需病毒的體積（μL）=病毒的 MOI×種板量/病毒滴度（本實驗的病毒滴度為 1×108 TU/mL）。將針對 USP39 基因的 2 種慢病毒載體：Lv-shUSP39（S1）和 Lv-shUSP39（S2），以及陰性對照載體轉染入 CRC 細胞，分別命名為 KD-1 組、KD-2 組和 shCon 組（陰性對照），未轉染病毒的 CRC 細胞為空白對照組（Con 組）。采用 MTT 法和流式細胞術分別檢測敲低 USP39 表達對 CRC 細胞增殖和細胞周期分布的影響。所有實驗都重復進行 3 次（取均值），每次實驗設 5 個復孔。
1.6 MTT 法檢測 CRC 細胞的增殖
將 2×103個細胞接種于 96 孔板，100 μL/孔，分為 4 組（每組設 5 個復孔）：KD-1 組、KD-2 組、shCon 組和 Con 組。放入培養箱，5% CO2、37 ℃ 分別培養。培養 1～5 d 后，每孔加入 20 μL 5 mg/mL 的 MTT 母液，輕輕震蕩混勻。反應 4 h 后，每孔加入 100 μL 二甲基亞砜終止反應，輕輕震蕩混勻。采用酶標儀檢測光密度（OD）值（590 nm）。4 組腫瘤細胞分別培養 1、2、3、4 和 5 d 后測其 OD 值，并根據不同時間點的 OD 值繪制生長曲線。
1.7 流式細胞術檢測細胞周期
將慢病毒感染的細胞消化成單細胞懸液，用預冷的 75% 乙醇固定細胞，每管加入新鮮配制的碘化丙啶（PI）染色液（50 μg/mL），緩慢并充分重懸細胞，37 ℃ 避光溫浴 1 h 后，置于 4 ℃ 條件下，24 h 內上機檢測。
1.8 統計學方法
采用 SPSS 16.0 軟件進行統計學分析。所有實驗都進行 3 次獨立重復。計量資料采用均數±標準差（
±s）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗。計數資料采用成組 χ2 檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 USP39 蛋白的表達結果
USP39 在癌旁組織和癌組織中的表達均位于細胞漿，未見明顯的細胞核染色（圖 1）。根據免疫組織化學染色的評分標準，80 例癌旁組織標本中，70 例呈低表達，10 例呈高表達；80 例 CRC 組織中，56 例呈高表達，24 例呈低表達。USP39 蛋白在 CRC 組織中的高表達率高于癌旁組織（χ2=7.32，P=0.007）。
圖1
示 USP39 蛋白在癌旁組織（a）和 CRC 組織（b）中的表達（SP ×40）
2.2 USP39 蛋白表達與 CRC 患者臨床病理學特征的相關性
CRC 患者中 USP39 蛋白的高表達與腫瘤分期和腫瘤分化程度具有相關性（P<0.05），與患者的年齡、性別、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和遠處轉移的相關性無統計學意義（P>0.05），具體見表 1。
表1
USP39 蛋白表達與 CRC 患者臨床病理學特征的關系（例）
2.3 敲低 USP39 基因的表達對 CRC 細胞增殖能力的抑制效果
本實驗采用 MTT 法，檢測了 USP39 基因敲低對 CRC 細胞增殖能力的影響。4 組腫瘤細胞的生長曲線見圖 2。由圖 2 可見，不管是在 SW1116 細胞還是在 HCT116 細胞中，第 1 天和第 2 天時 4 組細胞的 OD 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）；第 3、4 及 5 天時， KD-1 組和 KD-2 組細胞的增殖能力均明顯低于 shCon 組和 Con 組（P<0.05），且第 3、4 及 5 天時 shCon 組和 Con 組比較差異均沒有統計學意義（P>0.05）。但在 SW116 細胞中，第 3、4 及 5 天時 KD-1 組和 KD-2 組比較差異無統計學意義（P>0.05），在 HCT116 細胞中，第 3、4 及 5 天時 KD-1 組的 OD 值均低于 KD-2 組 （P<0.05）。總體而言，SW116 細胞和 HCT116 細胞中，shCon組和 Con 組隨時間延長，OD 值顯著升高，而 KD-1 組和 KD-2 組變化相對不明顯。這表明敲低 USP39 基因的表達可抑制 CRC 細胞的生長。因 KD-1 組基因干擾效率高，可顯著抑制細胞增殖，因此選擇 KD-1 組進行后續研究。
圖2
示 SW116 細胞和 HCT116 細胞中敲低 USP39 基因的表達后細胞的生長曲線
a：SW116 細胞，第 3、4 及 5 天時，KD-1 組和 KD-2 組的 OD 值均低于 shCon 組和 Con 組（
2.4 敲低 USP39 基因的表達阻斷了細胞周期進程
細胞的增殖依賴于細胞周期進程，因此，本實驗在敲低 USP39 基因表達后對 SW1116 和 HCT116 細胞的細胞周期分布進行了分析。分析結果（圖 3）顯示，不管是在 SW1116 細胞還是在 HCT116 細胞的 KD-1 組中，G0/G1 期的細胞百分比均較 Con 組和 shCon 組降低（P<0.05），G2/M 期的細胞百分比均增加（P<0.05），但同種細胞內 Con 組和 shCon 組的 G0/G1、S 期和 M 期的細胞比例比較差異均無統計學意義（P>0.05）。該結果提示，USP39 基因調節細胞增殖可能是通過調控細胞周期實現的。另外，不管是在 SW1116 細胞還是在 HCT116 細胞中，KD-1 組的亞 G1 期細胞數均較 Con 組和 shCon 組增高（P<0.05），但同種細胞內 Con 組和 shCon 組的亞 G1 期細胞數比較差異無統計學意義（P>0.05）。該結果提示，KD-1 組細胞發生了早期凋亡。
圖3
示敲低結直腸癌細胞 USP39 基因的表達影響了細胞周期的分布
a–c：SWT1116 細胞中，Con 組（a）、shCon 組（b）和 KD-1 組（c）的細胞周期分布；d–f：HCT116 細胞中，Con 組（d）、shCon 組（e）和 KD-1 組（f）的細胞周期數量分布；g 和 h：SWT1116 細胞中，Con 組、shCon 組和 KD-1 組的細胞周期比例（g）和亞 G1 期比例（h）；i 和 j：HCT116 細胞中，Con 組、shCon 組和 KD-1 組的細胞周期比例（i）和亞 G1 期比例（j）；與 Con 組及 shCon 組比較，*
3 討論
CRC 是最常見的惡性腫瘤之一。在 CRC 的發生和發展過程中，由各種基因和信號轉導通路組成的異常復雜的網絡系統調控著 CRC 的各種生物學行為[16]。隨著人們對腫瘤分子生物學了解的不斷深入，目前常以調控腫瘤細胞生物學行為的某些關鍵分子作為治療靶點，用特異性阻斷劑選擇性作用于該靶點，有效地干預該關鍵分子的功能以達到抑制腫瘤的目的[17-20]。目前貝伐單抗、西妥昔單抗、帕尼單抗等分子靶向藥物在臨床應用中取得了顯著療效[18, 21-23]。因此，探尋調控腫瘤細胞生物學活性的關鍵分子，為腫瘤治療提供有效的治療靶點，具有重要的臨床應用價值。
本研究采用免疫組織化學染色的方法檢測了 80 例 CRC 組織及癌旁組織中 USP39 蛋白的表達，發現 USP39 蛋白在 CRC 組織中的高表達率較癌旁組織顯著升高。進一步分析發現，USP39 蛋白的表達與腫瘤分期和分化程度相關，這提示 USP39 蛋白的表達可能在 CRC 的發生和發展過程中發揮重要作用。
為了證實 USP39 基因在腫瘤細胞中的作用，本實驗采用慢病毒載體敲低 CRC 細胞株 SW1116 和 HCT116 細胞中 USP39 基因的表達，發現敲低 USP39 基因的表達能夠顯著抑制 SW1116 和 HCT116 細胞的增殖能力。這表明 USP39 基因表達與 CRC 細胞的生長增殖有關。近年有文獻[22]報道，剪切體與腫瘤的發生和發展相關。USP39 蛋白是剪切體的重要組成部分，調控著原癌基因極光激酶 B（Aurora B）和腫瘤抑制基因 RB 基因（RB1）前體 mRNA 的剪切，保證紡錘體檢查點和胞質分裂的完整性[24]。Aurora B 的下調引起紡錘體檢查點功能的異常和胞質分裂錯誤[7]。因此，USP39 蛋白可能通過調控 Aurora B mRNA 的剪切作用調節細胞的增殖。
細胞周期的異常也是惡性腫瘤的一個重要特征。本研究進一步檢測了 USP39 基因表達對細胞周期的影響，結果顯示，敲低 USP39 基因的表達顯著減少了 CRC 細胞中 G0/G1 和 S 期的細胞百分比，增加 G2/M 期百分比，導致 G2/M 期阻滯。研究[25-27]發現，沉默 USP39 基因的表達可抑制腫瘤細胞周期蛋白依賴性激酶 1 或細胞周期蛋白（B1CDK1/CyclinB1）活性，導致細胞 G2/M 期停滯，這與本研究結果一致。
綜上所述，本研究結果顯示，USP39 蛋白高表達于 CRC 組織中，其與腫瘤的分期呈正相關，說明 USP39 蛋白可能參與 CRC 的發生和發展。敲低 USP39 基因表達可抑制 CRC 細胞的增殖，阻滯細胞于 G2/M 期。本研究結果提示，USP39 可能是調控 CRC 生物學活性的關鍵因子，它或許是一種潛在的抗腫瘤治療的靶點。
近年來，我國結直腸癌（colorectal cancer，CRC）的發病率呈上升趨勢，已成為引起癌癥死亡的最常見原因之一[1]。手術、放療和化療是 CRC 的主要治療手段，但療效已達到平臺期[2]。許多基因在腫瘤組織中表達過度或缺失，且這些基因在腫瘤的發生和發展過程中起關鍵作用。采取抑制或加強這些基因的表達的生物靶向治療策略在 CRC 的治療中已取得了良好的治療效果，成為繼手術、化療和放療后腫瘤治療的第 4 種模式[3]。目前有 50 多種靶向治療藥物已經被美國 FDA 批準，從針對腫瘤細胞分化的癌蛋白，到靶向特征性腫瘤抗原；從改變腫瘤微環境，到阻斷免疫監測點；從精確阻斷腫瘤異常信號通路，到抑制多靶點多通路，人類抗腫瘤藥物越來越精準[4-6]。篩選更多的目的基因以提高腫瘤治療的靶向性是目前研究的熱點。泛素特異性蛋白酶 39（USP39）是一類去泛素化酶，包括 1 個位于中心的鋅指結構和 2 個泛素 C 末端的水解酶結構域，盡管其沒有泛素特異性蛋白酶活性，但在 mRNA 前體的剪接過程中起重要作用[7]。USP39 蛋白是一類分子量為 65×103的具有 U4/U6.U5 三小核核糖核蛋白復合物結構的剪接因子相關蛋白，與成熟剪接復合體的組裝和保證有絲分裂紡錘體檢查點的完整性有關[8]。最近有研究報道[9]稱，在 U2OS 細胞中抑制 USP39 蛋白的表達會引起染色體分離和細胞質分裂發生錯誤，表明 USP39 蛋白在調控有絲分裂過程中起重要作用。此外，USP39 分子在腫瘤細胞中的促生長作用被廣泛研究。學者[10-11]的研究表明，USP39 蛋白的過表達能夠促進前列腺癌和乳腺癌細胞的增殖。另外，在肝癌和甲狀腺髓樣癌細胞中，抑制 USP39 蛋白的表達會引起 G2/M 期細胞周期停滯和細胞凋亡，這表明 USP39 蛋白是治療多種腫瘤潛在的分子治療靶點[12-13]。但是 USP39 分子在 CRC 中的生物學功能并未研究清楚。因此，本研究的目的是探索 USP39 分子對 CRC 細胞生長的潛在作用。為了探討 USP39 蛋白作為靶點的可能性，本研究首先檢測了 USP39 蛋白在 CRC 組織中的表達；然后采用慢病毒介導的短發夾 RNA（shRNA）轉染 CRC 細胞，再進行功能失活分析研究，最后觀察 USP39 蛋白對 CRC 細胞生長形成能力的影響。
1 材料和方法
1.1 標本來源
回顧性收集青島大學醫學院第二附屬醫院 2013–2015年期間的 80 例 CRC 組織及其癌旁組織（距癌組織以遠 5 cm）石蠟樣本。80 例 CRC 患者中，男 55 例，女 25 例；年齡 41～72 歲，中位年齡為 53 歲；高分化 12 例，中分化 22 例，低分化 45 例，都是腺癌；浸潤深度：T1+T2 期 44 例，T3+T4 期 36 例；淋巴結轉移陰性 51 例，陽性 29 例；未遠處轉移 58 例，遠處轉移 22 例。所有患者均未接受過術前放療及化療。本研究經青島大學醫學院第二附屬醫院倫理委員會批準。
1.2 主要材料、試劑和設備
人 CRC 細胞株 SW1116 和 HCT116，以及人胚腎細胞株 293T（HEK293T）均購自中國科學院細胞庫；pFH-L 載體、針對 USP39 基因的小干擾 RNA 序列（shRNA1：5′-GATTTGGAAGAGGCGAGATAACTCGAGTTATCTCGCCTCTTCCAAATCTTTTT-3′；shRNA2：5′-CCTTCCAGACAACTATGAGATCTCGAGATCTCATAGTTGTCTGGAAGGTTTTT-3′）及對照序列（5′-GCGGAGGGTTTGAAAGAATATCTCGAGATATTCTTTCAAACCCTCCGCTTTTTT-3′）由上海黃離生物科技有限公司設計并合成；四唑鹽（MTT）比色法試劑盒購自碧云天公司。兔單克隆抗體 USP39 購自 Abcam 公司，工作滴度為 1∶200；BD FACSCalibur 流式細胞儀購自美國 BD 公司；雷杜 RT-6000 酶標儀系深圳雷杜公司產品。
1.3 免疫組織化學染色法檢測 USP39 蛋白的表達
4 μm 厚的石蠟切片常規脫蠟水化后，經檸檬酸鈉緩沖液微波抗原修復，用 3% H2O2 反應 10 min，去除內源性過氧化物酶。加入一抗工作液 4 ℃ 過夜孵育，然后加生物素標記的二抗工作液，37 ℃ 干燥箱孵育 30 min，DAB 顯色，蘇木精復染，透明，封片。光鏡下觀察染色情況，用已知腎癌陽性標本作為陽性對照，用 PBS 夜代替一抗作陰性對照。USP39 蛋白染色由 2 位有經驗的病理科醫生進行評分。每張切片隨機選擇 5 個不重疊的高倍視野（20 倍），結果判讀采用半定量積分分級方法[14]，積分=染色強度×染色細胞比例。染色強度：陰性為0 分，淺灰色為 1 分，淡黃色為 2 分，黃色為 3 分，棕黃色為 4 分；染色細胞比例：無陽性細胞為0 分，1%～25% 為 1 分，26%～50% 為 2 分，51%～75% 為 3 分，76%～100% 為 4 分；總分為兩者相乘，其中 0～11 分為低表達，12～16 分為高表達。
1.4 細胞培養
SW1116 和 HEK293T 細胞采用含有 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培養基培養，HCT116 細胞采用含有 10% FBS 的 RPMI 1640 培養基培養。所有的細胞都在 37 ℃ 飽和濕度和 5% CO2 條件下常規培養。
1.5 慢病毒構建與轉染
為了實現 USP39 基因的敲低表達，本實驗設計了 2 條靶向人 USP39 基因的序列和對照序列。將寡核酸片段退火后插入到 pFH-L 載體中，pFH-L 載體上帶有綠色熒光蛋白標簽以作為報告基因。慢病毒的構建方法參照之前的報道[15]。構建的慢病毒 Lv-shUSP39 用于特異性敲低 USP39 基因的表達，Lv-shCon 用作陰性對照。
將密度為 5×104個/mL 的 SW1116 和 HCT116 細胞懸液鋪于 96 孔板中，慢病毒依次稀釋成 1×108、1×107和 1×106 TU/mL，各取 50 μL 感染細胞，感染 96 h 后觀察熒光并記錄熒光效率，確定慢病毒的復感染指數（MOI）為 30。轉染細胞所需病毒的體積（μL）=病毒的 MOI×種板量/病毒滴度（本實驗的病毒滴度為 1×108 TU/mL）。將針對 USP39 基因的 2 種慢病毒載體：Lv-shUSP39（S1）和 Lv-shUSP39（S2），以及陰性對照載體轉染入 CRC 細胞，分別命名為 KD-1 組、KD-2 組和 shCon 組（陰性對照），未轉染病毒的 CRC 細胞為空白對照組（Con 組）。采用 MTT 法和流式細胞術分別檢測敲低 USP39 表達對 CRC 細胞增殖和細胞周期分布的影響。所有實驗都重復進行 3 次（取均值），每次實驗設 5 個復孔。
1.6 MTT 法檢測 CRC 細胞的增殖
將 2×103個細胞接種于 96 孔板，100 μL/孔，分為 4 組（每組設 5 個復孔）：KD-1 組、KD-2 組、shCon 組和 Con 組。放入培養箱，5% CO2、37 ℃ 分別培養。培養 1～5 d 后，每孔加入 20 μL 5 mg/mL 的 MTT 母液，輕輕震蕩混勻。反應 4 h 后，每孔加入 100 μL 二甲基亞砜終止反應，輕輕震蕩混勻。采用酶標儀檢測光密度（OD）值（590 nm）。4 組腫瘤細胞分別培養 1、2、3、4 和 5 d 后測其 OD 值，并根據不同時間點的 OD 值繪制生長曲線。
1.7 流式細胞術檢測細胞周期
將慢病毒感染的細胞消化成單細胞懸液，用預冷的 75% 乙醇固定細胞，每管加入新鮮配制的碘化丙啶（PI）染色液（50 μg/mL），緩慢并充分重懸細胞，37 ℃ 避光溫浴 1 h 后，置于 4 ℃ 條件下，24 h 內上機檢測。
1.8 統計學方法
采用 SPSS 16.0 軟件進行統計學分析。所有實驗都進行 3 次獨立重復。計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗。計數資料采用成組 χ2 檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 USP39 蛋白的表達結果
USP39 在癌旁組織和癌組織中的表達均位于細胞漿，未見明顯的細胞核染色（圖 1）。根據免疫組織化學染色的評分標準，80 例癌旁組織標本中，70 例呈低表達，10 例呈高表達；80 例 CRC 組織中，56 例呈高表達，24 例呈低表達。USP39 蛋白在 CRC 組織中的高表達率高于癌旁組織（χ2=7.32，P=0.007）。
圖1
示 USP39 蛋白在癌旁組織（a）和 CRC 組織（b）中的表達（SP ×40）
2.2 USP39 蛋白表達與 CRC 患者臨床病理學特征的相關性
CRC 患者中 USP39 蛋白的高表達與腫瘤分期和腫瘤分化程度具有相關性（P<0.05），與患者的年齡、性別、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和遠處轉移的相關性無統計學意義（P>0.05），具體見表 1。
表1
USP39 蛋白表達與 CRC 患者臨床病理學特征的關系（例）
2.3 敲低 USP39 基因的表達對 CRC 細胞增殖能力的抑制效果
本實驗采用 MTT 法，檢測了 USP39 基因敲低對 CRC 細胞增殖能力的影響。4 組腫瘤細胞的生長曲線見圖 2。由圖 2 可見，不管是在 SW1116 細胞還是在 HCT116 細胞中，第 1 天和第 2 天時 4 組細胞的 OD 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）；第 3、4 及 5 天時， KD-1 組和 KD-2 組細胞的增殖能力均明顯低于 shCon 組和 Con 組（P<0.05），且第 3、4 及 5 天時 shCon 組和 Con 組比較差異均沒有統計學意義（P>0.05）。但在 SW116 細胞中，第 3、4 及 5 天時 KD-1 組和 KD-2 組比較差異無統計學意義（P>0.05），在 HCT116 細胞中，第 3、4 及 5 天時 KD-1 組的 OD 值均低于 KD-2 組 （P<0.05）。總體而言，SW116 細胞和 HCT116 細胞中，shCon組和 Con 組隨時間延長，OD 值顯著升高，而 KD-1 組和 KD-2 組變化相對不明顯。這表明敲低 USP39 基因的表達可抑制 CRC 細胞的生長。因 KD-1 組基因干擾效率高，可顯著抑制細胞增殖，因此選擇 KD-1 組進行后續研究。
圖2
示 SW116 細胞和 HCT116 細胞中敲低 USP39 基因的表達后細胞的生長曲線
a：SW116 細胞，第 3、4 及 5 天時，KD-1 組和 KD-2 組的 OD 值均低于 shCon 組和 Con 組（
2.4 敲低 USP39 基因的表達阻斷了細胞周期進程
細胞的增殖依賴于細胞周期進程，因此，本實驗在敲低 USP39 基因表達后對 SW1116 和 HCT116 細胞的細胞周期分布進行了分析。分析結果（圖 3）顯示，不管是在 SW1116 細胞還是在 HCT116 細胞的 KD-1 組中，G0/G1 期的細胞百分比均較 Con 組和 shCon 組降低（P<0.05），G2/M 期的細胞百分比均增加（P<0.05），但同種細胞內 Con 組和 shCon 組的 G0/G1、S 期和 M 期的細胞比例比較差異均無統計學意義（P>0.05）。該結果提示，USP39 基因調節細胞增殖可能是通過調控細胞周期實現的。另外，不管是在 SW1116 細胞還是在 HCT116 細胞中，KD-1 組的亞 G1 期細胞數均較 Con 組和 shCon 組增高（P<0.05），但同種細胞內 Con 組和 shCon 組的亞 G1 期細胞數比較差異無統計學意義（P>0.05）。該結果提示，KD-1 組細胞發生了早期凋亡。
圖3
示敲低結直腸癌細胞 USP39 基因的表達影響了細胞周期的分布
a–c：SWT1116 細胞中，Con 組（a）、shCon 組（b）和 KD-1 組（c）的細胞周期分布；d–f：HCT116 細胞中，Con 組（d）、shCon 組（e）和 KD-1 組（f）的細胞周期數量分布；g 和 h：SWT1116 細胞中，Con 組、shCon 組和 KD-1 組的細胞周期比例（g）和亞 G1 期比例（h）；i 和 j：HCT116 細胞中，Con 組、shCon 組和 KD-1 組的細胞周期比例（i）和亞 G1 期比例（j）；與 Con 組及 shCon 組比較，*
3 討論
CRC 是最常見的惡性腫瘤之一。在 CRC 的發生和發展過程中，由各種基因和信號轉導通路組成的異常復雜的網絡系統調控著 CRC 的各種生物學行為[16]。隨著人們對腫瘤分子生物學了解的不斷深入，目前常以調控腫瘤細胞生物學行為的某些關鍵分子作為治療靶點，用特異性阻斷劑選擇性作用于該靶點，有效地干預該關鍵分子的功能以達到抑制腫瘤的目的[17-20]。目前貝伐單抗、西妥昔單抗、帕尼單抗等分子靶向藥物在臨床應用中取得了顯著療效[18, 21-23]。因此，探尋調控腫瘤細胞生物學活性的關鍵分子，為腫瘤治療提供有效的治療靶點，具有重要的臨床應用價值。
本研究采用免疫組織化學染色的方法檢測了 80 例 CRC 組織及癌旁組織中 USP39 蛋白的表達，發現 USP39 蛋白在 CRC 組織中的高表達率較癌旁組織顯著升高。進一步分析發現，USP39 蛋白的表達與腫瘤分期和分化程度相關，這提示 USP39 蛋白的表達可能在 CRC 的發生和發展過程中發揮重要作用。
為了證實 USP39 基因在腫瘤細胞中的作用，本實驗采用慢病毒載體敲低 CRC 細胞株 SW1116 和 HCT116 細胞中 USP39 基因的表達，發現敲低 USP39 基因的表達能夠顯著抑制 SW1116 和 HCT116 細胞的增殖能力。這表明 USP39 基因表達與 CRC 細胞的生長增殖有關。近年有文獻[22]報道，剪切體與腫瘤的發生和發展相關。USP39 蛋白是剪切體的重要組成部分，調控著原癌基因極光激酶 B（Aurora B）和腫瘤抑制基因 RB 基因（RB1）前體 mRNA 的剪切，保證紡錘體檢查點和胞質分裂的完整性[24]。Aurora B 的下調引起紡錘體檢查點功能的異常和胞質分裂錯誤[7]。因此，USP39 蛋白可能通過調控 Aurora B mRNA 的剪切作用調節細胞的增殖。
細胞周期的異常也是惡性腫瘤的一個重要特征。本研究進一步檢測了 USP39 基因表達對細胞周期的影響，結果顯示，敲低 USP39 基因的表達顯著減少了 CRC 細胞中 G0/G1 和 S 期的細胞百分比，增加 G2/M 期百分比，導致 G2/M 期阻滯。研究[25-27]發現，沉默 USP39 基因的表達可抑制腫瘤細胞周期蛋白依賴性激酶 1 或細胞周期蛋白（B1CDK1/CyclinB1）活性，導致細胞 G2/M 期停滯，這與本研究結果一致。
綜上所述，本研究結果顯示，USP39 蛋白高表達于 CRC 組織中，其與腫瘤的分期呈正相關，說明 USP39 蛋白可能參與 CRC 的發生和發展。敲低 USP39 基因表達可抑制 CRC 細胞的增殖，阻滯細胞于 G2/M 期。本研究結果提示，USP39 可能是調控 CRC 生物學活性的關鍵因子，它或許是一種潛在的抗腫瘤治療的靶點。
