引用本文： 黃晶晶, 盧樂, 吉鴻, 陸宏偉. 乏氧環境下 HIF-1α 對肝癌細胞逆向分化影響的實驗研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(1): 14-18. doi: 10.7507/1007-9424.201807082 復制
原發性肝癌患者中有 91.5% 為肝細胞肝癌，占我國癌癥死亡人數的第 3 位，是目前較常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害著人們的健康[1]。肝細胞肝癌作為高侵襲性的腫瘤，其增殖和轉移是導致肝癌臨床治療效果差和治愈率低的主要原因[2]。低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）被認為是腫瘤發生發展過程中關鍵的基因之一，與腫瘤的代謝變化、血管形成、侵襲、轉移及耐藥性有關，最終導致臨床預后不佳[3]。迄今（至 2018 年）為止，也有眾多試驗表明，HIF-1α 與肝細胞肝癌的預后密切相關[4-5]。在乏氧狀態下，低氧誘導因子 HIF-1α 是否可使肝癌細胞轉化為肝癌干細胞，從而促進肝癌的增殖和轉移。為此，本研究通過體外實驗的方法，以驗證乏氧環境下 HIF-1α 對肝癌細胞去分化、增殖力和侵襲力變化的影響，從而為臨床肝癌的治療提供有力的理論依據及新的思路。
1 材料與方法
1.1 實驗材料、主要試劑和設備
人肝癌細胞 HepG2 購買自中科院細胞庫，DMEM 高糖培養液購自美國 Hyclone 公司；胎牛血清購自 Gibco 公司；免疫磁珠分選所用試劑均購自德國美天旎公司；各種 PCR 引物由上海生物工程有限公司提供；Trizol、cDNA 逆轉錄試劑及 SYBR Master Mix 均購自美國 Invitrogen 公司；HIF-1α 小干擾 RNA（siHIF-1α）由廣州銳博生物有限公司設計并合成；HIF-1α 抗體購自美國 Novus 公司；Anti-CD133、Anti-CD44 及 Anti-CD90 抗體均購自英國 abcam 公司；內參抗體 β-actin 購自武漢三鷹生物有限公司。
1.2 細胞培養
人肝癌 HepG2 細胞用含有 10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培養液培養，常氧下置于 37 °C、5% CO2 的恒溫培養箱培養。為了模擬腫瘤內部乏氧微環境，將細胞置放于 37 °C、5% CO2 及 1% O2 的低氧箱中培養。
1.3 免疫磁珠分選
常氧條件下取對數生長期細胞 2×107個，以 buffer 洗滌后，加入 100 μL FcR 阻斷劑和 100 μL CD133 MicroBeads，充分混勻，4 °C 孵育 30 min 后，以 buffer 洗滌，上柱，收集流下的細胞即為 CD133 陰性細胞。
1.4 siRNA 轉染細胞
將篩選后的 CD133 陰性細胞按 4×105個/mL 的密度接種于 6 孔培養板中，待細胞長至 80% 融合時，按照 PofectaⅡline2000說明書將 siRNA 片段轉染于細胞中，為轉染組；未轉染 siRNA 片段的細胞為對照組，每組均設 5 個復孔，6 h 后換新鮮培養液繼續培養至 48 h 后，進行下一步實驗。
1.5 MTT 法檢測細胞增殖能力
取上述轉染組及空白對照組的 HepG2 細胞接種于 96 孔板中，按不同實驗條件，包括常氧和乏氧分別處理 8、16、24、32 及 48 h，加入 MTT 孵育 4 h 后，再加入 150 μL 二甲基亞砜（DMSO），用平板搖床搖勻振蕩 10 min，待細胞完全溶解后，放入自動酶標儀于 490 nm 波長處讀數，并記錄吸光度（A）值，實驗重復 3 次。
1.6 Transwell 小室實驗檢測細胞遷徙能力
取上述轉染組及空白對照組的 HepG2 細胞，分別于常氧和乏氧環境下培養 48 h 后，將 4 組的細胞分別調整至 2×105個/mL 后向 Transwell 上室中加入 400 μL 細胞懸液，在下室的 24 孔板中加入含 20% FBS 的 DMEM 600 μL 作為趨化因子。24 h 后用棉簽擦去上室細胞，將下室細胞用 4% 多聚甲醛固定、行 0.1% 結晶紫染色 15 min，于光鏡下隨機選取 5 個視野，計數后取其平均值。
1.7 克隆形成實驗
取上述轉染組及空白對照組的 HepG2 細胞接種于 6 孔板中，含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基培養 10～14 d，按不同實驗條件分別在常氧和乏氧環境下培養 48 h，以 4% 多聚甲醛固定，0.1% 結晶紫染色 15 min，計數、拍照。所有實驗獨立重復 3 次。
1.8 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測蛋白表達
取上述轉染組及對照組的 HepG2 細胞，分別于常氧和乏氧環境下培養 48 h 后，獲得目的細胞。目的細胞經 PBS 清洗后，加入含有蛋白酶抑制劑的 SDS 裂解細胞，沸水浴 10 min，12 000 g 離心 15 min。經蛋白定量后，每孔上樣量為 30 μg，以 β-actin 為內參，使用 Anti-HIF-1α、Anti-CD133、Anti-CD44 及 Anti-CD90 抗體檢測目的蛋白，以 ECL 法曝光顯像。
1.9 反轉錄實時定量聚合酶聯反應（RT-PCR）法檢測 mRNA 的表達
取上述轉染組及對照組的 HepG2 細胞，分別于常氧和乏氧環境下培養 48 h 后，以 Trizol 法提取 4 組細胞的總 RNA，測定 RNA 的濃度及純度，逆轉錄得到 cDNA。置于熒光定量 PCR 儀進行擴增，反應體系為 20 μL（具體見試劑盒說明書）。反應條件：預變性 95 °C 60 s，變性 95 °C 30 s，退火 58 °C 30 s，延伸 72 °C 30 s，共擴增 40 個循環。以 β-actin 基因作為內參，檢測 HIF-1α mRNA、CD133 mRNA、CD44 mRNA 及 CD90 mRNA 的表達。采用 ABI 7900HT 定量 PCR 軟件系統，對結果進行分析。
1.10 統計學方法
實驗結果采用 SPSS 17.0 進行分析。計量資料以均數±標準差（
±s）表示，組與組之間的比較采用方差分析方法，兩兩比較采用 LSD-t 檢驗方法。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 HIF-1α 對肝癌 HepG2 細胞增殖和遷移情況的影響
通過 MTT 法檢驗細胞的增殖情況，結果顯示：總體而言，4 組細胞的細胞增殖率隨乏氧時間延長而增高；24 h 及以后，與空白對照組相比，經 siRNA-HIF-1α 轉染后，轉染常氧組和乏氧組的細胞增殖率降低（P<0.05）。平板克隆實驗結果顯示：乏氧培養后，細胞形成克隆數較同類型細胞常氧培養明顯增多，轉染常氧組與轉染乏氧組、空白對照常氧組與空白對照乏氧組比較差異均有統計學意義（P<0.05）；且相同乏氧條件下，轉染乏氧組的細胞形成克隆數明顯少于空白對照乏氧組（F=196.495，P<0.05）。Transwell 小室實驗結果顯示：乏氧培養后，空白對照組遷移至下室的細胞數高于其余 3 組（P<0.05）；乏氧培養后，轉染組遷移至下室的細胞數高于轉染常氧組和空白對照常氧組（P<0.05）。具體見圖 1a-1d。
圖1
示 4 組細胞的 MTT、Transwell 小室遷移實驗、克隆形成實驗、蛋白免疫印跡及 PCR 實驗結果
a：4 組細胞的增殖曲線，24 h 及以后，空白對照常氧組的
2.2 HIF-1α 及腫瘤干細胞標志物的蛋白及其 mRNA 的表達檢測結果
為了驗證 HIF-1α 與肝癌細胞逆向分化為肝癌干細胞的關系，在乏氧環境下使用 siRNA-HIF-1α 質粒轉染人肝癌 HepG2 細胞，從而抑制 HIF-1α 基因的表達。通過 Western blot 及 PCR 方法檢測 4 組細胞中 HIF-1α 及肝癌干細胞標志物（CD133、CD90 和 CD44）蛋白及其 mRNA 的表達情況。結果顯示：① HIF-1α：空白對照常氧組細胞中 HIF-1α 的蛋白及其 mRNA 表達水平均高于轉染常氧組及乏氧組（P<0.05），且空白對照乏氧組細胞中 HIF-1α 蛋白及其 mRNA 的表達水平高于其余 3 組（P<0.05）；② CD133 和 CD90：空白對照乏氧組細胞中 CD133 和 CD90 蛋白及其 mRNA 的表達水平均高于其余 3 組（P<0.05），且轉染乏氧組高于轉染常氧組和空白對照常氧組（P<0.05）；③ CD44：空白對照乏氧組細胞中 CD44 蛋白及其 mRNA 的表達水平高于其余 3 組（P<0.05），但其余 3 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 1e-1m。
3 討論
乏氧治療是目前治療肝癌的主要的非手術方法之一[2, 6]。其治療機理是栓堵住腫瘤的營養血管，導致腫瘤細胞因缺血缺氧而壞死，從而達到治療的目的[7]。該方法雖然早期療效顯著，但遠期效果并不理想[2, 8]。有研究[9]證實，經肝動脈栓塞（TAE）后肝癌局部缺氧微環境會導致產生一些具促進腫瘤細胞生物行為向惡性方向轉化的活性物質，如 HIF-1α 等，使殘存的癌細胞具有更強的增殖和侵襲能力[10-11]。HIF-1α 是人體組織在缺氧環境下維持穩態的主要介質之一[12]，通過增強 β-catenin 的活化和下游效應物淋巴樣增強因子-1（LEF-1）和轉錄因子-1（TCF-1）的表達來調節缺氧胚胎干細胞 Wnt/β-catenin 信號的轉導，使腫瘤細胞得以維持其干細胞特性和生物學惡性[3]。
Wnt 信號通路蛋白是一組細胞內信號蛋白，在腫瘤細胞生物學惡性的維持中作用明確[13]。通過與和它們受體復合體相互作用的 Wnt 配體結合而激活下游相關效應物，使 β-catenin 活化并進入細胞核內與 T 細胞因子家族（TCF4）的轉錄因子結合，然后轉錄 Cylin D1、c-Myc、Survivin 等目標基因，使腫瘤細胞的干細胞特性和生物學惡性得以維持[14]。癌細胞的增殖力及侵襲力最能反映其生物學惡性行為[15-16]。本實驗發現，正常乏氧培養后，即空白對照乏氧組與空白對照常氧組相比，肝癌 HepG2 細胞的增殖能力和遷移能力明顯增強；但在降低了細胞中 HIF-1α 基因的表達后，即轉染乏氧組與空白對照乏氧組相比，細胞增殖力及遷移力也有了明顯的下降，進而說明，HIF-1α 可促進肝癌 HepG2 細胞維持其生物學惡性并增加其惡性潛能，其機制可能與參與 Wnt 信號通路的轉導有關。
癌細胞的逆向分化是其惡性表型增加的重要機制，目前有研究[17]認為，該機制與癌細胞獲得某些干細胞樣表型有關。而乏氧和 HIF-1α 是干細胞分化的關鍵調節因子[18-19]，其中 HIF-1α 專門調節所有與干細胞自我更新和分化過程相關的基因和轉錄因子[20]，通過與細胞內信號傳導蛋白的相互作用，使干細胞處于未分化狀態，從而增強其惡性潛能[21]。
近些年，在對肝癌進行的相關研究報道中，已支持了肝癌干細胞這一理論：包括 CD13、CD44、CD24、CD90、CD133、EpCAM、DLK1、ALDH1 等在內的蛋白均被證實可作為表面標志物來鑒別肝癌干細胞[22]。本實驗通過檢測 CD133、CD44、CD90 等干細胞表面標志物表達量來檢測 HepG2 細胞中肝癌干細胞的數目，發現正常乏氧培養后（即空白對照乏氧組）肝癌干細胞的數目明顯增加；降低 HIF-1α 的表達后，對應的蛋白和 mRNA 表達均比同條件下的空白對照組降低，其變化趨勢與 HIF-1α 的表達變化趨勢基本保持一致。這一結果與 Vadde 等[23]在探索 HIF-1α 對于結腸癌細胞惡性和干細胞特性維持的作用研究的結論基本吻合。由此可見，乏氧環境下，HIF-1α 對肝癌細胞逆向分化為肝癌干細胞有著正性作用，其可促使肝癌細胞逆向分化為肝癌干細胞。
缺氧在發育、生理過程和疾病發生、進展中起著重要的作用，它的主要介質是 HIF-1α[24]。HIF-1α 可通過參與 Wnt 信號通路的轉導[25]，使癌細胞維持干細胞特性和生物學惡性，這一機制已在其他如結腸癌等實體腫瘤中得到證實[3, 23]，但在肝細胞肝癌中相關報道較為少見。肝癌細胞在乏氧環境中發生去分化，逆向分化為肝癌干細胞，是癌細胞侵襲及轉移的一個重要原因。本實驗結果表明，HIF-1α 對肝癌細胞發生去分化有著明確的正向影響，可促使肝癌細胞逆向分化為肝癌干細胞，但其發生的機制目前還尚未明確。在今后的研究中，我們將著重探索 HIF-1α 在腫瘤發生過程中對干細胞功能調節的途徑及機制，為臨床治療肝細胞肝癌提供有效的治療策略。
原發性肝癌患者中有 91.5% 為肝細胞肝癌，占我國癌癥死亡人數的第 3 位，是目前較常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害著人們的健康[1]。肝細胞肝癌作為高侵襲性的腫瘤，其增殖和轉移是導致肝癌臨床治療效果差和治愈率低的主要原因[2]。低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）被認為是腫瘤發生發展過程中關鍵的基因之一，與腫瘤的代謝變化、血管形成、侵襲、轉移及耐藥性有關，最終導致臨床預后不佳[3]。迄今（至 2018 年）為止，也有眾多試驗表明，HIF-1α 與肝細胞肝癌的預后密切相關[4-5]。在乏氧狀態下，低氧誘導因子 HIF-1α 是否可使肝癌細胞轉化為肝癌干細胞，從而促進肝癌的增殖和轉移。為此，本研究通過體外實驗的方法，以驗證乏氧環境下 HIF-1α 對肝癌細胞去分化、增殖力和侵襲力變化的影響，從而為臨床肝癌的治療提供有力的理論依據及新的思路。
1 材料與方法
1.1 實驗材料、主要試劑和設備
人肝癌細胞 HepG2 購買自中科院細胞庫，DMEM 高糖培養液購自美國 Hyclone 公司；胎牛血清購自 Gibco 公司；免疫磁珠分選所用試劑均購自德國美天旎公司；各種 PCR 引物由上海生物工程有限公司提供；Trizol、cDNA 逆轉錄試劑及 SYBR Master Mix 均購自美國 Invitrogen 公司；HIF-1α 小干擾 RNA（siHIF-1α）由廣州銳博生物有限公司設計并合成；HIF-1α 抗體購自美國 Novus 公司；Anti-CD133、Anti-CD44 及 Anti-CD90 抗體均購自英國 abcam 公司；內參抗體 β-actin 購自武漢三鷹生物有限公司。
1.2 細胞培養
人肝癌 HepG2 細胞用含有 10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培養液培養，常氧下置于 37 °C、5% CO2 的恒溫培養箱培養。為了模擬腫瘤內部乏氧微環境，將細胞置放于 37 °C、5% CO2 及 1% O2 的低氧箱中培養。
1.3 免疫磁珠分選
常氧條件下取對數生長期細胞 2×107個，以 buffer 洗滌后，加入 100 μL FcR 阻斷劑和 100 μL CD133 MicroBeads，充分混勻，4 °C 孵育 30 min 后，以 buffer 洗滌，上柱，收集流下的細胞即為 CD133 陰性細胞。
1.4 siRNA 轉染細胞
將篩選后的 CD133 陰性細胞按 4×105個/mL 的密度接種于 6 孔培養板中，待細胞長至 80% 融合時，按照 PofectaⅡline2000說明書將 siRNA 片段轉染于細胞中，為轉染組；未轉染 siRNA 片段的細胞為對照組，每組均設 5 個復孔，6 h 后換新鮮培養液繼續培養至 48 h 后，進行下一步實驗。
1.5 MTT 法檢測細胞增殖能力
取上述轉染組及空白對照組的 HepG2 細胞接種于 96 孔板中，按不同實驗條件，包括常氧和乏氧分別處理 8、16、24、32 及 48 h，加入 MTT 孵育 4 h 后，再加入 150 μL 二甲基亞砜（DMSO），用平板搖床搖勻振蕩 10 min，待細胞完全溶解后，放入自動酶標儀于 490 nm 波長處讀數，并記錄吸光度（A）值，實驗重復 3 次。
1.6 Transwell 小室實驗檢測細胞遷徙能力
取上述轉染組及空白對照組的 HepG2 細胞，分別于常氧和乏氧環境下培養 48 h 后，將 4 組的細胞分別調整至 2×105個/mL 后向 Transwell 上室中加入 400 μL 細胞懸液，在下室的 24 孔板中加入含 20% FBS 的 DMEM 600 μL 作為趨化因子。24 h 后用棉簽擦去上室細胞，將下室細胞用 4% 多聚甲醛固定、行 0.1% 結晶紫染色 15 min，于光鏡下隨機選取 5 個視野，計數后取其平均值。
1.7 克隆形成實驗
取上述轉染組及空白對照組的 HepG2 細胞接種于 6 孔板中，含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基培養 10～14 d，按不同實驗條件分別在常氧和乏氧環境下培養 48 h，以 4% 多聚甲醛固定，0.1% 結晶紫染色 15 min，計數、拍照。所有實驗獨立重復 3 次。
1.8 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測蛋白表達
取上述轉染組及對照組的 HepG2 細胞，分別于常氧和乏氧環境下培養 48 h 后，獲得目的細胞。目的細胞經 PBS 清洗后，加入含有蛋白酶抑制劑的 SDS 裂解細胞，沸水浴 10 min，12 000 g 離心 15 min。經蛋白定量后，每孔上樣量為 30 μg，以 β-actin 為內參，使用 Anti-HIF-1α、Anti-CD133、Anti-CD44 及 Anti-CD90 抗體檢測目的蛋白，以 ECL 法曝光顯像。
1.9 反轉錄實時定量聚合酶聯反應（RT-PCR）法檢測 mRNA 的表達
取上述轉染組及對照組的 HepG2 細胞，分別于常氧和乏氧環境下培養 48 h 后，以 Trizol 法提取 4 組細胞的總 RNA，測定 RNA 的濃度及純度，逆轉錄得到 cDNA。置于熒光定量 PCR 儀進行擴增，反應體系為 20 μL（具體見試劑盒說明書）。反應條件：預變性 95 °C 60 s，變性 95 °C 30 s，退火 58 °C 30 s，延伸 72 °C 30 s，共擴增 40 個循環。以 β-actin 基因作為內參，檢測 HIF-1α mRNA、CD133 mRNA、CD44 mRNA 及 CD90 mRNA 的表達。采用 ABI 7900HT 定量 PCR 軟件系統，對結果進行分析。
1.10 統計學方法
實驗結果采用 SPSS 17.0 進行分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組與組之間的比較采用方差分析方法，兩兩比較采用 LSD-t 檢驗方法。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 HIF-1α 對肝癌 HepG2 細胞增殖和遷移情況的影響
通過 MTT 法檢驗細胞的增殖情況，結果顯示：總體而言，4 組細胞的細胞增殖率隨乏氧時間延長而增高；24 h 及以后，與空白對照組相比，經 siRNA-HIF-1α 轉染后，轉染常氧組和乏氧組的細胞增殖率降低（P<0.05）。平板克隆實驗結果顯示：乏氧培養后，細胞形成克隆數較同類型細胞常氧培養明顯增多，轉染常氧組與轉染乏氧組、空白對照常氧組與空白對照乏氧組比較差異均有統計學意義（P<0.05）；且相同乏氧條件下，轉染乏氧組的細胞形成克隆數明顯少于空白對照乏氧組（F=196.495，P<0.05）。Transwell 小室實驗結果顯示：乏氧培養后，空白對照組遷移至下室的細胞數高于其余 3 組（P<0.05）；乏氧培養后，轉染組遷移至下室的細胞數高于轉染常氧組和空白對照常氧組（P<0.05）。具體見圖 1a-1d。
圖1
示 4 組細胞的 MTT、Transwell 小室遷移實驗、克隆形成實驗、蛋白免疫印跡及 PCR 實驗結果
a：4 組細胞的增殖曲線，24 h 及以后，空白對照常氧組的
2.2 HIF-1α 及腫瘤干細胞標志物的蛋白及其 mRNA 的表達檢測結果
為了驗證 HIF-1α 與肝癌細胞逆向分化為肝癌干細胞的關系，在乏氧環境下使用 siRNA-HIF-1α 質粒轉染人肝癌 HepG2 細胞，從而抑制 HIF-1α 基因的表達。通過 Western blot 及 PCR 方法檢測 4 組細胞中 HIF-1α 及肝癌干細胞標志物（CD133、CD90 和 CD44）蛋白及其 mRNA 的表達情況。結果顯示：① HIF-1α：空白對照常氧組細胞中 HIF-1α 的蛋白及其 mRNA 表達水平均高于轉染常氧組及乏氧組（P<0.05），且空白對照乏氧組細胞中 HIF-1α 蛋白及其 mRNA 的表達水平高于其余 3 組（P<0.05）；② CD133 和 CD90：空白對照乏氧組細胞中 CD133 和 CD90 蛋白及其 mRNA 的表達水平均高于其余 3 組（P<0.05），且轉染乏氧組高于轉染常氧組和空白對照常氧組（P<0.05）；③ CD44：空白對照乏氧組細胞中 CD44 蛋白及其 mRNA 的表達水平高于其余 3 組（P<0.05），但其余 3 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 1e-1m。
3 討論
乏氧治療是目前治療肝癌的主要的非手術方法之一[2, 6]。其治療機理是栓堵住腫瘤的營養血管，導致腫瘤細胞因缺血缺氧而壞死，從而達到治療的目的[7]。該方法雖然早期療效顯著，但遠期效果并不理想[2, 8]。有研究[9]證實，經肝動脈栓塞（TAE）后肝癌局部缺氧微環境會導致產生一些具促進腫瘤細胞生物行為向惡性方向轉化的活性物質，如 HIF-1α 等，使殘存的癌細胞具有更強的增殖和侵襲能力[10-11]。HIF-1α 是人體組織在缺氧環境下維持穩態的主要介質之一[12]，通過增強 β-catenin 的活化和下游效應物淋巴樣增強因子-1（LEF-1）和轉錄因子-1（TCF-1）的表達來調節缺氧胚胎干細胞 Wnt/β-catenin 信號的轉導，使腫瘤細胞得以維持其干細胞特性和生物學惡性[3]。
Wnt 信號通路蛋白是一組細胞內信號蛋白，在腫瘤細胞生物學惡性的維持中作用明確[13]。通過與和它們受體復合體相互作用的 Wnt 配體結合而激活下游相關效應物，使 β-catenin 活化并進入細胞核內與 T 細胞因子家族（TCF4）的轉錄因子結合，然后轉錄 Cylin D1、c-Myc、Survivin 等目標基因，使腫瘤細胞的干細胞特性和生物學惡性得以維持[14]。癌細胞的增殖力及侵襲力最能反映其生物學惡性行為[15-16]。本實驗發現，正常乏氧培養后，即空白對照乏氧組與空白對照常氧組相比，肝癌 HepG2 細胞的增殖能力和遷移能力明顯增強；但在降低了細胞中 HIF-1α 基因的表達后，即轉染乏氧組與空白對照乏氧組相比，細胞增殖力及遷移力也有了明顯的下降，進而說明，HIF-1α 可促進肝癌 HepG2 細胞維持其生物學惡性并增加其惡性潛能，其機制可能與參與 Wnt 信號通路的轉導有關。
癌細胞的逆向分化是其惡性表型增加的重要機制，目前有研究[17]認為，該機制與癌細胞獲得某些干細胞樣表型有關。而乏氧和 HIF-1α 是干細胞分化的關鍵調節因子[18-19]，其中 HIF-1α 專門調節所有與干細胞自我更新和分化過程相關的基因和轉錄因子[20]，通過與細胞內信號傳導蛋白的相互作用，使干細胞處于未分化狀態，從而增強其惡性潛能[21]。
近些年，在對肝癌進行的相關研究報道中，已支持了肝癌干細胞這一理論：包括 CD13、CD44、CD24、CD90、CD133、EpCAM、DLK1、ALDH1 等在內的蛋白均被證實可作為表面標志物來鑒別肝癌干細胞[22]。本實驗通過檢測 CD133、CD44、CD90 等干細胞表面標志物表達量來檢測 HepG2 細胞中肝癌干細胞的數目，發現正常乏氧培養后（即空白對照乏氧組）肝癌干細胞的數目明顯增加；降低 HIF-1α 的表達后，對應的蛋白和 mRNA 表達均比同條件下的空白對照組降低，其變化趨勢與 HIF-1α 的表達變化趨勢基本保持一致。這一結果與 Vadde 等[23]在探索 HIF-1α 對于結腸癌細胞惡性和干細胞特性維持的作用研究的結論基本吻合。由此可見，乏氧環境下，HIF-1α 對肝癌細胞逆向分化為肝癌干細胞有著正性作用，其可促使肝癌細胞逆向分化為肝癌干細胞。
缺氧在發育、生理過程和疾病發生、進展中起著重要的作用，它的主要介質是 HIF-1α[24]。HIF-1α 可通過參與 Wnt 信號通路的轉導[25]，使癌細胞維持干細胞特性和生物學惡性，這一機制已在其他如結腸癌等實體腫瘤中得到證實[3, 23]，但在肝細胞肝癌中相關報道較為少見。肝癌細胞在乏氧環境中發生去分化，逆向分化為肝癌干細胞，是癌細胞侵襲及轉移的一個重要原因。本實驗結果表明，HIF-1α 對肝癌細胞發生去分化有著明確的正向影響，可促使肝癌細胞逆向分化為肝癌干細胞，但其發生的機制目前還尚未明確。在今后的研究中，我們將著重探索 HIF-1α 在腫瘤發生過程中對干細胞功能調節的途徑及機制，為臨床治療肝細胞肝癌提供有效的治療策略。
