引用本文： 王藝超, 向利娟, 周萍, 趙婉君, 朱精強. 伴乳頭狀癌核特征的非浸潤性濾泡性甲狀腺腫瘤的分子研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(1): 110-115. doi: 10.7507/1007-9424.201807051 復制
甲狀腺癌為內分泌系統最常見的惡性腫瘤疾病。近年來，其發病率在全球呈遞增趨勢[1-3]。甲狀腺癌常見的病理學類型包括乳頭狀癌、濾泡狀癌、髓樣癌和未分化癌[4]。2017 年，世界衛生組織（World Health Organization，WHO）對內分泌器官腫瘤的分類進行了更新，其中新提出了伴乳頭狀癌核特征的非浸潤性濾泡性甲狀腺腫瘤（noninvasive follicular thyroid neoplasm with papillary-like nuclear features，NIFTP）這一術語[5]。目前，NIFTP 的確診仍然依靠完整切除腫瘤后的組織病理學診斷。術前甲狀腺結節細針穿刺的細胞病理學檢查難以區分 NIFTP 和甲狀腺濾泡性腫瘤[6-8]。近年來，隨著各種新的分子生物學技術的應用，已有一些遺傳變異被發現與甲狀腺癌的發病顯著相關。然而， NIFTP 的分子異常表達和生物學機制尚未闡明。因此，進一步研究更多參與到 NIFTP 發生發展中的分子改變及其致病機理，對 NIFTP 的診斷和鑒別診斷至關重要。目前關于 NIFTP 相關的分子研究正處于初步階段。因此，筆者復習了最新研究報道，就 NIFTP 相關的分子研究作一綜述。
1 NIFTP 的發展史和病理學診斷標準
1.1 NIFTP 的發展簡史
1960 年，Lindsay 最早報道了濾泡亞型甲狀腺乳頭狀癌（follicular variant of papillary thyroid carcinoma，FVPTC），其包含有濾泡狀生長結構、類似乳頭狀癌的核特征，伴有頸部淋巴結轉移[9]。之后陸續有越來越多的研究者報道了 FVPTC 的臨床和病理學特征[10-11]。FVPTC 包含浸潤性和包裹性 2 個亞型，根據是否伴有包膜和（或）血管浸潤，將包裹性 FVPTC 進一步分為非浸潤性包裹性 FVPTC 和浸潤性包裹性 FVPTC，其生物學行為分別類似于甲狀腺濾泡腺瘤和甲狀腺濾泡腺癌[12]。盡管已有大量研究報道認為包裹性 FVPTC 的生物行為呈惰性，但這類患者仍然接受過度治療（甲狀腺全切除伴或不伴術后放射性碘治療）[13-14]。2016 年，以 Nikiforov 等[15]為首的國際多學科工作組對非浸潤性包裹性 FVPTC 和浸潤性包裹性 FVPTC 的臨床病理學特征及術后隨訪進行了重新評估和比較，發現非浸潤性包裹性 FVPTC 病變具有良好的生物學行為和極低的不良轉歸風險。故該工作組[15]認為，用“癌”來稱謂非浸潤性包裹性 FVPTC 是不合適的，推薦用 NIFTP 術語替代非浸潤性包裹性 FVPTC，治療方案推薦腺葉切除術或僅行甲狀腺次全切除術，從而避免甲狀腺全切除所致的潛在的并發癥、額外費用和放射性碘治療，減輕患者的心理壓力和經濟負擔。上述 NIFTP 相關內容同時發表在JAMA Oncology雜志上。隨后的 2017 版 WHO 內分泌器官腫瘤分類中更新了甲狀腺腫瘤的分類，新增加了 NIFTP 病種[5]。
1.2 NIFTP 的組織病理學診斷標準
NIFTP 的組織病理診斷具有嚴格的納入和排除標準[5, 15]。納入標準包括：首先具有乳頭狀癌核特征，該特征主要通過 3 個核參數評估，包括核形狀與大小（增大、重疊、擁擠與拉長）、核膜不規則（核溝和核內假包涵體）及染色質特點（染色質透明和毛玻璃樣變）。3 項中具備任何一項，則記為 1 分，如評分為 2 或 3 分，則滿足 NIFTP 的細胞核評分標準。其次，擁有完整包膜或腫瘤邊界清楚。最后，具有濾泡樣生長模式，且小于 1% 的乳頭狀結構，小于 30% 的實性、小梁狀或島狀生長模式。排除標準為：① 無淋巴管血管或包膜浸潤；② 無砂粒體；③ 無腫瘤性壞死；④ 無高有絲分裂活性（每 10 個高倍視野下有絲分裂小于 3 個）。
2 NIFTP 的分子特征
2.1 NIFTP 相關的基因突變
Nikiforov 工作組[15]評估了 210 例包裹性 FVPTC（109 例非浸潤性包裹性 FVPTC 和 101 例浸潤性包裹性 FVPTC）的臨床病理學特征和術后隨訪（長達 10～26 年），提出以 NIFTP 的稱謂替代非浸潤性包裹性 FVPTC。工作組通過下一代測序技術（商品名：ThyroSeq v2 panel）檢測了 27 例 NIFTP 組織標本的基因突變，結果顯示：8 例為鼠肉瘤病毒致癌基因同源物（rat sarcoma viral oncogene homolog，RAS）突變，1 例為 Raf 激酶蛋白的 β 異構體（B-type RAF，BRAFK601E）突變，6 例見 PPARG 基因融合，6 例見 THADA 基因融合，6 例未檢出突變[15]。因此，該研究團隊認為，RAS 是 NIFTP 中最常見的突變，NIFTP 無 BRAFV600E突變。NIFTP 的高 RAS 突變率與甲狀腺濾泡性腺瘤、甲狀腺濾泡狀癌和包裹性 FVPTC 相似。因此，推測 NIFTP 可能代表濾泡性腫瘤的良性對應物或浸潤性包裹性 FVPTC 的前體。Jiang 等[16]回顧性研究了 302 例甲狀腺結節標本，其中 25 例經過術后組織病理學檢查確診為 FVPTC；經過嚴格的 NIFTP 診斷標準，8 例診斷為 NIFTP。其中 4 例 NIFTP 通過微陣列技術（商品名：GEC，該技術可以檢測 167 種基因的信使 RNA 表達，根據基因表達譜將腫瘤分為良性或可疑惡性）分析基因突變。結果顯示：4 例均為可疑惡性。另外 4 例 NIFTP 通過下一代測序技術發現 3 例存在 RAS 突變，1 例發生 RAS 和端粒酶逆轉錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）突變[16]。Bizzarro 等[17]通過定量聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，PCR）法檢測了 37 例 NIFTP、24 例浸潤性 FVPTC、20 例甲狀腺濾泡性腺瘤和 40 例甲狀腺乳突狀癌（papillary thyroid carcinoma， PTC） 中的 BRAFV600E的突變情況，結果發現，NIFTP 和甲狀腺濾泡性腺瘤組中無 BRAFV600E突變，浸潤性 FVPTC 組中的 BRAFV600E突變率為 38.4%，PTC 組中 BRAFV600E的突變率為 68.7%；BRAFV600E在 NIFTP 與 PTC 組中的突變率比較差異具有統計學意義，而 BRAFV600E在 NIFTP 和浸潤性 FVPTC 組中的突變率比較差異無統計學意義。
此外，Paulson 等[18]的一項回顧性研究分析了 199 例甲狀腺癌患者的病理及分子特征，結果顯示：27 例甲狀腺癌存在 RAS 突變，其中有 16 例 NIFTP（NIFTP 的 RAS 突變率為 59%）和 4 例 浸潤性 FVPTC，故認為該研究中 50% 以上的含有 RAS 突變的甲狀腺癌患者應被分類為 NIFTP。Giannini 等[19]通過 NanoString nCounter 分析系統（該系統可以檢測 75 種基因的信使 RNA 的表達量）檢測了 26 例 NIFTP、18 例甲狀腺濾泡性腺瘤和 18 例浸潤性 FVPTC 的基因表達譜，同時采用 PCR 進行 BRAFV600E和 RAS 突變的檢測。根據基因的表達譜等情況將研究對象分為 2 個聚類。NIFTP 樣品同時被分在 2 個聚類中，因為一半的 NIFTP 與甲狀腺濾泡腺瘤的表達譜類似，另一半 NIFTP 的表達譜具有與浸潤性 FVPTC 相似的表達譜。結果發現，26 例 NIFTP 中 13 例存在分子突變：1 例 BRAFV600E突變、3 例 BRAFK601E突變及 9 例 RAS 突變。該研究者[19]分析，NIFTP 中出現這 1 例 BRAFV600E突變的原因可能跟病理學家判定包膜/血管侵犯的技術限制有關，另外極少數 NIFTP 可能存在 BRAFV600E突變。該研究同時采用包含了 27 個基因模型的分類器將 26 例 NIFTP 分為 2 組：類似浸潤性 FVPTC 組（13 例表現為 BRAF/RAS 突變）和類似甲狀腺濾泡性腺瘤組（13 例包含野生基因型）。研究者認為：含有 BRAF/RAS 突變的 NIFTP 表現出類似惡性腫瘤的表達譜，支持了之前 Nikiforov 的假設（NIFTP 可能代表浸潤性 FVPTC 的前體）；相反，野生型 NIFTP 具有濾泡性腺瘤樣的基因表達譜，可能代表甲狀腺濾泡性腫瘤的良性對應物。
Zhao 等[20]采用下一代測序新技術檢測了 NIFTP 和浸潤性 FVPTC 的基因突變，該技術可以檢測基因重排，以及單核苷酸的變異、插入、缺失和拷貝數變化。納入研究的 97 例樣本包括 50 例 NIFTP 和 47 例浸潤性 FVPTC。NIFTP 組中 BRAFV600E突變率為 2%，RAS 突變率為 54%，基因易位率為 4.0%；浸潤性 FVPTC 組中 BRAFV600E突變率為 36.0%，RAS 突變率為 32%，基因易位率為 4.0%。2 組之間比較差異具有統計學意義。Cho 等[21]通過定量 PCR 法檢測了 NIFTP 和浸潤性包裹性 FVPTC 的基因突變，按照 NIFTP 的組織學病理診斷標準里面乳頭狀結構小于 1%的標準，共納入了 105 例 NIFTP 和 47 例浸潤性包裹性 FVPTC，其結果顯示，NIFTP 組中的 BRAFV600E突變率為 10%，野生基因型占 90%；浸潤性包裹性 FVPTC 中 BRAFV600E的突變率為 2%，野生基因型占 96%，2 組之間的 BRAFV600E突變率和野生基因型情況比較差異均無統計學意義；當 NIFTP 病理學診斷標準里面的乳頭狀結構占比定義為 0 時，共納入 95 例 NIFTP 和 45 例浸潤性包裹性 FVPTC，2 組中皆未見 BRAFV600E突變，此時NIFTP 組中 RAS 的突變率為 47%（42/89），浸潤性包裹性 FVPTC 中 RAS 的突變率為 47%（18/38），2 組之間的 RAS 突變率比較差異無統計學意義。
韓國學者 Lee 等[22]通過 PCR 檢測了 687 例甲狀腺細針穿刺抽吸（fine-needle aspiration，FNA）標本中的基因突變情況，結果發現，在 21 例 NIFTP 中，12 例存在 RAS 突變，5 例發生 BRAFV600E突變，1 例發生 BRAFK601E突變；575 例經典型 PTC 中，RAS 突變率為 4%，BRAF 突變率為 86.8%。研究者進一步分析了 BRAF/RAS 在 NIFTP 和浸潤性包裹性 FVPTC 2 組中的差異表達情況，結果顯示：47 例浸潤性包裹性 FVPTC 組中，BRAF 突變率為 40.4%，RAS 突變率為 44.7%；21 例 NIFTP 組中，BRAF 突變率為 23.8%，RAS 突變率為 57.1%。2 組間的 BRAF 突變率和 RAS 突變率比較差異無統計學意義。該研究者將 NIFTP 中的 BRAFV600E高突變率歸因為人種差異。為了驗證韓國人群中 NIFTP 是否存在 BRAFV600E高突變率，近期韓國學者 Kim 等[23]采用 DNA 直接測序法，對 32 例 NIFTP 和 48 例浸潤性包裹性 FVPTC 的組織標本進行了基因檢測。結果顯示，NIFTP 組中 BRAFV600E突變率為 0，RAS 突變率為 47%；浸潤性包裹性 FVPTC 組中的 BRAFV600E突變率為 8.0%，RAS 突變率為 46%。2 組之間的 BRAFV600E突變率和 RAS 突變率比較差異無統計學意義。該研究者推測 Lee 等[22]的研究中的 BRAFV600E高突變率可能與 NIFTP 的診斷標準不嚴格有關，并認為 RAS 突變的存在對術前鑒別 NIFTP 和浸潤性包裹性 FVPTC 無益。Strickland 等[24]對術前 24 例 FNA 甲狀腺結節標本和 36 例經典型 PTC 術中切除的標本分別通過基因檢測面板和下一代測序技術檢測其分子突變。結果顯示，36 例經典型 PTC 中發現 27 例 BRAFV600E突變；術前 FNA 細胞學病理結果傾向 NIFTP/FVPTC 的 8 例患者中，最終經組織病理學確診有 5 例 NIFTP（1 例為 RAS 突變，4 例為野生基因型），1 例經典型 PTC（出現 BRAFV600E突變），1 例 FVPTC（野生基因型），1 例甲狀腺濾泡性腺瘤（野生基因型）。研究結果表明，在術前 FNA 細胞形態學不能確定 NIFTP/FVPTC 或經典型 PTC 的情況下，采用分子檢測可能是有價值的。du Jour 等[25]回顧性分析了 50 例既往診斷為 FVPTC 的患者的臨床病理學資料，遵循 NIFTP 的嚴格診斷標準重新評判病理結果，結果 17 例診斷為 NIFTP，32 例診斷為 FVPTC，1 例診斷為經典型 PTC；17 例 NIFTP 中未見 BRAFV600E突變，5 例 FVPTC 檢測出 BRAFV600E。NIFTP 相關的基因突變研究結果詳見表 1。
表1
NIFTP 相關的基因突變研究
2.2 NIFTP 相關的 microRNAs（miRNAs）的表達情況
miRNAs 是一類長約 22 個核苷酸的內源性非編碼小 RNA，其功能失調已證明與多種惡性腫瘤疾病的發生發展相關[26-29]。miRNAs 在肺癌、甲狀腺癌、結直腸癌、胰腺癌等疾病中存在異常表達，發揮著癌基因或抑癌基因的功能[30-33]。因此，miRNAs 成為近年來國內外研究非編碼 RNA 的一個熱點，而 miRNAs 在 NIFTP 中的研究甚為罕見。Borrelli 等[34]采用直接測定讀取信使 RNA 表達量的 NanoString nCounter 分析系統，檢測了 18 例甲狀腺濾泡性腺瘤、19 例 NIFTP 和 17 例浸潤性 FVPTC 組織中的 miRNAs 的表達水平。該研究發現：與甲狀腺濾泡性腺瘤相比，miRNA 在 FVPTC 組織表達上調的有 19 種，下調的有 23 種；亞組分析結果顯示，NIFTP 中的 miRNA-222-3p 的表達水平高于甲狀腺濾泡性腺瘤，差異具有統計學意義；相對于甲狀腺濾泡性腺瘤，NIFTP 中的 miRNA-152-3p、miRNA-185-5p 和 miRNA-574-3p 的表達水平顯著下調，差異具有統計學意義；在浸潤性 FVPTC 與 NIFTP 的比較中，發現 miRNA-10a-5p、miRNA-199b-5p、miRNA-320e 和 miRNA-1285-5p 在浸潤性 FVPTC 組中表達顯著上調，差異具有統計學意義。該研究者[34]同時采用定量聚合酶鏈反應（PCR） 法檢測 BRAF 和 RAS 突變，結果發現，在 19 例 NIFTP 中，RAS 突變占 42.1%，BRAFK601E突變占 10.5%；18 例甲狀腺濾泡性腺瘤中，BRAF/RAS 野生型基因型占 94.4%，BRAFK601E突變占 5.6%；17 例浸潤性 FVPTC 中，RAS 突變占 29.4%，BRAFV600E突變占 23.5%。故研究者認為：miRNA-152-3p、miRNA-185-5p 和 miRNA-574-3p 可作為區分 NIFTP 與甲狀腺濾泡性腺瘤的分子標志物，此外 miRNA-10a-5p 和 miRNA-320e 有助于辨別 NIFTP 和浸潤性 FVPTC。上述 miRNAs 可以應用于術前甲狀腺 FNA 標本的細胞學診斷。
另一研究者 Jahanbani 等[35]探討了經典型 PTC、FVPTC 和 NIFTP 相關的 miRNAs 的差異表達，期望能為上述疾病的診斷和預后尋找有效的分子標志物，為臨床決策提供幫助。研究者通過 miRNA PCR 陣列人腫瘤通路探測器（商品名：miScript miRNA PCR Array Human Cancer Pathway Finder）技術對比分析了 113 例接受手術切除治療的甲狀腺腫瘤患者的 miRNAs 的表達，包括 39 例經典型 PTC、17 例包裹性 PTC、25 例 FVPTC、20 例 NIFTP 和 12 例增生性病變或結節性甲狀腺腫。結果發現，與甲狀腺增生性病變或結節性甲狀腺腫相比，NIFTP 中 miRNA-7 的表達水平下調了 10 倍，差異具有統計學意義；miRNA-7 在經典型 PTC、包裹性 PTC 和 FVPTC 中有著類似的表達下調；另外，與甲狀腺增生性病變或結節性甲狀腺腫組相比，miRNA-1-3p 在經典型 PTC、包裹性 PTC 和 FVPTC 組中均表達下調，但 miRNA-1-3p 僅在 NIFTP 組和甲狀腺增生性病變或結節性甲狀腺腫組中的表達其差異有統計學意義。同時發現，FVPTC 組中 miRNA-222-3p 的表達水平高于甲狀腺增生性病變或結節性甲狀腺腫組，差異有統計學意義； FVPTC 組中的 miRNA-15b-5p 和 let-7d-5p 的表達水平低于甲狀腺增生性病變或結節性甲狀腺腫組；與 FVPTC 相比，NIFTP 中 miR-222-3p 的表達水平下調，而 miRNA144-3p 和 miRNA-143-3p 的表達水平上調，差異具有統計學意義[35]。另外，該研究者[35]驗證了 14 例 PTC 和體檢健康對照組外周血中的 84 種 miRNAs 的表達水平，結果發現：PTC 患者的外周循環血中的 miRNA-146b-5p、miRNA-222-3p、miRNA-378a-3p 和 miRNA-155-5p 的表達水平上調， miRNA-335-5p 和 miRNA-124-3p 的表達水平下調。因此認為，外周血中的 miRNA-146b-5p、miRNA-222-3p、miRNA-155-5p 和 miRNA-378a-3p 可作為 PTC 潛在的分子診斷標志物。最后，研究者[35]通過受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析檢驗的 miRNAs 的診斷效能，發現 miRNA-7-5p 的表達下調可區分 NIFTP/甲狀腺乳頭狀癌與甲狀腺增生病變/結節性甲狀腺腫，其靈敏度為 87%，特異度為 90%；miRNA-222-3p 的表達上調可區分 PTC 和 NIFTP，其靈敏度為 78.7%，特異度為 80%；miRNA-146b-5 的表達上調可辨別經典型 PTC 和 FVPTC，其靈敏度為 86%，特異度為 73%。因此得出，上述 miRNAs 可作為診斷 PTC 和 NIFTP 的有效分子標志物，幫助臨床治療決策，避免過度手術治療。
3 小結與展望
綜上，NIFTP 分子研究中最常見的是 RAS 突變，并可見 BRAFK601E突變、PPARG 融合和 THADA 融合，一般無 BRAFV600E突變。同時 miRNAs 在 NIFTP 中也存在異常表達。上述研究不僅讓我們對 NIFTP 的分子表達有了新的認識，同時也為 NIFTP 的診斷和鑒別診斷提供了新的思路，具有較大的臨床應用價值。由于分子技術檢測應用于 NIFTP 的研究處于初級階段，仍需要大量的基礎研究工作進一步論證上述研究的可靠性，包括以下幾個方面：① 根據 WHO 定義的 NIFTP 的組織病理診斷標準嚴格納入研究對象，擴大樣本量；② 目前的研究大多為回顧性描述性研究，因此建議在今后的研究中設計 NIFTP 相關的前瞻性對比試驗；③ 臨床醫師與病理科醫師以及醫學基礎研究員建立多學科合作；④ 通過收集多中心大樣本驗證 NIFTP 患者相關 miRNAs 的差異表達；⑤ 環狀 RNA、長鏈非編碼 RNA 和外泌體也是目前腫瘤研究的熱點，因此 NIFTP 相關的環狀 RNA、長鏈非編碼 RNA 和外泌體的差異表達也值得在今后的工作中進一步研究。我們相信，隨著研究的深入，在不久的將來，越來越多的 NIFTP 相關的分子被檢測出，可能為 NIFTP 發病的分子機制提供新的依據，成為 NIFTP 臨床診斷的新分子標志物。
甲狀腺癌為內分泌系統最常見的惡性腫瘤疾病。近年來，其發病率在全球呈遞增趨勢[1-3]。甲狀腺癌常見的病理學類型包括乳頭狀癌、濾泡狀癌、髓樣癌和未分化癌[4]。2017 年，世界衛生組織（World Health Organization，WHO）對內分泌器官腫瘤的分類進行了更新，其中新提出了伴乳頭狀癌核特征的非浸潤性濾泡性甲狀腺腫瘤（noninvasive follicular thyroid neoplasm with papillary-like nuclear features，NIFTP）這一術語[5]。目前，NIFTP 的確診仍然依靠完整切除腫瘤后的組織病理學診斷。術前甲狀腺結節細針穿刺的細胞病理學檢查難以區分 NIFTP 和甲狀腺濾泡性腫瘤[6-8]。近年來，隨著各種新的分子生物學技術的應用，已有一些遺傳變異被發現與甲狀腺癌的發病顯著相關。然而， NIFTP 的分子異常表達和生物學機制尚未闡明。因此，進一步研究更多參與到 NIFTP 發生發展中的分子改變及其致病機理，對 NIFTP 的診斷和鑒別診斷至關重要。目前關于 NIFTP 相關的分子研究正處于初步階段。因此，筆者復習了最新研究報道，就 NIFTP 相關的分子研究作一綜述。
1 NIFTP 的發展史和病理學診斷標準
1.1 NIFTP 的發展簡史
1960 年，Lindsay 最早報道了濾泡亞型甲狀腺乳頭狀癌（follicular variant of papillary thyroid carcinoma，FVPTC），其包含有濾泡狀生長結構、類似乳頭狀癌的核特征，伴有頸部淋巴結轉移[9]。之后陸續有越來越多的研究者報道了 FVPTC 的臨床和病理學特征[10-11]。FVPTC 包含浸潤性和包裹性 2 個亞型，根據是否伴有包膜和（或）血管浸潤，將包裹性 FVPTC 進一步分為非浸潤性包裹性 FVPTC 和浸潤性包裹性 FVPTC，其生物學行為分別類似于甲狀腺濾泡腺瘤和甲狀腺濾泡腺癌[12]。盡管已有大量研究報道認為包裹性 FVPTC 的生物行為呈惰性，但這類患者仍然接受過度治療（甲狀腺全切除伴或不伴術后放射性碘治療）[13-14]。2016 年，以 Nikiforov 等[15]為首的國際多學科工作組對非浸潤性包裹性 FVPTC 和浸潤性包裹性 FVPTC 的臨床病理學特征及術后隨訪進行了重新評估和比較，發現非浸潤性包裹性 FVPTC 病變具有良好的生物學行為和極低的不良轉歸風險。故該工作組[15]認為，用“癌”來稱謂非浸潤性包裹性 FVPTC 是不合適的，推薦用 NIFTP 術語替代非浸潤性包裹性 FVPTC，治療方案推薦腺葉切除術或僅行甲狀腺次全切除術，從而避免甲狀腺全切除所致的潛在的并發癥、額外費用和放射性碘治療，減輕患者的心理壓力和經濟負擔。上述 NIFTP 相關內容同時發表在JAMA Oncology雜志上。隨后的 2017 版 WHO 內分泌器官腫瘤分類中更新了甲狀腺腫瘤的分類，新增加了 NIFTP 病種[5]。
1.2 NIFTP 的組織病理學診斷標準
NIFTP 的組織病理診斷具有嚴格的納入和排除標準[5, 15]。納入標準包括：首先具有乳頭狀癌核特征，該特征主要通過 3 個核參數評估，包括核形狀與大小（增大、重疊、擁擠與拉長）、核膜不規則（核溝和核內假包涵體）及染色質特點（染色質透明和毛玻璃樣變）。3 項中具備任何一項，則記為 1 分，如評分為 2 或 3 分，則滿足 NIFTP 的細胞核評分標準。其次，擁有完整包膜或腫瘤邊界清楚。最后，具有濾泡樣生長模式，且小于 1% 的乳頭狀結構，小于 30% 的實性、小梁狀或島狀生長模式。排除標準為：① 無淋巴管血管或包膜浸潤；② 無砂粒體；③ 無腫瘤性壞死；④ 無高有絲分裂活性（每 10 個高倍視野下有絲分裂小于 3 個）。
2 NIFTP 的分子特征
2.1 NIFTP 相關的基因突變
Nikiforov 工作組[15]評估了 210 例包裹性 FVPTC（109 例非浸潤性包裹性 FVPTC 和 101 例浸潤性包裹性 FVPTC）的臨床病理學特征和術后隨訪（長達 10～26 年），提出以 NIFTP 的稱謂替代非浸潤性包裹性 FVPTC。工作組通過下一代測序技術（商品名：ThyroSeq v2 panel）檢測了 27 例 NIFTP 組織標本的基因突變，結果顯示：8 例為鼠肉瘤病毒致癌基因同源物（rat sarcoma viral oncogene homolog，RAS）突變，1 例為 Raf 激酶蛋白的 β 異構體（B-type RAF，BRAFK601E）突變，6 例見 PPARG 基因融合，6 例見 THADA 基因融合，6 例未檢出突變[15]。因此，該研究團隊認為，RAS 是 NIFTP 中最常見的突變，NIFTP 無 BRAFV600E突變。NIFTP 的高 RAS 突變率與甲狀腺濾泡性腺瘤、甲狀腺濾泡狀癌和包裹性 FVPTC 相似。因此，推測 NIFTP 可能代表濾泡性腫瘤的良性對應物或浸潤性包裹性 FVPTC 的前體。Jiang 等[16]回顧性研究了 302 例甲狀腺結節標本，其中 25 例經過術后組織病理學檢查確診為 FVPTC；經過嚴格的 NIFTP 診斷標準，8 例診斷為 NIFTP。其中 4 例 NIFTP 通過微陣列技術（商品名：GEC，該技術可以檢測 167 種基因的信使 RNA 表達，根據基因表達譜將腫瘤分為良性或可疑惡性）分析基因突變。結果顯示：4 例均為可疑惡性。另外 4 例 NIFTP 通過下一代測序技術發現 3 例存在 RAS 突變，1 例發生 RAS 和端粒酶逆轉錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）突變[16]。Bizzarro 等[17]通過定量聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，PCR）法檢測了 37 例 NIFTP、24 例浸潤性 FVPTC、20 例甲狀腺濾泡性腺瘤和 40 例甲狀腺乳突狀癌（papillary thyroid carcinoma， PTC） 中的 BRAFV600E的突變情況，結果發現，NIFTP 和甲狀腺濾泡性腺瘤組中無 BRAFV600E突變，浸潤性 FVPTC 組中的 BRAFV600E突變率為 38.4%，PTC 組中 BRAFV600E的突變率為 68.7%；BRAFV600E在 NIFTP 與 PTC 組中的突變率比較差異具有統計學意義，而 BRAFV600E在 NIFTP 和浸潤性 FVPTC 組中的突變率比較差異無統計學意義。
此外，Paulson 等[18]的一項回顧性研究分析了 199 例甲狀腺癌患者的病理及分子特征，結果顯示：27 例甲狀腺癌存在 RAS 突變，其中有 16 例 NIFTP（NIFTP 的 RAS 突變率為 59%）和 4 例 浸潤性 FVPTC，故認為該研究中 50% 以上的含有 RAS 突變的甲狀腺癌患者應被分類為 NIFTP。Giannini 等[19]通過 NanoString nCounter 分析系統（該系統可以檢測 75 種基因的信使 RNA 的表達量）檢測了 26 例 NIFTP、18 例甲狀腺濾泡性腺瘤和 18 例浸潤性 FVPTC 的基因表達譜，同時采用 PCR 進行 BRAFV600E和 RAS 突變的檢測。根據基因的表達譜等情況將研究對象分為 2 個聚類。NIFTP 樣品同時被分在 2 個聚類中，因為一半的 NIFTP 與甲狀腺濾泡腺瘤的表達譜類似，另一半 NIFTP 的表達譜具有與浸潤性 FVPTC 相似的表達譜。結果發現，26 例 NIFTP 中 13 例存在分子突變：1 例 BRAFV600E突變、3 例 BRAFK601E突變及 9 例 RAS 突變。該研究者[19]分析，NIFTP 中出現這 1 例 BRAFV600E突變的原因可能跟病理學家判定包膜/血管侵犯的技術限制有關，另外極少數 NIFTP 可能存在 BRAFV600E突變。該研究同時采用包含了 27 個基因模型的分類器將 26 例 NIFTP 分為 2 組：類似浸潤性 FVPTC 組（13 例表現為 BRAF/RAS 突變）和類似甲狀腺濾泡性腺瘤組（13 例包含野生基因型）。研究者認為：含有 BRAF/RAS 突變的 NIFTP 表現出類似惡性腫瘤的表達譜，支持了之前 Nikiforov 的假設（NIFTP 可能代表浸潤性 FVPTC 的前體）；相反，野生型 NIFTP 具有濾泡性腺瘤樣的基因表達譜，可能代表甲狀腺濾泡性腫瘤的良性對應物。
Zhao 等[20]采用下一代測序新技術檢測了 NIFTP 和浸潤性 FVPTC 的基因突變，該技術可以檢測基因重排，以及單核苷酸的變異、插入、缺失和拷貝數變化。納入研究的 97 例樣本包括 50 例 NIFTP 和 47 例浸潤性 FVPTC。NIFTP 組中 BRAFV600E突變率為 2%，RAS 突變率為 54%，基因易位率為 4.0%；浸潤性 FVPTC 組中 BRAFV600E突變率為 36.0%，RAS 突變率為 32%，基因易位率為 4.0%。2 組之間比較差異具有統計學意義。Cho 等[21]通過定量 PCR 法檢測了 NIFTP 和浸潤性包裹性 FVPTC 的基因突變，按照 NIFTP 的組織學病理診斷標準里面乳頭狀結構小于 1%的標準，共納入了 105 例 NIFTP 和 47 例浸潤性包裹性 FVPTC，其結果顯示，NIFTP 組中的 BRAFV600E突變率為 10%，野生基因型占 90%；浸潤性包裹性 FVPTC 中 BRAFV600E的突變率為 2%，野生基因型占 96%，2 組之間的 BRAFV600E突變率和野生基因型情況比較差異均無統計學意義；當 NIFTP 病理學診斷標準里面的乳頭狀結構占比定義為 0 時，共納入 95 例 NIFTP 和 45 例浸潤性包裹性 FVPTC，2 組中皆未見 BRAFV600E突變，此時NIFTP 組中 RAS 的突變率為 47%（42/89），浸潤性包裹性 FVPTC 中 RAS 的突變率為 47%（18/38），2 組之間的 RAS 突變率比較差異無統計學意義。
韓國學者 Lee 等[22]通過 PCR 檢測了 687 例甲狀腺細針穿刺抽吸（fine-needle aspiration，FNA）標本中的基因突變情況，結果發現，在 21 例 NIFTP 中，12 例存在 RAS 突變，5 例發生 BRAFV600E突變，1 例發生 BRAFK601E突變；575 例經典型 PTC 中，RAS 突變率為 4%，BRAF 突變率為 86.8%。研究者進一步分析了 BRAF/RAS 在 NIFTP 和浸潤性包裹性 FVPTC 2 組中的差異表達情況，結果顯示：47 例浸潤性包裹性 FVPTC 組中，BRAF 突變率為 40.4%，RAS 突變率為 44.7%；21 例 NIFTP 組中，BRAF 突變率為 23.8%，RAS 突變率為 57.1%。2 組間的 BRAF 突變率和 RAS 突變率比較差異無統計學意義。該研究者將 NIFTP 中的 BRAFV600E高突變率歸因為人種差異。為了驗證韓國人群中 NIFTP 是否存在 BRAFV600E高突變率，近期韓國學者 Kim 等[23]采用 DNA 直接測序法，對 32 例 NIFTP 和 48 例浸潤性包裹性 FVPTC 的組織標本進行了基因檢測。結果顯示，NIFTP 組中 BRAFV600E突變率為 0，RAS 突變率為 47%；浸潤性包裹性 FVPTC 組中的 BRAFV600E突變率為 8.0%，RAS 突變率為 46%。2 組之間的 BRAFV600E突變率和 RAS 突變率比較差異無統計學意義。該研究者推測 Lee 等[22]的研究中的 BRAFV600E高突變率可能與 NIFTP 的診斷標準不嚴格有關，并認為 RAS 突變的存在對術前鑒別 NIFTP 和浸潤性包裹性 FVPTC 無益。Strickland 等[24]對術前 24 例 FNA 甲狀腺結節標本和 36 例經典型 PTC 術中切除的標本分別通過基因檢測面板和下一代測序技術檢測其分子突變。結果顯示，36 例經典型 PTC 中發現 27 例 BRAFV600E突變；術前 FNA 細胞學病理結果傾向 NIFTP/FVPTC 的 8 例患者中，最終經組織病理學確診有 5 例 NIFTP（1 例為 RAS 突變，4 例為野生基因型），1 例經典型 PTC（出現 BRAFV600E突變），1 例 FVPTC（野生基因型），1 例甲狀腺濾泡性腺瘤（野生基因型）。研究結果表明，在術前 FNA 細胞形態學不能確定 NIFTP/FVPTC 或經典型 PTC 的情況下，采用分子檢測可能是有價值的。du Jour 等[25]回顧性分析了 50 例既往診斷為 FVPTC 的患者的臨床病理學資料，遵循 NIFTP 的嚴格診斷標準重新評判病理結果，結果 17 例診斷為 NIFTP，32 例診斷為 FVPTC，1 例診斷為經典型 PTC；17 例 NIFTP 中未見 BRAFV600E突變，5 例 FVPTC 檢測出 BRAFV600E。NIFTP 相關的基因突變研究結果詳見表 1。
表1
NIFTP 相關的基因突變研究
2.2 NIFTP 相關的 microRNAs（miRNAs）的表達情況
miRNAs 是一類長約 22 個核苷酸的內源性非編碼小 RNA，其功能失調已證明與多種惡性腫瘤疾病的發生發展相關[26-29]。miRNAs 在肺癌、甲狀腺癌、結直腸癌、胰腺癌等疾病中存在異常表達，發揮著癌基因或抑癌基因的功能[30-33]。因此，miRNAs 成為近年來國內外研究非編碼 RNA 的一個熱點，而 miRNAs 在 NIFTP 中的研究甚為罕見。Borrelli 等[34]采用直接測定讀取信使 RNA 表達量的 NanoString nCounter 分析系統，檢測了 18 例甲狀腺濾泡性腺瘤、19 例 NIFTP 和 17 例浸潤性 FVPTC 組織中的 miRNAs 的表達水平。該研究發現：與甲狀腺濾泡性腺瘤相比，miRNA 在 FVPTC 組織表達上調的有 19 種，下調的有 23 種；亞組分析結果顯示，NIFTP 中的 miRNA-222-3p 的表達水平高于甲狀腺濾泡性腺瘤，差異具有統計學意義；相對于甲狀腺濾泡性腺瘤，NIFTP 中的 miRNA-152-3p、miRNA-185-5p 和 miRNA-574-3p 的表達水平顯著下調，差異具有統計學意義；在浸潤性 FVPTC 與 NIFTP 的比較中，發現 miRNA-10a-5p、miRNA-199b-5p、miRNA-320e 和 miRNA-1285-5p 在浸潤性 FVPTC 組中表達顯著上調，差異具有統計學意義。該研究者[34]同時采用定量聚合酶鏈反應（PCR） 法檢測 BRAF 和 RAS 突變，結果發現，在 19 例 NIFTP 中，RAS 突變占 42.1%，BRAFK601E突變占 10.5%；18 例甲狀腺濾泡性腺瘤中，BRAF/RAS 野生型基因型占 94.4%，BRAFK601E突變占 5.6%；17 例浸潤性 FVPTC 中，RAS 突變占 29.4%，BRAFV600E突變占 23.5%。故研究者認為：miRNA-152-3p、miRNA-185-5p 和 miRNA-574-3p 可作為區分 NIFTP 與甲狀腺濾泡性腺瘤的分子標志物，此外 miRNA-10a-5p 和 miRNA-320e 有助于辨別 NIFTP 和浸潤性 FVPTC。上述 miRNAs 可以應用于術前甲狀腺 FNA 標本的細胞學診斷。
另一研究者 Jahanbani 等[35]探討了經典型 PTC、FVPTC 和 NIFTP 相關的 miRNAs 的差異表達，期望能為上述疾病的診斷和預后尋找有效的分子標志物，為臨床決策提供幫助。研究者通過 miRNA PCR 陣列人腫瘤通路探測器（商品名：miScript miRNA PCR Array Human Cancer Pathway Finder）技術對比分析了 113 例接受手術切除治療的甲狀腺腫瘤患者的 miRNAs 的表達，包括 39 例經典型 PTC、17 例包裹性 PTC、25 例 FVPTC、20 例 NIFTP 和 12 例增生性病變或結節性甲狀腺腫。結果發現，與甲狀腺增生性病變或結節性甲狀腺腫相比，NIFTP 中 miRNA-7 的表達水平下調了 10 倍，差異具有統計學意義；miRNA-7 在經典型 PTC、包裹性 PTC 和 FVPTC 中有著類似的表達下調；另外，與甲狀腺增生性病變或結節性甲狀腺腫組相比，miRNA-1-3p 在經典型 PTC、包裹性 PTC 和 FVPTC 組中均表達下調，但 miRNA-1-3p 僅在 NIFTP 組和甲狀腺增生性病變或結節性甲狀腺腫組中的表達其差異有統計學意義。同時發現，FVPTC 組中 miRNA-222-3p 的表達水平高于甲狀腺增生性病變或結節性甲狀腺腫組，差異有統計學意義； FVPTC 組中的 miRNA-15b-5p 和 let-7d-5p 的表達水平低于甲狀腺增生性病變或結節性甲狀腺腫組；與 FVPTC 相比，NIFTP 中 miR-222-3p 的表達水平下調，而 miRNA144-3p 和 miRNA-143-3p 的表達水平上調，差異具有統計學意義[35]。另外，該研究者[35]驗證了 14 例 PTC 和體檢健康對照組外周血中的 84 種 miRNAs 的表達水平，結果發現：PTC 患者的外周循環血中的 miRNA-146b-5p、miRNA-222-3p、miRNA-378a-3p 和 miRNA-155-5p 的表達水平上調， miRNA-335-5p 和 miRNA-124-3p 的表達水平下調。因此認為，外周血中的 miRNA-146b-5p、miRNA-222-3p、miRNA-155-5p 和 miRNA-378a-3p 可作為 PTC 潛在的分子診斷標志物。最后，研究者[35]通過受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析檢驗的 miRNAs 的診斷效能，發現 miRNA-7-5p 的表達下調可區分 NIFTP/甲狀腺乳頭狀癌與甲狀腺增生病變/結節性甲狀腺腫，其靈敏度為 87%，特異度為 90%；miRNA-222-3p 的表達上調可區分 PTC 和 NIFTP，其靈敏度為 78.7%，特異度為 80%；miRNA-146b-5 的表達上調可辨別經典型 PTC 和 FVPTC，其靈敏度為 86%，特異度為 73%。因此得出，上述 miRNAs 可作為診斷 PTC 和 NIFTP 的有效分子標志物，幫助臨床治療決策，避免過度手術治療。
3 小結與展望
綜上，NIFTP 分子研究中最常見的是 RAS 突變，并可見 BRAFK601E突變、PPARG 融合和 THADA 融合，一般無 BRAFV600E突變。同時 miRNAs 在 NIFTP 中也存在異常表達。上述研究不僅讓我們對 NIFTP 的分子表達有了新的認識，同時也為 NIFTP 的診斷和鑒別診斷提供了新的思路，具有較大的臨床應用價值。由于分子技術檢測應用于 NIFTP 的研究處于初級階段，仍需要大量的基礎研究工作進一步論證上述研究的可靠性，包括以下幾個方面：① 根據 WHO 定義的 NIFTP 的組織病理診斷標準嚴格納入研究對象，擴大樣本量；② 目前的研究大多為回顧性描述性研究，因此建議在今后的研究中設計 NIFTP 相關的前瞻性對比試驗；③ 臨床醫師與病理科醫師以及醫學基礎研究員建立多學科合作；④ 通過收集多中心大樣本驗證 NIFTP 患者相關 miRNAs 的差異表達；⑤ 環狀 RNA、長鏈非編碼 RNA 和外泌體也是目前腫瘤研究的熱點，因此 NIFTP 相關的環狀 RNA、長鏈非編碼 RNA 和外泌體的差異表達也值得在今后的工作中進一步研究。我們相信，隨著研究的深入，在不久的將來，越來越多的 NIFTP 相關的分子被檢測出，可能為 NIFTP 發病的分子機制提供新的依據，成為 NIFTP 臨床診斷的新分子標志物。
