引用本文： 邱建國, 史政榮, 李明. 長鏈非編碼 RNA GAS5 在肝細胞性肝癌中的表達及其臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2019, 26(3): 301-306. doi: 10.7507/1007-9424.201807021 復制
肝癌常常起病隱匿、進展迅速，絕大部分患者確診時已處于中、晚期，喪失了手術時機，即使手術根治性切除，術后復發和轉移仍然是制約患者長期生存的重要因素[1-2]。因此，為了早期發現肝癌以改善肝癌患者的預后，人們一直在致力于研究導致肝癌侵襲及轉移的細胞及分子生物學機制。近年來，基因測序技術的發展使大量非編碼 RNA（non-coding RNA，ncRNA），特別是長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在腫瘤的發生、侵襲和轉移中的作用越來越受到人們的關注[3-5]。研究發現，lncRNA 中的生長停滯敏感基因 5（growth arrest-specific 5，GAS5）是一種腫瘤抑制因子[6]，通常由血清不足、細胞間接觸抑制等應激誘導產生[7]；它可誘導細胞凋亡并調控細胞周期[8-9]。在腎癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱移行細胞癌等腫瘤組織和細胞株中，GAS5 mRNA 的表達水平顯著低于正常組織/細胞，可能因此而導致了腫瘤細胞逃避凋亡和細胞周期失調[6-11]。然而，有關肝癌中 GAS5 的研究報道還相對較少[12-13]。景偉等[13]比較了肝癌患者治療前后 GAS5 mRNA 的表達水平的變化，以用于治療效果的預估。但 GAS5 mRNA 在肝細胞性肝癌中的表達情況及其臨床意義尤其是其與患者遠期預后的相關性還有待進一步研究及證實。因此，本研究旨在通過檢測 GAS5 mRNA 在肝細胞性肝癌組織中的表達情況，并結合臨床資料探討其與患者臨床病理學特征之間的相關性，明確 GAS5 mRNA 作為肝細胞性肝癌生物標志物或藥物靶標的潛在應用價值，并提供實驗理論依據。
1 資料與方法
1.1 研究對象
納入標準：2013 年 9 月至 2016 年 7 月期間于重慶醫科大學附屬第一醫院行根治性切除手術、術后病理學檢查證實為原發性肝細胞性肝癌的患者，患者術前未接受任何靜脈化療或經皮肝動脈介入化療栓塞術（TACE）等其他治療。排除標準：① 病理學檢查證實為非原發性肝細胞性肝癌；② 患者臨床資料不完整；③ 術前接受針對腫瘤特異性治療（化療、放療或其他）。按照預先設定的納入和排除標準，回顧性收集病例 120 例，其中男 66 例（55.0%），女 54 例（45.0%）；年齡 30～72 歲，中位年齡為 56 歲。腫瘤直徑 2～14 cm，中位數為 5.8 cm，其中<5 cm 者 74 例（61.7%）；腫瘤病灶<3 個者 87 例（72.5%）；術前甲胎蛋白（AFP）20～1 200 μg/L，中位數為 420 μg/L，其中<400 μg/L 者 54 例（45.0%）；術前谷丙轉氨酶 28～234 U/L，中位數為 61 U/L，其中小于 40 U/L 者 65 例（54.2%）；手術時間<300 min 者 74 例（61.7%），肝臟阻斷時間<60 min 者 78 例（65%），術中出血量<1 000 mL 者 81 例（67.5%），輸血 35 例（29.2%）；發生微血管侵犯 55 例（45.8%），發生門靜脈癌栓 18 例（15.0%），發生腹水 20 例（16.7%），合并肝硬變 85 例（70.8%），乙肝表面抗原陽性 82 例（68.3%）。按照 2009 年美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）標準[14]進行 TNM 分期：Ⅰ 期 7 例（5.8%），Ⅱ 期 87 例（72.5%），Ⅲ 期 24 例（20.0%），Ⅳ 期 2 例（1.7%）。按照 WHO 腫瘤病理學分級標準[15]：高分化 31 例（25.8%），中分化 16 例（13.4%），低分化 73 例（60.8%）。有淋巴結轉移者 34 例（28.3%），無淋巴結轉移者 86 例（71.7%）。肝切除術式為左/右半肝切除 25 例（20.9%），聯合肝段切除 40 例（33.3%），肝段切除 45 例（37.5%），左/右三葉切除 10 例（8.3%）。每例患者均取得肝細胞性肝癌原發灶以及距原發灶邊緣 2 cm 以遠的相應的癌旁組織，切除的手術標本一部分（1/2）直接置于液氮中凍藏，并轉移至–80 ℃低溫冰箱保存以用于后續實驗提取組織總 RNA 與 DNA；另一部分（1/2）標本置于含 10% 甲醛溶液中固定，常規制作石蠟包埋切片并行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。HE 染色結果顯示，所有腫瘤標本均為肝細胞性肝癌組織，癌旁組織均未見癌細胞累及。
1.2 主要試劑
Trizol 試劑和脂質體 Lipofectamine2000購自美國 Invitrogen 公司；RPMI-1640 培養基和胎牛血清購自美國 Gibco 公司；GAS5 引物以及干擾序列由上海百奧邁科生物股份有限公司合成。RNA 反轉錄試劑盒和實時熒光定量 PCR（RT-PCR）試劑盒購于日本 TaKaRa 公司。
1.3 RT-PCR 法檢測肝細胞性肝癌組織及其癌旁組織中 GAS5 mRNA 的表達
首先按 TRIzol 試劑說明書提供的操作步驟提取肝細胞性肝癌原發灶和癌旁組織中的 RNA，并參照反轉錄試劑盒說明書步驟，對 GAS5 基因進行 PCR 擴增。GAS5 基因的正向序列為：5′-CTTCTGGGCTCAAGTGATCCT-3′，反向序列為：5′-AGGATCACTTGAGCCCAGAAG-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因的正向序列為：5′-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′；反向序列為：5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′。PCR 反應條件：95 ℃ 預變性 10 min； 95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，共計 40 個循環。以 2–ΔΔCt法[16]計算 GAS5 mRNA 的相對表達水平。
1.4 隨訪
采用電話或門診等方式進行隨訪，記錄患者的生存情況，隨訪截止日期為 2018 年 9 月 30 日。總生存期為發病日期至最后隨訪日期或死亡日期，以月為單位。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 19.0 軟件對結果數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（
±s）或中位數表示。采用配對 t 檢驗比較肝細胞性肝癌原發灶組織及其癌旁組織中 GAS5 mRNA 的表達水平，采用成組 χ2 檢驗分析肝細胞性肝癌組織中 GAS5 mRNA 的表達與患者臨床病理學特征之間的關系；采用 log-rank 檢驗進行生存分析的單因素分析，采用 Cox 比例風險回歸模型進行生存分析的多因素分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 肝細胞性肝癌組織及其癌旁組織中 GAS5 mRNA 的表達情況
采用 RT-PCR 法檢測肝細胞性肝癌組織及其癌旁組織中 GAS5 mRNA 的表達水平，結果顯示：與其對應的癌旁組織相比較，肝細胞性肝癌組織中 GAS5 mRNA 的表達水平較低，差異具有統計學意義（t=2.321，P<0.01），見圖 1。
圖1
示肝細胞性肝癌及其癌旁組織中 GAS5 mRNA的表達水平及 GAS5 mRNA的表達對患者生存的影響
a：肝細胞性肝癌及其癌旁組織中 GAS5 mRNA的表達水平；b：GAS5 mRNA 低表達和高表達肝細胞性肝癌患者的生存曲線
2.2 GAS5 mRNA 的表達水平與肝細胞性肝癌患者臨床病理學特征之間的關系
以肝細胞性肝癌組織中 GAS5 mRNA 表達水平的均數（0.9）為界，將其分為 GAS5 mRNA 高表達組和低表達組，并分析 GAS5 mRNA 表達與肝細胞性肝癌患者臨床病理學特征的關系，結果表明，GAS5 mRNA 的表達與腫瘤直徑、腫瘤數量、術前 AFP 水平、淋巴結轉移、TNM 分期和腫瘤分化程度均相關（P<0.05），而與患者的年齡、性別和乙肝表面抗原情況均無關（P>0.05），具體見表 1。
表1
GAS5 mRNA 的表達水平與肝細胞性肝癌患者臨床病理學特征之間的關系
2.3 GAS5 mRNA 低表達預示肝細胞性肝癌患者的預后不良
本組 109 例患者（90.8%）獲訪，隨訪時間為 24～60 個月，中位隨訪時間為 39 個月。隨訪期間因腫瘤復發或轉移死亡 71 例，全組術后總的 1、3 及 5 年生存率分別為 73.5%、51.2% 和 37.5%。
2.3.1 單因素分析
log-rank 檢驗結果表明，肝細胞性肝癌患者的預后與年齡、性別、術前谷丙轉氨酶水平、腹水、肝臟阻斷時間及輸血均無關（P>0.05）；而與腫瘤直徑、腫瘤數量、術前 AFP 水平、微血管侵犯、門靜脈癌栓、淋巴結轉移、合并肝硬變、手術時間、術中出血量、TNM 分期及 GAS5 mRNA 的表達均有關（P<0.05），具體見表 2。
表2
生存分析的單因素分析
2.3.2 多因素分析
將單因素分析中有統計學意義的 10 項因素（也符合專業認知）引入 Cox 比例風險回歸模型，結果表明，術前 AFP 水平和肝硬變均與預后無關（P>0.05）；微血管侵犯、門靜脈癌栓、腫瘤直徑、腫瘤數量、術中出血量、淋巴結轉移、TNM 分期及 GAS5 mRNA 的表達（圖 1b）均與預后有關（P<0.05）。具體見表 3。
表3
Cox 比例風險回歸模型結果
3 討論
肝癌是嚴重危害人類健康的疾病之一，表觀遺傳修飾在肝癌的發生和發展中起重要作用。表觀遺傳機制主要涉及 DNA 甲基化、多種形式的組蛋白修飾、染色質重構和 RNA 干擾[24-25]。隨著高通量基因測序技術的應用，lncRNAs 在腫瘤發生和發展中的作用越來越引起研究者的關注。lncRNAs 是一類在基因組轉錄中不參與編碼蛋白、長度超過 200 個核苷酸的轉錄產物，具備染色質修飾、轉錄、翻譯、剪接、表觀遺傳學調控等多種生物學功能，并在各種生物進程中發揮重要作用。
目前與肝癌發生、侵襲和轉移相關性較強的 lncRNAs 主要有以下幾種：H19、肺腺癌轉移相關轉錄子 1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）、HOX 轉錄反義 RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）、肝癌高表達基因（highly up-regulated in liver cancer，HULC）、TUC388、母系印記基因 3（maternal expressed gene 3，MEG3）等。H19 是第一個被發現的 lncRNA，由位于染色體 11p15.5 上的 H19 基因轉錄，在正常肝細胞中含量極低，肝癌發生時表達明顯上調[26]，因此有研究[26]報道，H19 的表達水平與 AFP 聯合檢測可提高肝癌的早期確診率。MALAT1 系由位于染色體 11q13 上的 MALAT1 基因轉錄，MALAT1 可通過與多聚嘧啶序列結合蛋白（polypyrimidine tract binding protein，PTB）相關剪接因子（PTB-associated splicing factor，PSF）結合，抑制 PSF 蛋白與原癌基因轉錄調節區結合，導致原癌基因大量轉錄而誘發腫瘤的發生[27]。HOTAIR 系由位于染色體 12q13.13 上的 HOXC 基因轉錄，通過外源性基因沉默的方式調控基因表達，進而促進肝癌細胞的增殖[3, 28]。HULC 系由位于染色體 6p24.3 上的 HULC 基因轉錄，HULC 與 microRNA-372 結合后，直接抑制其活性，從而在轉錄水平調節基因表達，進而影響肝癌的進展。TUC388 是多聚胞嘧啶結合蛋白 2 基因轉錄片段 uc.338 克隆形成的轉錄產物，uc.338 在人肝癌組織和細胞株中的表達顯著上調[29]。MEG3 由人類染色體 14q32.3 的 MEG3 基因轉錄，其通過抑制抑癌基因 p53 而發揮影響肝癌細胞增殖的作用[30]。
既往的研究[31]已發現，GAS5 位于人類染色體 1q25.1，長度為 4 983 bp，含有多個內含子和外顯子；內含子編碼核小 RNA，外顯子包含開放閱讀框架卻不編碼功能性蛋白質，最初是作為生長停滯細胞中高表達的基因被發現的。實驗[11-13]結果顯示，GAS5 mRNA 在胰腺癌組織中的表達水平與正常組織相比是明顯降低的，而過表達 GAS5 mRNA 可以抑制胰腺細胞的增殖，但 GAS5 mRNA 在肝細胞性肝癌組織中的表達及其功能研究和報道相對較少。本研究發現，GAS5 mRNA 在肝細胞性肝癌組織中的表達水平低于癌旁組織。而 GAS5 mRNA 是一種已知的腫瘤抑制因子，它可誘導細胞凋亡和調控細胞周期，因此本研究結果提示，GAS5 mRNA 的表達抑制可能參與肝細胞性肝癌的發生。本研究進一步分析了 GAS5 mRNA 表達與患者臨床病理學特征的關系，發現肝細胞性肝癌組織中 GAS5 mRNA 的低表達與腫瘤直徑、腫瘤數量、淋巴結轉移、腫瘤 TNM 分期及腫瘤分化程度相關。
目前，利用各種治療手段對肝癌患者進行多學科（multidisciplinary team，MDT）診治是肝癌治療的趨勢。臨床上如能確立一些準確預測預后的指標，將有助于鑒別高復發傾向人群并提供防治復發依據，進而及早預防復發。本研究通過對 120 例肝細胞性肝癌患者的臨床病理學特征、治療措施等 16 項指標進行分析，發現影響患者術后預后的因素包括腫瘤直徑、腫瘤數目、微血管侵犯、門靜脈癌栓、腫瘤 TNM 分期以及 GAS5 mRNA 的表達情況，且單因素和多因素生存分析結果均表明，GAS5 mRNA 表達是影響肝細胞性肝癌患者預后的影響因素。臨床上對 GAS5 mRNA 表達水平的檢測有可能為我們對肝癌患者預后的判斷提供依據。
本研究僅初步探討了 GAS5 mRNA 在肝細胞性肝癌組織中的表達及其臨床意義，但關于 GAS5 mRNA 在肝細胞性肝癌侵襲轉移過程中的生物學功能及其具體作用機制尚需進一步研究。隨著研究的深入，GAS5 mRNA 作為肝細胞性肝癌的生物學標志物或藥物靶標的潛在應用價值將可能逐步顯現，這亦為后續的轉化醫學研究奠定了理論基礎。
肝癌常常起病隱匿、進展迅速，絕大部分患者確診時已處于中、晚期，喪失了手術時機，即使手術根治性切除，術后復發和轉移仍然是制約患者長期生存的重要因素[1-2]。因此，為了早期發現肝癌以改善肝癌患者的預后，人們一直在致力于研究導致肝癌侵襲及轉移的細胞及分子生物學機制。近年來，基因測序技術的發展使大量非編碼 RNA（non-coding RNA，ncRNA），特別是長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在腫瘤的發生、侵襲和轉移中的作用越來越受到人們的關注[3-5]。研究發現，lncRNA 中的生長停滯敏感基因 5（growth arrest-specific 5，GAS5）是一種腫瘤抑制因子[6]，通常由血清不足、細胞間接觸抑制等應激誘導產生[7]；它可誘導細胞凋亡并調控細胞周期[8-9]。在腎癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱移行細胞癌等腫瘤組織和細胞株中，GAS5 mRNA 的表達水平顯著低于正常組織/細胞，可能因此而導致了腫瘤細胞逃避凋亡和細胞周期失調[6-11]。然而，有關肝癌中 GAS5 的研究報道還相對較少[12-13]。景偉等[13]比較了肝癌患者治療前后 GAS5 mRNA 的表達水平的變化，以用于治療效果的預估。但 GAS5 mRNA 在肝細胞性肝癌中的表達情況及其臨床意義尤其是其與患者遠期預后的相關性還有待進一步研究及證實。因此，本研究旨在通過檢測 GAS5 mRNA 在肝細胞性肝癌組織中的表達情況，并結合臨床資料探討其與患者臨床病理學特征之間的相關性，明確 GAS5 mRNA 作為肝細胞性肝癌生物標志物或藥物靶標的潛在應用價值，并提供實驗理論依據。
1 資料與方法
1.1 研究對象
納入標準：2013 年 9 月至 2016 年 7 月期間于重慶醫科大學附屬第一醫院行根治性切除手術、術后病理學檢查證實為原發性肝細胞性肝癌的患者，患者術前未接受任何靜脈化療或經皮肝動脈介入化療栓塞術（TACE）等其他治療。排除標準：① 病理學檢查證實為非原發性肝細胞性肝癌；② 患者臨床資料不完整；③ 術前接受針對腫瘤特異性治療（化療、放療或其他）。按照預先設定的納入和排除標準，回顧性收集病例 120 例，其中男 66 例（55.0%），女 54 例（45.0%）；年齡 30～72 歲，中位年齡為 56 歲。腫瘤直徑 2～14 cm，中位數為 5.8 cm，其中<5 cm 者 74 例（61.7%）；腫瘤病灶<3 個者 87 例（72.5%）；術前甲胎蛋白（AFP）20～1 200 μg/L，中位數為 420 μg/L，其中<400 μg/L 者 54 例（45.0%）；術前谷丙轉氨酶 28～234 U/L，中位數為 61 U/L，其中小于 40 U/L 者 65 例（54.2%）；手術時間<300 min 者 74 例（61.7%），肝臟阻斷時間<60 min 者 78 例（65%），術中出血量<1 000 mL 者 81 例（67.5%），輸血 35 例（29.2%）；發生微血管侵犯 55 例（45.8%），發生門靜脈癌栓 18 例（15.0%），發生腹水 20 例（16.7%），合并肝硬變 85 例（70.8%），乙肝表面抗原陽性 82 例（68.3%）。按照 2009 年美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）標準[14]進行 TNM 分期：Ⅰ 期 7 例（5.8%），Ⅱ 期 87 例（72.5%），Ⅲ 期 24 例（20.0%），Ⅳ 期 2 例（1.7%）。按照 WHO 腫瘤病理學分級標準[15]：高分化 31 例（25.8%），中分化 16 例（13.4%），低分化 73 例（60.8%）。有淋巴結轉移者 34 例（28.3%），無淋巴結轉移者 86 例（71.7%）。肝切除術式為左/右半肝切除 25 例（20.9%），聯合肝段切除 40 例（33.3%），肝段切除 45 例（37.5%），左/右三葉切除 10 例（8.3%）。每例患者均取得肝細胞性肝癌原發灶以及距原發灶邊緣 2 cm 以遠的相應的癌旁組織，切除的手術標本一部分（1/2）直接置于液氮中凍藏，并轉移至–80 ℃低溫冰箱保存以用于后續實驗提取組織總 RNA 與 DNA；另一部分（1/2）標本置于含 10% 甲醛溶液中固定，常規制作石蠟包埋切片并行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。HE 染色結果顯示，所有腫瘤標本均為肝細胞性肝癌組織，癌旁組織均未見癌細胞累及。
1.2 主要試劑
Trizol 試劑和脂質體 Lipofectamine2000購自美國 Invitrogen 公司；RPMI-1640 培養基和胎牛血清購自美國 Gibco 公司；GAS5 引物以及干擾序列由上海百奧邁科生物股份有限公司合成。RNA 反轉錄試劑盒和實時熒光定量 PCR（RT-PCR）試劑盒購于日本 TaKaRa 公司。
1.3 RT-PCR 法檢測肝細胞性肝癌組織及其癌旁組織中 GAS5 mRNA 的表達
首先按 TRIzol 試劑說明書提供的操作步驟提取肝細胞性肝癌原發灶和癌旁組織中的 RNA，并參照反轉錄試劑盒說明書步驟，對 GAS5 基因進行 PCR 擴增。GAS5 基因的正向序列為：5′-CTTCTGGGCTCAAGTGATCCT-3′，反向序列為：5′-AGGATCACTTGAGCCCAGAAG-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因的正向序列為：5′-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′；反向序列為：5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′。PCR 反應條件：95 ℃ 預變性 10 min； 95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，共計 40 個循環。以 2–ΔΔCt法[16]計算 GAS5 mRNA 的相對表達水平。
1.4 隨訪
采用電話或門診等方式進行隨訪，記錄患者的生存情況，隨訪截止日期為 2018 年 9 月 30 日。總生存期為發病日期至最后隨訪日期或死亡日期，以月為單位。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 19.0 軟件對結果數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）或中位數表示。采用配對 t 檢驗比較肝細胞性肝癌原發灶組織及其癌旁組織中 GAS5 mRNA 的表達水平，采用成組 χ2 檢驗分析肝細胞性肝癌組織中 GAS5 mRNA 的表達與患者臨床病理學特征之間的關系；采用 log-rank 檢驗進行生存分析的單因素分析，采用 Cox 比例風險回歸模型進行生存分析的多因素分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 肝細胞性肝癌組織及其癌旁組織中 GAS5 mRNA 的表達情況
采用 RT-PCR 法檢測肝細胞性肝癌組織及其癌旁組織中 GAS5 mRNA 的表達水平，結果顯示：與其對應的癌旁組織相比較，肝細胞性肝癌組織中 GAS5 mRNA 的表達水平較低，差異具有統計學意義（t=2.321，P<0.01），見圖 1。
圖1
示肝細胞性肝癌及其癌旁組織中 GAS5 mRNA的表達水平及 GAS5 mRNA的表達對患者生存的影響
a：肝細胞性肝癌及其癌旁組織中 GAS5 mRNA的表達水平；b：GAS5 mRNA 低表達和高表達肝細胞性肝癌患者的生存曲線
2.2 GAS5 mRNA 的表達水平與肝細胞性肝癌患者臨床病理學特征之間的關系
以肝細胞性肝癌組織中 GAS5 mRNA 表達水平的均數（0.9）為界，將其分為 GAS5 mRNA 高表達組和低表達組，并分析 GAS5 mRNA 表達與肝細胞性肝癌患者臨床病理學特征的關系，結果表明，GAS5 mRNA 的表達與腫瘤直徑、腫瘤數量、術前 AFP 水平、淋巴結轉移、TNM 分期和腫瘤分化程度均相關（P<0.05），而與患者的年齡、性別和乙肝表面抗原情況均無關（P>0.05），具體見表 1。
表1
GAS5 mRNA 的表達水平與肝細胞性肝癌患者臨床病理學特征之間的關系
2.3 GAS5 mRNA 低表達預示肝細胞性肝癌患者的預后不良
本組 109 例患者（90.8%）獲訪，隨訪時間為 24～60 個月，中位隨訪時間為 39 個月。隨訪期間因腫瘤復發或轉移死亡 71 例，全組術后總的 1、3 及 5 年生存率分別為 73.5%、51.2% 和 37.5%。
2.3.1 單因素分析
log-rank 檢驗結果表明，肝細胞性肝癌患者的預后與年齡、性別、術前谷丙轉氨酶水平、腹水、肝臟阻斷時間及輸血均無關（P>0.05）；而與腫瘤直徑、腫瘤數量、術前 AFP 水平、微血管侵犯、門靜脈癌栓、淋巴結轉移、合并肝硬變、手術時間、術中出血量、TNM 分期及 GAS5 mRNA 的表達均有關（P<0.05），具體見表 2。
表2
生存分析的單因素分析
2.3.2 多因素分析
將單因素分析中有統計學意義的 10 項因素（也符合專業認知）引入 Cox 比例風險回歸模型，結果表明，術前 AFP 水平和肝硬變均與預后無關（P>0.05）；微血管侵犯、門靜脈癌栓、腫瘤直徑、腫瘤數量、術中出血量、淋巴結轉移、TNM 分期及 GAS5 mRNA 的表達（圖 1b）均與預后有關（P<0.05）。具體見表 3。
表3
Cox 比例風險回歸模型結果
3 討論
肝癌是嚴重危害人類健康的疾病之一，表觀遺傳修飾在肝癌的發生和發展中起重要作用。表觀遺傳機制主要涉及 DNA 甲基化、多種形式的組蛋白修飾、染色質重構和 RNA 干擾[24-25]。隨著高通量基因測序技術的應用，lncRNAs 在腫瘤發生和發展中的作用越來越引起研究者的關注。lncRNAs 是一類在基因組轉錄中不參與編碼蛋白、長度超過 200 個核苷酸的轉錄產物，具備染色質修飾、轉錄、翻譯、剪接、表觀遺傳學調控等多種生物學功能，并在各種生物進程中發揮重要作用。
目前與肝癌發生、侵襲和轉移相關性較強的 lncRNAs 主要有以下幾種：H19、肺腺癌轉移相關轉錄子 1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）、HOX 轉錄反義 RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）、肝癌高表達基因（highly up-regulated in liver cancer，HULC）、TUC388、母系印記基因 3（maternal expressed gene 3，MEG3）等。H19 是第一個被發現的 lncRNA，由位于染色體 11p15.5 上的 H19 基因轉錄，在正常肝細胞中含量極低，肝癌發生時表達明顯上調[26]，因此有研究[26]報道，H19 的表達水平與 AFP 聯合檢測可提高肝癌的早期確診率。MALAT1 系由位于染色體 11q13 上的 MALAT1 基因轉錄，MALAT1 可通過與多聚嘧啶序列結合蛋白（polypyrimidine tract binding protein，PTB）相關剪接因子（PTB-associated splicing factor，PSF）結合，抑制 PSF 蛋白與原癌基因轉錄調節區結合，導致原癌基因大量轉錄而誘發腫瘤的發生[27]。HOTAIR 系由位于染色體 12q13.13 上的 HOXC 基因轉錄，通過外源性基因沉默的方式調控基因表達，進而促進肝癌細胞的增殖[3, 28]。HULC 系由位于染色體 6p24.3 上的 HULC 基因轉錄，HULC 與 microRNA-372 結合后，直接抑制其活性，從而在轉錄水平調節基因表達，進而影響肝癌的進展。TUC388 是多聚胞嘧啶結合蛋白 2 基因轉錄片段 uc.338 克隆形成的轉錄產物，uc.338 在人肝癌組織和細胞株中的表達顯著上調[29]。MEG3 由人類染色體 14q32.3 的 MEG3 基因轉錄，其通過抑制抑癌基因 p53 而發揮影響肝癌細胞增殖的作用[30]。
既往的研究[31]已發現，GAS5 位于人類染色體 1q25.1，長度為 4 983 bp，含有多個內含子和外顯子；內含子編碼核小 RNA，外顯子包含開放閱讀框架卻不編碼功能性蛋白質，最初是作為生長停滯細胞中高表達的基因被發現的。實驗[11-13]結果顯示，GAS5 mRNA 在胰腺癌組織中的表達水平與正常組織相比是明顯降低的，而過表達 GAS5 mRNA 可以抑制胰腺細胞的增殖，但 GAS5 mRNA 在肝細胞性肝癌組織中的表達及其功能研究和報道相對較少。本研究發現，GAS5 mRNA 在肝細胞性肝癌組織中的表達水平低于癌旁組織。而 GAS5 mRNA 是一種已知的腫瘤抑制因子，它可誘導細胞凋亡和調控細胞周期，因此本研究結果提示，GAS5 mRNA 的表達抑制可能參與肝細胞性肝癌的發生。本研究進一步分析了 GAS5 mRNA 表達與患者臨床病理學特征的關系，發現肝細胞性肝癌組織中 GAS5 mRNA 的低表達與腫瘤直徑、腫瘤數量、淋巴結轉移、腫瘤 TNM 分期及腫瘤分化程度相關。
目前，利用各種治療手段對肝癌患者進行多學科（multidisciplinary team，MDT）診治是肝癌治療的趨勢。臨床上如能確立一些準確預測預后的指標，將有助于鑒別高復發傾向人群并提供防治復發依據，進而及早預防復發。本研究通過對 120 例肝細胞性肝癌患者的臨床病理學特征、治療措施等 16 項指標進行分析，發現影響患者術后預后的因素包括腫瘤直徑、腫瘤數目、微血管侵犯、門靜脈癌栓、腫瘤 TNM 分期以及 GAS5 mRNA 的表達情況，且單因素和多因素生存分析結果均表明，GAS5 mRNA 表達是影響肝細胞性肝癌患者預后的影響因素。臨床上對 GAS5 mRNA 表達水平的檢測有可能為我們對肝癌患者預后的判斷提供依據。
本研究僅初步探討了 GAS5 mRNA 在肝細胞性肝癌組織中的表達及其臨床意義，但關于 GAS5 mRNA 在肝細胞性肝癌侵襲轉移過程中的生物學功能及其具體作用機制尚需進一步研究。隨著研究的深入，GAS5 mRNA 作為肝細胞性肝癌的生物學標志物或藥物靶標的潛在應用價值將可能逐步顯現，這亦為后續的轉化醫學研究奠定了理論基礎。
