引用本文： 林賢超, 文實, 潘譽, 滕天鴻, 陳飛, 黃鶴光. 胰腺癌患者及大鼠血清中microRNA-21和 microRNA-155的表達及其意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(10): 1171-1175. doi: 10.7507/1007-9424.201804006 復制
胰腺癌是惡性程度最高、預后最差的消化系統惡性腫瘤，5 年生存率僅 5%～8%，手術切除是治療胰腺癌最關鍵的措施，但超過 80% 的患者就診時已失去手術切除的機會[1-2]。因此，研究胰腺癌發生、發展、侵襲和轉移的機制，對于胰腺癌的診斷和治療有重要意義。近年來，微小 RNA（microRNA，miRNA）和胰腺癌的相關性以及 miRNA 用于胰腺癌的診斷已成為研究的熱點[3-5]，其中血清 miRNA-21和 miRNA-155 水平對于診斷胰腺癌顯示出很大的潛力[6-7]。為了解胰腺癌的血清 miRNA-21 和 miRNA-155 水平的變化情況，本研究分別對胰腺癌患者和胰腺癌大鼠模型的血清 miRNA-21 和 miRNA-155 水平進行了檢測，現報道如下。
1 資料和方法
1.1 胰腺腫物患者的臨床資料及血清標本采集
前瞻性收集 2016 年 1 月至 2016 年 12 月期間福建醫科大學附屬協和醫院收治的胰腺腫物患者的臨床資料及血清樣本。胰腺癌組患者納入標準：① 年齡 18～75 歲；② 初次就診，入院診斷為胰腺腫物；③ 原發性胰腺病變或遠處轉移性病變經病理學診斷為胰腺癌；④ 同意采集血清樣本并簽署知情同意書。胰腺良性疾病組患者的納入標準：① 年齡 18～75 歲；② 初次就診，入院診斷為胰腺腫物；③ 胰腺病變經病理學診斷為良性胰腺疾病；④ 同意采集血清樣本并簽署知情同意書。2 組的排除標準一致：① 既往有惡性腫瘤病史；② 未獲得明確的病理學診斷；③ 合并感染性疾病；④ 合并嚴重心血管及肺部疾病；⑤ 合并嚴重肝和腎功能異常；⑥ 合并血液系統或結締組織病。
本研究胰腺癌組納入 18 例患者，胰腺良性疾病組納入 12 例患者。所有患者的診斷均經病理學檢查證實。18 例胰腺癌患者中，男 9 例，女 9 例；年齡 38～71 歲，平均年齡為 61 歲；10 例為胰頭癌，8 例為胰體尾癌；TNM 分期：ⅠB 期 1 例，ⅡA 期 5 例，ⅡB 期 3 例，Ⅲ期 3 例，Ⅳ期 6 例；14 例 CA19-9 水平升高，4 例 CA19-9 水平正常。12 例胰腺良性疾病患者歸為胰腺良性疾病組，其中男 6 例，女 6 例；年齡 36～67 歲，平均年齡為 48 歲；疾病類型：胰腺漿液性囊腺瘤 4 例、胰腺黏液性囊腺瘤 4 例，慢性胰腺炎 2 例，胰腺實性假乳頭狀瘤 2 例。胰腺癌組和胰腺良性疾病組患者的性別和年齡比較差異均無統計學意義（P>0.05）。所有患者的采血時間為首次入院次日的清晨（06∶00–07∶00）。以常規方法采集 5 mL 靜脈血至無添加劑采血管中，于常溫下靜置 1 h 后離心（4 ℃，10 000 r/min，r=8 cm，5 min），移取上層 1 mL 血清轉入 EP 管， 放入 1 mL TRIzol 液，置 –80 ℃ 超低溫冰箱中備用。本研究獲得福建醫科大學附屬協和醫院倫理委員會審批，患者及家屬均知情同意并簽知情同意書。
1.2 胰腺癌大鼠模型的建立及血清標本采集
將 30 只 SD 大鼠（SPF 級，5～6 周，體質量 150～170 g，購買于福建醫科大學動物實驗中心，批號為 FDS20160319）隨機分為 2 組（隨機數字表法）：實驗組 20 只和空白對照組 10 只。術前禁食 12 h，不禁水。按 0.8 mL/100 g 劑量使用 5% 水合氯醛溶液行腹腔注射麻醉。實驗組大鼠行胰腺體尾部的 7, 12-二甲基苯并蒽（DMBA）包埋，過程如下：消毒皮膚，取左上腹橫切口約 2 cm 長，逐層切開進腹，顯露胰體尾及脾臟，展平胰體尾，選取相對較厚實區域的胰腺，以 6-0 縫線預置 1 個直徑約 1 cm 大的荷包，用鑷子輕輕提起荷包中央處的胰腺被膜，以眼科剪將被膜剪開一小口并做被膜下鈍性分離，形成胰腺被膜下隧道，用小勺取 7 mg 的 DMBA 小心置入隧道內，收緊荷包并打結，完成 DMBA 的胰腺包埋。空白對照組大鼠行假手術，操作同實驗組，但不埋入 DMBA。12 周后將大鼠處死：大鼠經異氟醚吸入麻醉后，暴露腹腔，經腹主動脈取血 5 mL 后處死。血液標本常溫下靜置 1 h 后離心（4 ℃，10 000 r/min，r=8 cm，5 min），移取上層 1 mL 血清，加入 1 mL TRIzol 溶液，放入–80 ℃超低溫冰箱中備用。切取大鼠胰體尾組織，經固定、包埋、切片、染色等步驟后行病理學檢查，確定是否建模成功，根據病理學結果進行分組。
1.3 主要試劑及儀器
TRIzol 購自美國 Invitrogen 公司，PCR 引物由上海吉瑪公司設計并合成，各引物序列信息見表 1。實時熒光定量通用試劑（GMRS-001 ）為上海吉瑪公司產品，MX3000P 實時熒光定量 PCR 儀為美國 Stratagene 公司產品。
表1
各引物的序列及長度
1.4 PCR 法檢測血清中 miRNA-21 和 miRNA-155 的表達
按照流程提取血清總 RNA。以 2 ng 總 RNA 進行逆轉錄后，采用實時熒光定量體系檢測血清中 miRNA-21 和 miRNA-155 的表達水平，反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s，共 40 個循環。反應體系同試劑盒說明書。以 miRNA-16 為內參對照。每個樣本每次實驗設置 3 個樣孔，目的基因的相對表達水平采用 2–△△Ct法計算[8]，其中 Ct 值是每個樣本達到閾值的最低循環數，△Ct 值為目標基因和內參基因 Ct 值的差值，△△Ct 為目標基因△Ct 值和對照組平均△Ct 值之間的差值。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 23.0 統計軟件進行分析，服從正態分布的計量資料的組間比較采用成組t檢驗，非正態分布的計量資料的組間比較采用兩獨立樣本比較的秩和檢驗，計數資料的組間比較采用成組χ2檢驗或 Fisher 精確概率法。繪制 miRNAs 區別胰腺癌和胰腺良性疾病的受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，并計算曲線下面積（area under curve，AUC）以評價診斷效能。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 胰腺癌和胰腺良性疾病患者血清中 miRNA-21和 miRNA-155 的表達情況
胰腺癌組患者血清中 miRNA-21 和 miRNA-155 的中位表達水平分別為 1.99（1.43～5.30）和 7.06（4.98～21.48），胰腺良性疾病組患者血清中 miRNA-21 和 miRNA-155 的中位表達水平分別為 1.28（0.58～2.01）和 2.20（1.76～3.02），胰腺癌組患者的血清 miRNA-21 和 miRNA-155 表達水平均較高，差異均有統計學意義（Z=–2.621，P=0.009；Z=–3.430，P=0.001）。
2.2 胰腺癌大鼠和空白對照組大鼠血清中miRNA-21和 miRNA-155 的表達情況
實驗期間實驗組的大鼠因麻醉意外死亡 1 只，余 19 只大鼠中有 11 只大鼠的病理學診斷為胰腺導管腺癌（圖 1），其血清歸入胰腺癌大鼠組；空白對照組的 10 只大鼠中因麻醉意外死亡 1 只，余 9 只大鼠的胰腺組織行病理學檢查未見胰腺腫瘤，其血清歸入空白對照組。
胰腺癌大鼠組血清中 miRNA-21 和 miRNA-155 的中位表達水平分別為 2.12（1.33～2.72）和 16.45（7.18～25.40），空白對照組大鼠血清中 miRNA-21 和 miRNA-155 的中位表達水平分別為 1.00（0.45～1.60）和 1.49（1.25～1.97），胰腺癌大鼠組血清中 miRNA-21 和 miRNA-155 的表達水平均較高，差異均有統計學意義（Z=–2.621，P=0.009；Z=–3.609，P<0.001）。
圖1
病理學檢查示大鼠胰腺導管腺癌（黑箭），見癌細胞不規則排列，纖維間質豐富（HE ×400）
2.3 血清 miRNA-21 和 miRNA-155 水平的診斷效能
通過繪制血清 miRNA-21 和 miRNA-155 表達水平的 ROC 曲線來評價兩者對胰腺癌的診斷效能（圖 2），結果表明，血清 miRNA-21 表達水平的最佳界值為 4.21，此時其靈敏度和特異度分別為 75.0% 和 61.1%，AUC值為 0.764，P=0.016；血清 miRNA-155 表達水平的最佳界值為 4.67，此時其靈敏度和特異度均為 83.3%，AUC值為 0.875，P=0.001。該結果提示，血清 miRNA-21 和 miRNA-155 的表達水平可以較好地區分胰腺癌和胰腺良性疾病。
圖2
示血清 miRNA-21 和 miRNA-155 表達水平診斷胰腺癌和胰腺良性疾病的 ROC 曲線
3 討論
胰腺癌的惡性程度高、進展迅速，早期診斷是改善胰腺癌預后最關鍵的措施。目前 CT、MRI 等影像學方法對于胰腺癌的檢出率受到腫瘤直徑的影響[9-10]，存在較大的局限性，因此，尋找敏感且特異的血清標志物仍然是早期診斷胰腺癌的熱點。目前診斷胰腺癌的最常用的血清標志物仍然是CA19-9。CA19-9 與 Lewis 抗原有關，有 5%～10% 的人群不表達 CA19-9[11]，腫瘤直徑小于 3 cm 的胰腺癌患者中血清 CA19-9 升高的比例僅為 50%[12]，而且血清 CA19-9 水平在一些良性疾病和消化系統其他惡性腫瘤中也會升高[13]。因此，CA19-9 診斷胰腺癌的靈敏度和特異度均不夠理想。Goonetilleke 等[14]對 26 項研究共計 2 283 例患者進行了文獻回顧性分析，發現 CA19-9 診斷胰腺癌的靈敏度為 79% ［95% CI為（70%，90%）］，特異度為 82% ［95% CI為（68%，91%）］。本組胰腺癌患者中 CA19-9 水平升高的比例為 77.8%（14/18），與文獻報道[14]相近。雖然 CA19-9 是目前診斷胰腺癌最常用的指標，但確實不夠理想。
目前已有不少研究[15-16]表明，胰腺癌患者血清中的 miRNAs 存在差異性表達，一些單一 miRNA 或者 miRNAs 組合已經顯示出鑒別胰腺癌和健康對照/慢性胰腺炎的潛力。Kawaguchi 等[15]發現，胰腺癌患者血清中的 miRNA-221 水平較健康對照組顯著升高，診斷胰腺癌的AUC值為 0.743。Schultz等[16]研究了血液中 2 種 miRNAs 組合診斷胰腺癌的價值：組合 1（miRNA-145、miRNA-150、miRNA-223 及 miRNA-636）的靈敏度為 85%，特異度為 64%，AUC值為 0.86；組合 2（miRNA-636、miRNA-26b、miRNA-223、miRNA-122、miRNA-150、miRNA-145、miRNA-505、miRNA-34a、miRNA-885.5p 及 miRNA-126）的靈敏度和特異度均為 85%，AUC值為 0.93。1 篇納入 12 項研究的 meta 分析[17]納入了 1 060 份胰腺癌患者和 935 份健康對照者的血樣，結果顯示，這些研究中各種單一 miRNA 及 miRNAs組合的合并靈敏度為 87% ［95% CI為（85%，89%）］，特異度為 92% ［95% CI為（90%，94%）］，顯示了血液 miRNA 表達水平具備區分胰腺癌和非胰腺癌對照者的診斷價值。
既往的研究[18-20]發現，胰腺癌患者的血清中miRNA-21 表達水平顯著升高，這些研究中胰腺癌的對照一般為正常健康對照。本研究結果則顯示，胰腺癌患者血清中的 miRNA-21 表達水平高于胰腺良性疾病組，更有利于對胰腺癌的鑒別診斷。本研究的動物實驗結果也顯示，胰腺癌大鼠血清中的 miRNA-21 表達水平高于空白對照組大鼠，胰腺癌患者和胰腺癌大鼠血清中 miRNA-21 表達水平的變化趨勢是相同的。已有研究[21]證明，早在癌前病變胰腺上皮內瘤變（pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN）階段，胰腺組織中 miRNA-21 的表達水平已異常升高。miRNA-21 的異常高表達是胰腺癌發生發展過程中的特征性改變之一，檢測血清中 miRNA-21 的表達水平對于胰腺癌的診斷具有重要意義。
相比于健康對照和慢性胰腺炎，胰腺癌患者血清中的 miRNA-155 水平異常升高[22-23]。本研究也進一步證實了胰腺癌患者血清中的 miRNA-155 表達水平較胰腺良性疾病患者升高。在動物實驗中，本研究也表明，胰腺癌大鼠血清中 miRNA-155 同樣呈明顯高表達。不同 miRNA 進入血循環的方式及機制尚未明確，這與其在胰腺癌組織中表達位置的不同可能有關。比如，miRNA-21 主要表達在胰腺癌細胞中，而 miRNA-155 主要在間質中高表達[24]。在癌前病變 PanIN 階段，miRNA-155 在 PanIN-2 組織中即存在異常高表達，比 PanIN-3 階段才異常表達的 miRNA-21 更早出現，提示其在胰腺癌的早期發生過程中具有重要意義[25]，miRNA-155 有望在胰腺癌的診斷甚至早期診斷中體現出價值。
本研究結果顯示，血清 miRNA-21 和 miRNA-155 表達水平診斷胰腺癌的AUC值分別是 0.764 和 0.875，其中 miRNA-155 的AUC值接近 0.9，更為理想。血清 CA19-9 診斷胰腺癌的靈敏度和特異度約分別為 79% 和 82%[14]，本研究中血清 miRNA-155 的靈敏度和特異度均達到了 83.3%，略高于 CA19-9，體現出了一定的診斷潛力。
綜上所述，胰腺癌患者血清中 miRNA-21 和 miRNA-155 的表達水平均高于胰腺良性疾病組，胰腺癌大鼠血清中的 miRNA-21 和 miRNA-155 的表達水平也較空白對照組異常升高。血清 miRNA-155 水平具有較高的靈敏度和特異度，可以較好地區分胰腺癌和胰腺良性疾病。血清 miRNA 檢測有望成為胰腺癌診斷方面的一種有效的新方法。
胰腺癌是惡性程度最高、預后最差的消化系統惡性腫瘤，5 年生存率僅 5%～8%，手術切除是治療胰腺癌最關鍵的措施，但超過 80% 的患者就診時已失去手術切除的機會[1-2]。因此，研究胰腺癌發生、發展、侵襲和轉移的機制，對于胰腺癌的診斷和治療有重要意義。近年來，微小 RNA（microRNA，miRNA）和胰腺癌的相關性以及 miRNA 用于胰腺癌的診斷已成為研究的熱點[3-5]，其中血清 miRNA-21和 miRNA-155 水平對于診斷胰腺癌顯示出很大的潛力[6-7]。為了解胰腺癌的血清 miRNA-21 和 miRNA-155 水平的變化情況，本研究分別對胰腺癌患者和胰腺癌大鼠模型的血清 miRNA-21 和 miRNA-155 水平進行了檢測，現報道如下。
1 資料和方法
1.1 胰腺腫物患者的臨床資料及血清標本采集
前瞻性收集 2016 年 1 月至 2016 年 12 月期間福建醫科大學附屬協和醫院收治的胰腺腫物患者的臨床資料及血清樣本。胰腺癌組患者納入標準：① 年齡 18～75 歲；② 初次就診，入院診斷為胰腺腫物；③ 原發性胰腺病變或遠處轉移性病變經病理學診斷為胰腺癌；④ 同意采集血清樣本并簽署知情同意書。胰腺良性疾病組患者的納入標準：① 年齡 18～75 歲；② 初次就診，入院診斷為胰腺腫物；③ 胰腺病變經病理學診斷為良性胰腺疾病；④ 同意采集血清樣本并簽署知情同意書。2 組的排除標準一致：① 既往有惡性腫瘤病史；② 未獲得明確的病理學診斷；③ 合并感染性疾病；④ 合并嚴重心血管及肺部疾病；⑤ 合并嚴重肝和腎功能異常；⑥ 合并血液系統或結締組織病。
本研究胰腺癌組納入 18 例患者，胰腺良性疾病組納入 12 例患者。所有患者的診斷均經病理學檢查證實。18 例胰腺癌患者中，男 9 例，女 9 例；年齡 38～71 歲，平均年齡為 61 歲；10 例為胰頭癌，8 例為胰體尾癌；TNM 分期：ⅠB 期 1 例，ⅡA 期 5 例，ⅡB 期 3 例，Ⅲ期 3 例，Ⅳ期 6 例；14 例 CA19-9 水平升高，4 例 CA19-9 水平正常。12 例胰腺良性疾病患者歸為胰腺良性疾病組，其中男 6 例，女 6 例；年齡 36～67 歲，平均年齡為 48 歲；疾病類型：胰腺漿液性囊腺瘤 4 例、胰腺黏液性囊腺瘤 4 例，慢性胰腺炎 2 例，胰腺實性假乳頭狀瘤 2 例。胰腺癌組和胰腺良性疾病組患者的性別和年齡比較差異均無統計學意義（P>0.05）。所有患者的采血時間為首次入院次日的清晨（06∶00–07∶00）。以常規方法采集 5 mL 靜脈血至無添加劑采血管中，于常溫下靜置 1 h 后離心（4 ℃，10 000 r/min，r=8 cm，5 min），移取上層 1 mL 血清轉入 EP 管， 放入 1 mL TRIzol 液，置 –80 ℃ 超低溫冰箱中備用。本研究獲得福建醫科大學附屬協和醫院倫理委員會審批，患者及家屬均知情同意并簽知情同意書。
1.2 胰腺癌大鼠模型的建立及血清標本采集
將 30 只 SD 大鼠（SPF 級，5～6 周，體質量 150～170 g，購買于福建醫科大學動物實驗中心，批號為 FDS20160319）隨機分為 2 組（隨機數字表法）：實驗組 20 只和空白對照組 10 只。術前禁食 12 h，不禁水。按 0.8 mL/100 g 劑量使用 5% 水合氯醛溶液行腹腔注射麻醉。實驗組大鼠行胰腺體尾部的 7, 12-二甲基苯并蒽（DMBA）包埋，過程如下：消毒皮膚，取左上腹橫切口約 2 cm 長，逐層切開進腹，顯露胰體尾及脾臟，展平胰體尾，選取相對較厚實區域的胰腺，以 6-0 縫線預置 1 個直徑約 1 cm 大的荷包，用鑷子輕輕提起荷包中央處的胰腺被膜，以眼科剪將被膜剪開一小口并做被膜下鈍性分離，形成胰腺被膜下隧道，用小勺取 7 mg 的 DMBA 小心置入隧道內，收緊荷包并打結，完成 DMBA 的胰腺包埋。空白對照組大鼠行假手術，操作同實驗組，但不埋入 DMBA。12 周后將大鼠處死：大鼠經異氟醚吸入麻醉后，暴露腹腔，經腹主動脈取血 5 mL 后處死。血液標本常溫下靜置 1 h 后離心（4 ℃，10 000 r/min，r=8 cm，5 min），移取上層 1 mL 血清，加入 1 mL TRIzol 溶液，放入–80 ℃超低溫冰箱中備用。切取大鼠胰體尾組織，經固定、包埋、切片、染色等步驟后行病理學檢查，確定是否建模成功，根據病理學結果進行分組。
1.3 主要試劑及儀器
TRIzol 購自美國 Invitrogen 公司，PCR 引物由上海吉瑪公司設計并合成，各引物序列信息見表 1。實時熒光定量通用試劑（GMRS-001 ）為上海吉瑪公司產品，MX3000P 實時熒光定量 PCR 儀為美國 Stratagene 公司產品。
表1
各引物的序列及長度
1.4 PCR 法檢測血清中 miRNA-21 和 miRNA-155 的表達
按照流程提取血清總 RNA。以 2 ng 總 RNA 進行逆轉錄后，采用實時熒光定量體系檢測血清中 miRNA-21 和 miRNA-155 的表達水平，反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s，共 40 個循環。反應體系同試劑盒說明書。以 miRNA-16 為內參對照。每個樣本每次實驗設置 3 個樣孔，目的基因的相對表達水平采用 2–△△Ct法計算[8]，其中 Ct 值是每個樣本達到閾值的最低循環數，△Ct 值為目標基因和內參基因 Ct 值的差值，△△Ct 為目標基因△Ct 值和對照組平均△Ct 值之間的差值。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 23.0 統計軟件進行分析，服從正態分布的計量資料的組間比較采用成組t檢驗，非正態分布的計量資料的組間比較采用兩獨立樣本比較的秩和檢驗，計數資料的組間比較采用成組χ2檢驗或 Fisher 精確概率法。繪制 miRNAs 區別胰腺癌和胰腺良性疾病的受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，并計算曲線下面積（area under curve，AUC）以評價診斷效能。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 胰腺癌和胰腺良性疾病患者血清中 miRNA-21和 miRNA-155 的表達情況
胰腺癌組患者血清中 miRNA-21 和 miRNA-155 的中位表達水平分別為 1.99（1.43～5.30）和 7.06（4.98～21.48），胰腺良性疾病組患者血清中 miRNA-21 和 miRNA-155 的中位表達水平分別為 1.28（0.58～2.01）和 2.20（1.76～3.02），胰腺癌組患者的血清 miRNA-21 和 miRNA-155 表達水平均較高，差異均有統計學意義（Z=–2.621，P=0.009；Z=–3.430，P=0.001）。
2.2 胰腺癌大鼠和空白對照組大鼠血清中miRNA-21和 miRNA-155 的表達情況
實驗期間實驗組的大鼠因麻醉意外死亡 1 只，余 19 只大鼠中有 11 只大鼠的病理學診斷為胰腺導管腺癌（圖 1），其血清歸入胰腺癌大鼠組；空白對照組的 10 只大鼠中因麻醉意外死亡 1 只，余 9 只大鼠的胰腺組織行病理學檢查未見胰腺腫瘤，其血清歸入空白對照組。
胰腺癌大鼠組血清中 miRNA-21 和 miRNA-155 的中位表達水平分別為 2.12（1.33～2.72）和 16.45（7.18～25.40），空白對照組大鼠血清中 miRNA-21 和 miRNA-155 的中位表達水平分別為 1.00（0.45～1.60）和 1.49（1.25～1.97），胰腺癌大鼠組血清中 miRNA-21 和 miRNA-155 的表達水平均較高，差異均有統計學意義（Z=–2.621，P=0.009；Z=–3.609，P<0.001）。
圖1
病理學檢查示大鼠胰腺導管腺癌（黑箭），見癌細胞不規則排列，纖維間質豐富（HE ×400）
2.3 血清 miRNA-21 和 miRNA-155 水平的診斷效能
通過繪制血清 miRNA-21 和 miRNA-155 表達水平的 ROC 曲線來評價兩者對胰腺癌的診斷效能（圖 2），結果表明，血清 miRNA-21 表達水平的最佳界值為 4.21，此時其靈敏度和特異度分別為 75.0% 和 61.1%，AUC值為 0.764，P=0.016；血清 miRNA-155 表達水平的最佳界值為 4.67，此時其靈敏度和特異度均為 83.3%，AUC值為 0.875，P=0.001。該結果提示，血清 miRNA-21 和 miRNA-155 的表達水平可以較好地區分胰腺癌和胰腺良性疾病。
圖2
示血清 miRNA-21 和 miRNA-155 表達水平診斷胰腺癌和胰腺良性疾病的 ROC 曲線
3 討論
胰腺癌的惡性程度高、進展迅速，早期診斷是改善胰腺癌預后最關鍵的措施。目前 CT、MRI 等影像學方法對于胰腺癌的檢出率受到腫瘤直徑的影響[9-10]，存在較大的局限性，因此，尋找敏感且特異的血清標志物仍然是早期診斷胰腺癌的熱點。目前診斷胰腺癌的最常用的血清標志物仍然是CA19-9。CA19-9 與 Lewis 抗原有關，有 5%～10% 的人群不表達 CA19-9[11]，腫瘤直徑小于 3 cm 的胰腺癌患者中血清 CA19-9 升高的比例僅為 50%[12]，而且血清 CA19-9 水平在一些良性疾病和消化系統其他惡性腫瘤中也會升高[13]。因此，CA19-9 診斷胰腺癌的靈敏度和特異度均不夠理想。Goonetilleke 等[14]對 26 項研究共計 2 283 例患者進行了文獻回顧性分析，發現 CA19-9 診斷胰腺癌的靈敏度為 79% ［95% CI為（70%，90%）］，特異度為 82% ［95% CI為（68%，91%）］。本組胰腺癌患者中 CA19-9 水平升高的比例為 77.8%（14/18），與文獻報道[14]相近。雖然 CA19-9 是目前診斷胰腺癌最常用的指標，但確實不夠理想。
目前已有不少研究[15-16]表明，胰腺癌患者血清中的 miRNAs 存在差異性表達，一些單一 miRNA 或者 miRNAs 組合已經顯示出鑒別胰腺癌和健康對照/慢性胰腺炎的潛力。Kawaguchi 等[15]發現，胰腺癌患者血清中的 miRNA-221 水平較健康對照組顯著升高，診斷胰腺癌的AUC值為 0.743。Schultz等[16]研究了血液中 2 種 miRNAs 組合診斷胰腺癌的價值：組合 1（miRNA-145、miRNA-150、miRNA-223 及 miRNA-636）的靈敏度為 85%，特異度為 64%，AUC值為 0.86；組合 2（miRNA-636、miRNA-26b、miRNA-223、miRNA-122、miRNA-150、miRNA-145、miRNA-505、miRNA-34a、miRNA-885.5p 及 miRNA-126）的靈敏度和特異度均為 85%，AUC值為 0.93。1 篇納入 12 項研究的 meta 分析[17]納入了 1 060 份胰腺癌患者和 935 份健康對照者的血樣，結果顯示，這些研究中各種單一 miRNA 及 miRNAs組合的合并靈敏度為 87% ［95% CI為（85%，89%）］，特異度為 92% ［95% CI為（90%，94%）］，顯示了血液 miRNA 表達水平具備區分胰腺癌和非胰腺癌對照者的診斷價值。
既往的研究[18-20]發現，胰腺癌患者的血清中miRNA-21 表達水平顯著升高，這些研究中胰腺癌的對照一般為正常健康對照。本研究結果則顯示，胰腺癌患者血清中的 miRNA-21 表達水平高于胰腺良性疾病組，更有利于對胰腺癌的鑒別診斷。本研究的動物實驗結果也顯示，胰腺癌大鼠血清中的 miRNA-21 表達水平高于空白對照組大鼠，胰腺癌患者和胰腺癌大鼠血清中 miRNA-21 表達水平的變化趨勢是相同的。已有研究[21]證明，早在癌前病變胰腺上皮內瘤變（pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN）階段，胰腺組織中 miRNA-21 的表達水平已異常升高。miRNA-21 的異常高表達是胰腺癌發生發展過程中的特征性改變之一，檢測血清中 miRNA-21 的表達水平對于胰腺癌的診斷具有重要意義。
相比于健康對照和慢性胰腺炎，胰腺癌患者血清中的 miRNA-155 水平異常升高[22-23]。本研究也進一步證實了胰腺癌患者血清中的 miRNA-155 表達水平較胰腺良性疾病患者升高。在動物實驗中，本研究也表明，胰腺癌大鼠血清中 miRNA-155 同樣呈明顯高表達。不同 miRNA 進入血循環的方式及機制尚未明確，這與其在胰腺癌組織中表達位置的不同可能有關。比如，miRNA-21 主要表達在胰腺癌細胞中，而 miRNA-155 主要在間質中高表達[24]。在癌前病變 PanIN 階段，miRNA-155 在 PanIN-2 組織中即存在異常高表達，比 PanIN-3 階段才異常表達的 miRNA-21 更早出現，提示其在胰腺癌的早期發生過程中具有重要意義[25]，miRNA-155 有望在胰腺癌的診斷甚至早期診斷中體現出價值。
本研究結果顯示，血清 miRNA-21 和 miRNA-155 表達水平診斷胰腺癌的AUC值分別是 0.764 和 0.875，其中 miRNA-155 的AUC值接近 0.9，更為理想。血清 CA19-9 診斷胰腺癌的靈敏度和特異度約分別為 79% 和 82%[14]，本研究中血清 miRNA-155 的靈敏度和特異度均達到了 83.3%，略高于 CA19-9，體現出了一定的診斷潛力。
綜上所述，胰腺癌患者血清中 miRNA-21 和 miRNA-155 的表達水平均高于胰腺良性疾病組，胰腺癌大鼠血清中的 miRNA-21 和 miRNA-155 的表達水平也較空白對照組異常升高。血清 miRNA-155 水平具有較高的靈敏度和特異度，可以較好地區分胰腺癌和胰腺良性疾病。血清 miRNA 檢測有望成為胰腺癌診斷方面的一種有效的新方法。
