引用本文： 夏鶴, 楊曉佳, 洪育蒲, 梅方超, 王衛星. apocynin 對急性壞死性胰腺炎大鼠肺組織的保護作用. 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(10): 1165-1170. doi: 10.7507/1007-9424.201804017 復制
急性壞死性胰腺炎（ANP）是由多種病因引起酶原異常激活的疾病，主要表現為壞死性炎癥[1]，易引發全身炎癥反應綜合征，可進展為肺、腎、肝、腸道等多器官損傷[2]，病死率高達 40%[3]。有研究[4]證實，肺是 ANP 時器官損傷的主要器官之一，而氧自由基是 ANP 肺損傷的關鍵因素。還原性輔酶Ⅱ氧化酶（NOX2）是肺微小血管活性氧的主要來源[5]。本研究通過使用 NOX2 特異性抑制劑——香草乙酮（apocynin）下調 NOX2 的活性，以此探討其在減輕 ANP 肺損傷中的效果。
1 材料與方法
1.1 主要材料
二甲基亞砜（DMSO）和牛磺膽酸鈉（Sigma 公司），以無菌生理鹽水配制成合適濃度；apocynin（Santa 公司），以 DMSO 溶解至所需濃度。抗 NOX2抗體（Cell Signaling Technology 公司），免疫熒光二抗（Abcam 公司）。EliVision Super 檢測試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司，KIT-9921），DAB 試劑盒（武漢谷歌生物技術有限公司）。
1.2 實驗動物及分組
無特定病原體級 Wistar 大鼠 40 只（由湖北省疾病預防控制中心提供），體質量 200～250 g。大鼠均在標準環境下自由進食、進水。飼養適應 3～4 d 后用完全隨機法隨機分為 假手術組（SO 組，n=10）、ANP 模型組（ANP 組，n=12）、APO 治療組（APO 組，n=10）及 APO 藥物對照組（APO-CON 組，n=8）。
1.3 模型制備及干預
大鼠術前禁食 12 h，自由飲水，稱體質量。ANP 組及 APO 組造模用異氟烷氣體吸入麻醉，鋪巾后無菌操作下行上腹正中切口進腹，用鈍性細針頭通過十二指腸壁，經乳頭逆行穿刺膽胰管，用無損傷血管夾分別夾閉肝門處的膽總管及針頭插入部位的膽胰管，向膽胰管恒速（0.1 mL/min）注入 5% 牛磺膽酸鈉（1 mL/kg）后原位夾閉主胰管 5 min 后肉眼見胰腺水腫、出血、壞死時即表明 ANP 造模成功，逐層關腹縫合。術后皮下生理鹽水 2 mL/kg 補液。APO 組在造模前 30 min 經股靜脈注射 10% DMSO 溶解的 apocynin（50 mg/kg），APO-CON 組和 SO 組在與 APO 組相同時點經股靜脈分別注射 10% DMSO 溶解的 apocynin（50 mg/kg）和 10% DMSO（2 mL/kg），APO-CON 組和 SO 組僅翻動胰腺和十二指腸后即關腹，其麻醉及切口方式與 ANP 組相同。
1.4 標本采集及制備
4 組大鼠術后 12 h 時使用異氟烷再次麻醉，在無菌環境中行腹正中切口進腹，下腔靜脈快速采血（4～5 mL）后處死大鼠，血液標本在 4 ℃ 環境下 4 000 r/min（r=10 cm）離心 15 min 后于–20 ℃ 保存備用。取胰頭及肺組織 4% 多聚甲醛固定 24 h，行石蠟包埋切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色以及免疫組織化學和免疫熒光切片的制作。
1.5 生物化學指標檢測
采用武漢大學人民醫院檢驗科全自動生化分析儀（強生公司）測定血清淀粉酶（AMY）及脂肪酶（LIP）水平。大鼠肺組織中丙二醛（MDA）濃度及超氧化物歧化酶（SOD）活性分別使用 MDA 試劑盒（南京建成生物 A003-1）和 SOD 測定試劑盒（南京建成生物 A001-1）測定。
1.6 免疫熒光法檢測髓過氧化物酶（MPO）、CD68及 Toll 樣受體 4（TLR4）表達
檢測選取具有代表性的石蠟包埋切片，經脫蠟、水化、抗原修復后冷卻至室溫，0.2% Triton-X100 破膜處理 45 min，10% 驢血清封閉 1 h，一抗使用兔抗 CD68（1∶200）、兔抗 MPO（1∶400）、兔抗 TLR4（1∶200）孵育后 4 ℃ 過夜，熒光二抗以兔抗（波長 λ=488，Abcam）標記 CD68 和 MPO、以鼠抗（波長 λ=555，Abcam）標記 TLR4，孵育 1 h 后以含 DAPI 的封片樹脂封片（Abcam，ab104139）。免疫熒光切片均在顯微鏡下閱片后經 Image-pro plus 6.0 專業圖像分析軟件統計陽性熒光信號的累積光密度（IOD）作為結果判定標準。
1.7 免疫組織化學法檢測 NOX2、核因子（NF）-κB及腫瘤壞死因子（TNF）-α蛋白表達
檢測選取具有代表性的切片，經脫蠟、水化、抗原修復后冷卻至室溫，3% 過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，一抗（NOX2、NF-κB 及 TNF-α）孵育后 4 ℃ 過夜，二抗孵育后經 DAB 顯色，HE 染色，鹽酸乙醇分化后脫水、封片。免疫組織化學染色切片在顯微鏡下閱片，以組織被染成棕黃色為陽性，使用專業圖像分析軟件 Image pro plus 6.0 統計切片棕黃色區域的平均光密度，采用累積光密度/面積（IOD/Area）作為結果判定標準。
1.8 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計軟件對數據進行分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（
±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 LSD t 檢驗。計數資料以率或構成比表示，組間比較采用 χ2 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠血清中 AMY 和 LIP 水平以及肺組織中 MDA 濃度及 SOD 活性變化情況
圖1
示大鼠血清中 AMY 和 LIP 水平和大鼠肺組織中 MDA 濃度和 SOD 活性變化
a：AMY 水平；b：LIP 水平；c：MDA 濃度；d：SOD 活性。①：SO 組；②：ANP 組；③：APO 組；④：APO-CON 組。與 SO 組比較，*
2.1.1 AMY 和 LIP 水平
大鼠血清中 AMY 和 LIP 水平在 ANP 組均明顯高于 SO 組（P<0.05）、APO 組（P<0.05）和 APO-CON 組（P<0.05），其在 APO 組仍明顯高于 SO 組（P<0.05）和 APO-CON 組（P<0.05），在 APO-CON 組和 SO 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05），見圖 1a、1b。
2.1.2 MDA 濃度及 SOD 活性
① 大鼠肺組織中 MDA濃度在 ANP 組明顯高于 SO 組（P<0.05）、APO 組（P<0.05）和 APO-CON 組（P<0.05），其在 APO 組也明顯高于 SO 組（P<0.05）和 APO-CON 組（P<0.05），在APO-CON 組和 SO 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。② 大鼠肺組織中 SOD 活性在 ANP 組明顯低于 SO 組（P<0.05）、APO 組（P<0.05）和 APO-CON 組（P<0.05），其在 APO 組明顯低于 SO 組（P<0.05）和 APO-CON 組（P<0.05），在 APO-CON 組和 SO 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1c、1d。
2.2 大鼠肺組織中 NF-κB、NOX2 及 TNF-α 蛋白表達情況
大鼠肺組織中 NF-κB、NOX2 和 TNF-α 蛋白表達的免疫組織化學染色的定性結果見圖 2a，半定量結果見圖 2b–2d。
2.2.1 NF-κB 蛋白表達
NF-κB 蛋白陽性表達為視野內細胞質及細胞核或單純細胞核被染成棕黃色。SO 組大鼠肺組織中 NF-κB 陽性表達細胞較少，棕黃色染色多單純分布在細胞質中；NF-κB 蛋白陽性表達在 ANP 組明顯高于 SO 組（P<0.05）、APO組（P<0.05）和 APO-CON組（P<0.05），其在 APO 組中仍明顯高于SO 組（P<0.05）和 APO-CON組（P<0.05），在 SO 組和 APO-CON 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2b。
圖2
示免疫組織化學染色法檢測各組大鼠肺組織中 NF-κB、NOX2 及 TNF-α 蛋白表達的定性和半定量結果
a：為NF-κB、NOX2 及 TNF-α 蛋白表達的定性結果（免疫組織化學染色 ×200），虛線框內展示的是浸潤的 NOX2 和 TNF-α 陽性細胞；b–d：分別為NF-κB、NOX2 及 TNF-α蛋白的半定量結果， ①–④ 分別為SO 組、ANP 組、APO 組及 APO-CON 組，與 SO 組比較、*
2.2.2 NOX2 蛋白表達
NOX2 陽性表達為視野內細胞質被染成棕黃色。SO 組大鼠肺組織中 NOX2 陽性表達細胞較少，ANP 組相較于 SO 組、APO 組及APO-CON 組 NOX2 陽性表達明顯增高（P<0.05），APO 組相較于 APO-CON 組（P<0.05）和 SO 組（P<0.05）其陽性表達也增高，SO 組與 APO-CON 組比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 2c。
2.2.3 TNF-α 蛋白表達
TNF-α 蛋白陽性表達為視野內細胞質被染成棕黃色。ANP 組相對于 SO 組，TNF-α 染色可見血管旁成團陽性表達細胞及部分散在于肺組織內的陽性表達細胞，蛋白陽性表達明顯上升（P<0.05）。APO 組相較于 ANP 組蛋白陽性表達降低（P<0.05），但相對于 SO 組（P<0.05）和 APO-CON 組（P<0.05）仍上升。SO 組和 APO-CON 組比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 2d。
圖3
示免疫熒光染色法檢測各組大鼠肺組織中 MPO、 CD68 和 TLR4 表達的定性和半定量結果
a、b：為MPO、CD68 及TLR4 表達的定性結果（免疫熒光染色 ×200）；c–e：分別為MPO、CD68 及TLR4 表達的半定量結果， ①–④ 分別為SO 組、ANP 組、APO 組及 APO-CON 組，與 SO 組比較、*
2.3 大鼠肺組織中 MPO、CD68 和 TLR4 的表達
各組大鼠肺組織中 MPO、CD68 和 TLR4 免疫熒光法檢測的定性結果見圖 3a、3b，半定量結果見圖 3c–3e。
2.3.1 MPO
MPO 熒光陽性表達為視野內有核細胞的細胞質被激發綠色熒光（λ=488）。相對于 SO 組，ANP 組可見血管旁成團陽性表達的細胞及分布于肺組織間的陽性表達細胞，其 IOD 值明顯上升（P<0.05），APO 組相對于 ANP 組明顯下降（P<0.05），但相對于 SO 組（P<0.05）和 APO-CON 組（P<0.05）仍明顯上升，SO 組和 APO-CON 組比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 3c。
2.3.2 CD68 和 TLR4
大鼠 CD68 和 TLR4 雙標熒光的陽性表達為視野內有核細胞的細胞質被激發綠色熒光（CD68，λ=488）和紅色熒光（TLR4，λ=555）。ANP 組少見單純 CD68 陽性細胞、單純 TLR4 陽性細胞部分分布在組織間，雙標陽性細胞多分布于血管旁和組織間。IOD 值在 ANP 組明顯高于 SO 組（P<0.05），APO 組明顯低于 ANP 組（P<0.05），但仍明顯高于 APO-CON 組（P<0.05）和 SO 組（P<0.05），APO-CON 組和 SO 組比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 3d、3e。
3 討論
ANP 是一種具有高致死率的臨床重癥[6]，伴發多器官功能障礙者的死亡率高達 40%[7]，但至今仍無針對性藥物或臨床療法。ANP 發病后常能夠觀察到肺組織肺泡壁增厚、炎性細胞浸潤及肺水腫。一般認為肺損傷的原因為 ANP 后炎性介質到達肺小血管，從而引發肺組織炎性介質水平和活性氧水平上升、NF-κB 激活等，進而導致肺細胞死亡增加和肺功能障礙[8]。
NADPH 氧化酶即 NOX廣泛分布于人體各組織細胞中，有 NOX1～NOX6（大鼠體內缺乏 NOX5）6 種類型[9-11]，其中 NOX2 是分布最廣泛的一種。以往研究[12-14]發現，NOX 在心臟、肝臟、肺臟、腸黏膜及腦缺血再灌注損傷中均起重要作用。NOX 在一般組織損傷時參與合成大量活性氧，通過參與細胞信號轉導從而激活炎癥反應，對機體產生有益的影響[15]，甚至可減輕由組織損傷繼發的多器官功能障礙綜合征[16]；但在 ANP 中 NOX 表達水平上調和相伴隨的活性氧水平升高可引起體內氧化-抗氧化系統失衡，組織細胞內多種通路被激活[17]及 TNF-α 水平上升，從而引起進一步的組織損傷[18]，加重 ANP 的總體損傷水平。apocynin 是一種 NOX 特異性抑制劑，通過在細胞內形成同二聚體 diapocynin 抑制 NOX 活性[19]。多個研究[20-21]結果顯示，apocynin 在腸損傷、胰腺損傷及腦缺血再灌注損傷中可通過抑制 NOX 活性及有效降低組織活性氧水平而起到保護作用。因此，本研究假設 apocynin 可以通過抑制大鼠體內 NOX 活性及降低 ANP 時活性氧水平，進一步降低 TNF-α 表達水平，從而對 ANP 時的肺組織起到保護作用[22]。本研究建立 ANP 模型后，通過測量血清 AMY 和 LIP 水平反映胰腺組織損傷后 AMY 和 LIP 進入血液循環的量，以此評估大鼠 ANP 模型造模后 12 h 時的胰腺組織損傷程度和病理改變程度，結果顯示，ANP 組大鼠均產生了嚴重的胰腺原位損傷，同時采用 apocynin 干預后，見血清 AMY 和 LIP 水平顯著下降，結果提示，apocynin可以減輕 ANP 時組織損傷程度和病理改變程度，可能對 ANP 時的肺組織起到保護作用。
MDA 是細胞內膜系統上的脂質過氧化產物，其積累可直接反映細胞內膜結構被氧化損傷的程度。而 SOD 則是細胞清除氧自由基的常見酶類，通過促超氧化物發生歧化反應使超氧化物失去強氧化性[23]。NF-κB 為常見的反映炎癥水平的指標。本研究通過檢測大鼠肺組織中 NF-κB 表達和 SOD 活性及 MDA 濃度來評估組織炎癥、NF-κB 通路激活程度及組織氧化應激水平，同時用 NOX2 免疫組織化學染色評估 NOX 抑制劑 apocynin 的效果。結果發現，apocynin 可有效降低肺組織中 MDA 濃度，增強 SOD 活性，部分降低了肺組織中 NOX2 和 NF-κB 表達，結果提示，通過 apocynin 干預可有效降低組織氧化應激。有研究[24]結果顯示，NOX 及其產生的活性氧是 NF-κB 通路的重要激活因子，其結果可間接證實 apocynin 可通過降低組織氧化應激程度來下調 NF-κB 通路的激活水平。
活性氧水平升高可激活下游細胞因子 TNF-α 表達、促進細胞凋亡和激活 NF-κB 通路，TNF-α 可作為趨化因子介導炎性細胞浸潤。MPO 是常用的白細胞標志物，常大量表達于髓系細胞（如單核細胞、中性粒細胞）中。CD68 多表達于單核細胞系，常見于單核細胞、循環內巨噬細胞和組織間巨噬細胞。TLR4 屬于免疫細胞模式分子受體，可用以標記非特異性免疫類細胞（如巨噬細胞），同時參與 NF-κB 通路激活[25]。因此，本研究采用免疫組織化學法檢測 TNF-α 和免疫熒光技術檢測 MPO、CD68 和 TLR4 的表達反映組織浸潤程度和大致的細胞類型，結果發現，ANP 組相較于 SO 組有明顯的 MPO 陽性細胞浸潤，APO 組則以 CD68 陽性和部分 TLR4 陽性細胞浸潤為主，而 apocynin 干預在總體上減少免疫細胞浸潤的同時亦可降低 MPO 陽性細胞在浸潤細胞中的比例，使浸潤細胞類型更偏向于單核-巨噬細胞系。
綜上，apocynin 可通過抑制 NOX2 的活性和部分表達從而抑制 NF-κB 活化和組織氧化應激水平，降低 TNF-α 的表達，進而減輕組織炎癥細胞浸潤，達到保護肺組織損傷的作用，推測組織的氧化應激可能是 ANP 外周臟器損傷的關鍵因素，結果提示，干預組織氧化應激可能成為 ANP 治療的眾多方法中具有潛力的一種方法。但本研究中未對 APO 通過抑制 NOX2 活性減輕 ANP 肺損傷的具體機制進行闡明，也沒有說明 APO 在氧化應激細胞信號通路中的具體作用，這均有待于進一步研究。
急性壞死性胰腺炎（ANP）是由多種病因引起酶原異常激活的疾病，主要表現為壞死性炎癥[1]，易引發全身炎癥反應綜合征，可進展為肺、腎、肝、腸道等多器官損傷[2]，病死率高達 40%[3]。有研究[4]證實，肺是 ANP 時器官損傷的主要器官之一，而氧自由基是 ANP 肺損傷的關鍵因素。還原性輔酶Ⅱ氧化酶（NOX2）是肺微小血管活性氧的主要來源[5]。本研究通過使用 NOX2 特異性抑制劑——香草乙酮（apocynin）下調 NOX2 的活性，以此探討其在減輕 ANP 肺損傷中的效果。
1 材料與方法
1.1 主要材料
二甲基亞砜（DMSO）和牛磺膽酸鈉（Sigma 公司），以無菌生理鹽水配制成合適濃度；apocynin（Santa 公司），以 DMSO 溶解至所需濃度。抗 NOX2抗體（Cell Signaling Technology 公司），免疫熒光二抗（Abcam 公司）。EliVision Super 檢測試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司，KIT-9921），DAB 試劑盒（武漢谷歌生物技術有限公司）。
1.2 實驗動物及分組
無特定病原體級 Wistar 大鼠 40 只（由湖北省疾病預防控制中心提供），體質量 200～250 g。大鼠均在標準環境下自由進食、進水。飼養適應 3～4 d 后用完全隨機法隨機分為 假手術組（SO 組，n=10）、ANP 模型組（ANP 組，n=12）、APO 治療組（APO 組，n=10）及 APO 藥物對照組（APO-CON 組，n=8）。
1.3 模型制備及干預
大鼠術前禁食 12 h，自由飲水，稱體質量。ANP 組及 APO 組造模用異氟烷氣體吸入麻醉，鋪巾后無菌操作下行上腹正中切口進腹，用鈍性細針頭通過十二指腸壁，經乳頭逆行穿刺膽胰管，用無損傷血管夾分別夾閉肝門處的膽總管及針頭插入部位的膽胰管，向膽胰管恒速（0.1 mL/min）注入 5% 牛磺膽酸鈉（1 mL/kg）后原位夾閉主胰管 5 min 后肉眼見胰腺水腫、出血、壞死時即表明 ANP 造模成功，逐層關腹縫合。術后皮下生理鹽水 2 mL/kg 補液。APO 組在造模前 30 min 經股靜脈注射 10% DMSO 溶解的 apocynin（50 mg/kg），APO-CON 組和 SO 組在與 APO 組相同時點經股靜脈分別注射 10% DMSO 溶解的 apocynin（50 mg/kg）和 10% DMSO（2 mL/kg），APO-CON 組和 SO 組僅翻動胰腺和十二指腸后即關腹，其麻醉及切口方式與 ANP 組相同。
1.4 標本采集及制備
4 組大鼠術后 12 h 時使用異氟烷再次麻醉，在無菌環境中行腹正中切口進腹，下腔靜脈快速采血（4～5 mL）后處死大鼠，血液標本在 4 ℃ 環境下 4 000 r/min（r=10 cm）離心 15 min 后于–20 ℃ 保存備用。取胰頭及肺組織 4% 多聚甲醛固定 24 h，行石蠟包埋切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色以及免疫組織化學和免疫熒光切片的制作。
1.5 生物化學指標檢測
采用武漢大學人民醫院檢驗科全自動生化分析儀（強生公司）測定血清淀粉酶（AMY）及脂肪酶（LIP）水平。大鼠肺組織中丙二醛（MDA）濃度及超氧化物歧化酶（SOD）活性分別使用 MDA 試劑盒（南京建成生物 A003-1）和 SOD 測定試劑盒（南京建成生物 A001-1）測定。
1.6 免疫熒光法檢測髓過氧化物酶（MPO）、CD68及 Toll 樣受體 4（TLR4）表達
檢測選取具有代表性的石蠟包埋切片，經脫蠟、水化、抗原修復后冷卻至室溫，0.2% Triton-X100 破膜處理 45 min，10% 驢血清封閉 1 h，一抗使用兔抗 CD68（1∶200）、兔抗 MPO（1∶400）、兔抗 TLR4（1∶200）孵育后 4 ℃ 過夜，熒光二抗以兔抗（波長 λ=488，Abcam）標記 CD68 和 MPO、以鼠抗（波長 λ=555，Abcam）標記 TLR4，孵育 1 h 后以含 DAPI 的封片樹脂封片（Abcam，ab104139）。免疫熒光切片均在顯微鏡下閱片后經 Image-pro plus 6.0 專業圖像分析軟件統計陽性熒光信號的累積光密度（IOD）作為結果判定標準。
1.7 免疫組織化學法檢測 NOX2、核因子（NF）-κB及腫瘤壞死因子（TNF）-α蛋白表達
檢測選取具有代表性的切片，經脫蠟、水化、抗原修復后冷卻至室溫，3% 過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，一抗（NOX2、NF-κB 及 TNF-α）孵育后 4 ℃ 過夜，二抗孵育后經 DAB 顯色，HE 染色，鹽酸乙醇分化后脫水、封片。免疫組織化學染色切片在顯微鏡下閱片，以組織被染成棕黃色為陽性，使用專業圖像分析軟件 Image pro plus 6.0 統計切片棕黃色區域的平均光密度，采用累積光密度/面積（IOD/Area）作為結果判定標準。
1.8 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計軟件對數據進行分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（
±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 LSD t 檢驗。計數資料以率或構成比表示，組間比較采用 χ2 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠血清中 AMY 和 LIP 水平以及肺組織中 MDA 濃度及 SOD 活性變化情況
圖1
示大鼠血清中 AMY 和 LIP 水平和大鼠肺組織中 MDA 濃度和 SOD 活性變化
a：AMY 水平；b：LIP 水平；c：MDA 濃度；d：SOD 活性。①：SO 組；②：ANP 組；③：APO 組；④：APO-CON 組。與 SO 組比較，*
2.1.1 AMY 和 LIP 水平
大鼠血清中 AMY 和 LIP 水平在 ANP 組均明顯高于 SO 組（P<0.05）、APO 組（P<0.05）和 APO-CON 組（P<0.05），其在 APO 組仍明顯高于 SO 組（P<0.05）和 APO-CON 組（P<0.05），在 APO-CON 組和 SO 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05），見圖 1a、1b。
2.1.2 MDA 濃度及 SOD 活性
① 大鼠肺組織中 MDA濃度在 ANP 組明顯高于 SO 組（P<0.05）、APO 組（P<0.05）和 APO-CON 組（P<0.05），其在 APO 組也明顯高于 SO 組（P<0.05）和 APO-CON 組（P<0.05），在APO-CON 組和 SO 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。② 大鼠肺組織中 SOD 活性在 ANP 組明顯低于 SO 組（P<0.05）、APO 組（P<0.05）和 APO-CON 組（P<0.05），其在 APO 組明顯低于 SO 組（P<0.05）和 APO-CON 組（P<0.05），在 APO-CON 組和 SO 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1c、1d。
2.2 大鼠肺組織中 NF-κB、NOX2 及 TNF-α 蛋白表達情況
大鼠肺組織中 NF-κB、NOX2 和 TNF-α 蛋白表達的免疫組織化學染色的定性結果見圖 2a，半定量結果見圖 2b–2d。
2.2.1 NF-κB 蛋白表達
NF-κB 蛋白陽性表達為視野內細胞質及細胞核或單純細胞核被染成棕黃色。SO 組大鼠肺組織中 NF-κB 陽性表達細胞較少，棕黃色染色多單純分布在細胞質中；NF-κB 蛋白陽性表達在 ANP 組明顯高于 SO 組（P<0.05）、APO組（P<0.05）和 APO-CON組（P<0.05），其在 APO 組中仍明顯高于SO 組（P<0.05）和 APO-CON組（P<0.05），在 SO 組和 APO-CON 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2b。
圖2
示免疫組織化學染色法檢測各組大鼠肺組織中 NF-κB、NOX2 及 TNF-α 蛋白表達的定性和半定量結果
a：為NF-κB、NOX2 及 TNF-α 蛋白表達的定性結果（免疫組織化學染色 ×200），虛線框內展示的是浸潤的 NOX2 和 TNF-α 陽性細胞；b–d：分別為NF-κB、NOX2 及 TNF-α蛋白的半定量結果， ①–④ 分別為SO 組、ANP 組、APO 組及 APO-CON 組，與 SO 組比較、*
2.2.2 NOX2 蛋白表達
NOX2 陽性表達為視野內細胞質被染成棕黃色。SO 組大鼠肺組織中 NOX2 陽性表達細胞較少，ANP 組相較于 SO 組、APO 組及APO-CON 組 NOX2 陽性表達明顯增高（P<0.05），APO 組相較于 APO-CON 組（P<0.05）和 SO 組（P<0.05）其陽性表達也增高，SO 組與 APO-CON 組比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 2c。
2.2.3 TNF-α 蛋白表達
TNF-α 蛋白陽性表達為視野內細胞質被染成棕黃色。ANP 組相對于 SO 組，TNF-α 染色可見血管旁成團陽性表達細胞及部分散在于肺組織內的陽性表達細胞，蛋白陽性表達明顯上升（P<0.05）。APO 組相較于 ANP 組蛋白陽性表達降低（P<0.05），但相對于 SO 組（P<0.05）和 APO-CON 組（P<0.05）仍上升。SO 組和 APO-CON 組比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 2d。
圖3
示免疫熒光染色法檢測各組大鼠肺組織中 MPO、 CD68 和 TLR4 表達的定性和半定量結果
a、b：為MPO、CD68 及TLR4 表達的定性結果（免疫熒光染色 ×200）；c–e：分別為MPO、CD68 及TLR4 表達的半定量結果， ①–④ 分別為SO 組、ANP 組、APO 組及 APO-CON 組，與 SO 組比較、*
2.3 大鼠肺組織中 MPO、CD68 和 TLR4 的表達
各組大鼠肺組織中 MPO、CD68 和 TLR4 免疫熒光法檢測的定性結果見圖 3a、3b，半定量結果見圖 3c–3e。
2.3.1 MPO
MPO 熒光陽性表達為視野內有核細胞的細胞質被激發綠色熒光（λ=488）。相對于 SO 組，ANP 組可見血管旁成團陽性表達的細胞及分布于肺組織間的陽性表達細胞，其 IOD 值明顯上升（P<0.05），APO 組相對于 ANP 組明顯下降（P<0.05），但相對于 SO 組（P<0.05）和 APO-CON 組（P<0.05）仍明顯上升，SO 組和 APO-CON 組比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 3c。
2.3.2 CD68 和 TLR4
大鼠 CD68 和 TLR4 雙標熒光的陽性表達為視野內有核細胞的細胞質被激發綠色熒光（CD68，λ=488）和紅色熒光（TLR4，λ=555）。ANP 組少見單純 CD68 陽性細胞、單純 TLR4 陽性細胞部分分布在組織間，雙標陽性細胞多分布于血管旁和組織間。IOD 值在 ANP 組明顯高于 SO 組（P<0.05），APO 組明顯低于 ANP 組（P<0.05），但仍明顯高于 APO-CON 組（P<0.05）和 SO 組（P<0.05），APO-CON 組和 SO 組比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 3d、3e。
3 討論
ANP 是一種具有高致死率的臨床重癥[6]，伴發多器官功能障礙者的死亡率高達 40%[7]，但至今仍無針對性藥物或臨床療法。ANP 發病后常能夠觀察到肺組織肺泡壁增厚、炎性細胞浸潤及肺水腫。一般認為肺損傷的原因為 ANP 后炎性介質到達肺小血管，從而引發肺組織炎性介質水平和活性氧水平上升、NF-κB 激活等，進而導致肺細胞死亡增加和肺功能障礙[8]。
NADPH 氧化酶即 NOX廣泛分布于人體各組織細胞中，有 NOX1～NOX6（大鼠體內缺乏 NOX5）6 種類型[9-11]，其中 NOX2 是分布最廣泛的一種。以往研究[12-14]發現，NOX 在心臟、肝臟、肺臟、腸黏膜及腦缺血再灌注損傷中均起重要作用。NOX 在一般組織損傷時參與合成大量活性氧，通過參與細胞信號轉導從而激活炎癥反應，對機體產生有益的影響[15]，甚至可減輕由組織損傷繼發的多器官功能障礙綜合征[16]；但在 ANP 中 NOX 表達水平上調和相伴隨的活性氧水平升高可引起體內氧化-抗氧化系統失衡，組織細胞內多種通路被激活[17]及 TNF-α 水平上升，從而引起進一步的組織損傷[18]，加重 ANP 的總體損傷水平。apocynin 是一種 NOX 特異性抑制劑，通過在細胞內形成同二聚體 diapocynin 抑制 NOX 活性[19]。多個研究[20-21]結果顯示，apocynin 在腸損傷、胰腺損傷及腦缺血再灌注損傷中可通過抑制 NOX 活性及有效降低組織活性氧水平而起到保護作用。因此，本研究假設 apocynin 可以通過抑制大鼠體內 NOX 活性及降低 ANP 時活性氧水平，進一步降低 TNF-α 表達水平，從而對 ANP 時的肺組織起到保護作用[22]。本研究建立 ANP 模型后，通過測量血清 AMY 和 LIP 水平反映胰腺組織損傷后 AMY 和 LIP 進入血液循環的量，以此評估大鼠 ANP 模型造模后 12 h 時的胰腺組織損傷程度和病理改變程度，結果顯示，ANP 組大鼠均產生了嚴重的胰腺原位損傷，同時采用 apocynin 干預后，見血清 AMY 和 LIP 水平顯著下降，結果提示，apocynin可以減輕 ANP 時組織損傷程度和病理改變程度，可能對 ANP 時的肺組織起到保護作用。
MDA 是細胞內膜系統上的脂質過氧化產物，其積累可直接反映細胞內膜結構被氧化損傷的程度。而 SOD 則是細胞清除氧自由基的常見酶類，通過促超氧化物發生歧化反應使超氧化物失去強氧化性[23]。NF-κB 為常見的反映炎癥水平的指標。本研究通過檢測大鼠肺組織中 NF-κB 表達和 SOD 活性及 MDA 濃度來評估組織炎癥、NF-κB 通路激活程度及組織氧化應激水平，同時用 NOX2 免疫組織化學染色評估 NOX 抑制劑 apocynin 的效果。結果發現，apocynin 可有效降低肺組織中 MDA 濃度，增強 SOD 活性，部分降低了肺組織中 NOX2 和 NF-κB 表達，結果提示，通過 apocynin 干預可有效降低組織氧化應激。有研究[24]結果顯示，NOX 及其產生的活性氧是 NF-κB 通路的重要激活因子，其結果可間接證實 apocynin 可通過降低組織氧化應激程度來下調 NF-κB 通路的激活水平。
活性氧水平升高可激活下游細胞因子 TNF-α 表達、促進細胞凋亡和激活 NF-κB 通路，TNF-α 可作為趨化因子介導炎性細胞浸潤。MPO 是常用的白細胞標志物，常大量表達于髓系細胞（如單核細胞、中性粒細胞）中。CD68 多表達于單核細胞系，常見于單核細胞、循環內巨噬細胞和組織間巨噬細胞。TLR4 屬于免疫細胞模式分子受體，可用以標記非特異性免疫類細胞（如巨噬細胞），同時參與 NF-κB 通路激活[25]。因此，本研究采用免疫組織化學法檢測 TNF-α 和免疫熒光技術檢測 MPO、CD68 和 TLR4 的表達反映組織浸潤程度和大致的細胞類型，結果發現，ANP 組相較于 SO 組有明顯的 MPO 陽性細胞浸潤，APO 組則以 CD68 陽性和部分 TLR4 陽性細胞浸潤為主，而 apocynin 干預在總體上減少免疫細胞浸潤的同時亦可降低 MPO 陽性細胞在浸潤細胞中的比例，使浸潤細胞類型更偏向于單核-巨噬細胞系。
綜上，apocynin 可通過抑制 NOX2 的活性和部分表達從而抑制 NF-κB 活化和組織氧化應激水平，降低 TNF-α 的表達，進而減輕組織炎癥細胞浸潤，達到保護肺組織損傷的作用，推測組織的氧化應激可能是 ANP 外周臟器損傷的關鍵因素，結果提示，干預組織氧化應激可能成為 ANP 治療的眾多方法中具有潛力的一種方法。但本研究中未對 APO 通過抑制 NOX2 活性減輕 ANP 肺損傷的具體機制進行闡明，也沒有說明 APO 在氧化應激細胞信號通路中的具體作用，這均有待于進一步研究。
