引用本文： 王海清, 馮燮林. 表達“干細胞性”標志物肝細胞癌亞型的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(10): 1264-1269. doi: 10.7507/1007-9424.201803051 復制
肝細胞癌（HCC）是我國常見的肝臟原發腫瘤，起病隱匿，惡性程度高，臨床上只有 20% 的 HCC 患者能夠獲得根治性切除[1-2]，且其對放化療敏感性差，長期生存率低。因此，如何探索新的治療靶點和提高 HCC 患者生存率一直都是該領域的焦點。現有越來越多的研究發現有一部分 HCC 細胞表面表達了“干細胞性”標志物，這些標志物的表達很可能是 HCC 復發和轉移的根源，并認為是 HCC 的一種特殊亞型。筆者在此對表達“干細胞性”標志物 HCC 的特征及臨床病理表現進行綜述，為探索其新的靶向治療提供方向。
1 表達“干細胞性”標志物 HCC 亞型的定義
近年來，隨著 HCC 干細胞理論的提出，研究者[3-4]對 HCC 發生、發展、復發及轉移機制有了新認識，并為其治療及預后提供了新思路。但是目前的技術手段尚不能從形態學上鑒定腫瘤干細胞，而只能用功能學方法對其自我更新能力和分化潛能兩個主要生物學特征進行評價，也就是通過篩選 HCC 干細胞特性標志物這一技術手段來篩選干細胞[5]。但由于 HCC 在組織病理學、腫瘤形成和生物學行為方面具有異質性[6]，如部分正常肝組織或 HCC 細胞也可表達“干細胞性”標志物，而部分 HCC 干細胞并不表達“干細胞性”相關標志物，這也限制了 HCC 干細胞的鑒別及其在臨床上的應用。
目前研究[2]發現，最能體現 HCC 細胞惡性特征的是一部分表達“干細胞性”標志物的 HCC 細胞，其具有干細胞侵襲性強的特征，也是其復發和轉移的主要來源，研究者將這一類型的 HCC 稱為“干性相關標志物表達的肝細胞癌（hepatocellular carcinoma expressing stemness-related markers，HCC-ESM）”，其具有常規 HCC 一致的組織形態學特征，但至少有 5% 的腫瘤細胞經免疫組織化學檢測出表達肝干細胞相關的標志物，因此，將它定義為一類特殊的 HCC 亞型[1, 6-9]。
關于 HCC-ESM 的形成，推測其可能是來源于肝干細胞的惡性轉化或者是 HCC 在形成過程中干細胞的特征未能完全去分化[6]。但是 HCC-ESM 定義中關于“干細胞性”這一說法仍有爭議，因為這似乎在暗示這些腫瘤細胞具有干細胞功能，即與正常組織的干細胞具有相同的自我更新、無限增殖能力、多能性等功能特性[7]，而實際上其“干細胞性”指的是 HCC 細胞表面表達的一類“干細胞性”分子標志物，這些“干細胞性”特征代表了腫瘤細胞具有更強的侵襲性，這部分細胞大多數仍是成熟的 HCC 細胞，但也含有一部分 HCC 干細胞，而不是專指肝干細胞的腫瘤轉換以及具有干細胞的功能[1]。因此，目前對“干細胞性”特征的定義是根據其功能特征而并不是根據其細胞起源。
HCC-ESM 與常規 HCC 雖然在形態學上并沒有明顯的差異，但其侵襲性更強和預后更差，是 HCC 根治性治療后復發和轉移的關鍵[7]。
2 常見“干細胞性”標志物
肝細胞在分化成熟過程中的不同階段可表達不同的細胞表面標志物，這些標志物需要通過免疫組織化學進行篩選和鑒別。肝干細胞表面常表達 K7、K19、上皮細胞黏附分子（EpCAM）、CD56、甲胎蛋白（AFP）等標志物；同時肝干細胞具有雙向分化成膽管細胞和肝細胞的潛能，在分化成肝細胞后細胞表面不再表達 K7、K19、EpCAM 和 CD56，而表達肝細胞特異性標志物如 Hep Par1 等，但在分化成膽管細胞后細胞表面卻仍表達 K19 和 EpCAM[6]。因此，在鑒別 HCC-ESM 時，首先需要排除膽管細胞癌和肝細胞-膽管細胞混合癌。目前研究[1, 6-7, 10-13]已經鑒別的“干細胞性”標志物多達 10 余種，常見的為 EpCAM、CD133、K19、CD13、CD44 等。
2.1 EpCAM
EpCAM 屬于黏附分子家族，是腫瘤相關鈣信號轉導物 1 基因編碼的單次跨膜糖蛋白，由胞外結構域、單次跨膜結構域和胞內結構域三部分組成。胚胎時期肝細胞 EpCAM 表達陽性，而成熟肝細胞 EpCAM 表達陰性，但是膽管上皮細胞 EpCAM 表達為陽性，其作為上皮細胞間黏附分子在上皮細胞癌變過程中發揮著重要作用，主要通過調節細胞增殖、免疫逃逸等機制促進腫瘤的發生，并與腫瘤的遷移和侵襲性密切相關[14]；EpCAM 通過參與 β-連環蛋白依賴的 Wnt 級聯反應而激活 c-myc 基因、cyclin A/cyclin E 等原癌基因的表達，從而具有致瘤作用；同時 EpCAM 陽性 HCC 細胞內的聚 ADP 核糖聚合酶及由聚 ADP 核糖聚合酶募集的染色質域解螺旋酶 DNA 結合蛋白 4 可迅速修復 DNA 損傷、維持染色體穩定，從而增強腫瘤侵襲性。EpCAM 是 HCC 主要的表達標志物之一，其在 HCC 中表達陽性率為 19.9%～35%，EpCAM 表達陽性的 HCC 患者年齡更小、腫瘤直徑更小及分化程度低[10, 13, 15]。
2.2 CD133
CD133 是人類造血干細胞或祖細胞的 5 次跨膜糖蛋白分子，相對分子質量為 120×103，是最常見的“干細胞性”標志物之一，常在肝、肺、結直腸、前列腺等實體腫瘤細胞表面表達[16]，其在正常肝組織中可能參與肝臟的再生。早期研究[17]發現，CD133 陽性 HCC 細胞因具備自我更新及分化特征而具有強大的增殖及成瘤能力，其成瘤能力與絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）/磷脂酰肌醇 3 激酶（PI3K）信號通路的異常激活相關，而敲除 CD133 基因后則導致腫瘤細胞增殖及成瘤能力下降。文獻[18-19]報道，13.5%～24.8% 的 HCC-ESM 可表達 CD133。還有研究[15, 17]發現，CD133 更易出現在伴有肝硬化的 HCC 中，其陽性表達對早期 HCC 復發預測有一定價值。目前的一項研究[20]發現，血管內皮生長因子通過激活血管內皮生長因子受體-2、增加 CD133 陽性腫瘤細胞的數量和增強其自我更新能力，從而促進了 HCC 術后的復發。
2.3 CD44
CD44 是一個完整的跨膜糖蛋白，是透明質酸的受體，對細胞與基質之間的黏附、淋巴細胞的激活及歸巢、腫瘤的侵襲及轉移起著重要作用，主要參與了細胞間的黏附和遷移，并已發現其在 HCC 中可能與腫瘤細胞的侵襲和轉移相關。文獻[21]報道，在 HCC-ESM 中 CD44 表達陽性率可達到 78.35%。Gao 等[22]的一項研究發現，CD44 陽性細胞主要是通過轉化生長因子（TGF）β1 激活 Akt/GSK-3β/β-catenin 信號通路介導的上皮-間質轉化而促進腫瘤細胞的轉移，敲除 CD44 基因后 HCC 細胞轉移能力則明顯下降。
2.4 CD13
CD13 即氨肽酶 N，屬于 Zn2+結合的金屬蛋白酶超家族，由 967 個氨基酸組成的糖蛋白，在細胞膜上形成同源二聚體；在胞外部有近羧基端的結構域和近膜的結構域，前者結合底物，后者為酶催化區；是一種跨膜的金屬結合蛋白酶，能將氨基酸的氮端切除。有研究[23]發現，CD13 富集與 HCC 早期復發和較差的預后有關，CD13 可通過降解細胞外基質促進腫瘤的轉移，輔助血管生成增加腫瘤的侵襲性，還通過其蛋白水解功能、干擾抗原呈遞及逃避免疫識別，在腫瘤細胞的形成和發展中扮演重要的角色，CD13 是 HCC 的潛在治療靶點。
2.5 K19
K19 是一種膽管型細胞角蛋白，常表達于膽管細胞和肝干細胞，是最常見的 HCC“干細胞性”標志物。有文獻[11]報道，K19 在 HCC 中表達陽性率為 9.6%～25%，常與其他標志物共同表達，K19 表達陽性的 HCC-ESM 常有明顯增加的上皮-間質轉化，顯示了 K19 表達陽性的 HCC 細胞具有更強的侵襲性；同時還發現，K19 陽性表達的 HCC-ESM 具有腫瘤直徑更大、血管侵犯更常見、分化程度更差、腫瘤包膜不完整等特征。K19 能激活 TGFβ/Smad 通路，從而促進腫瘤的轉移。體外實驗[10]也表明，K19 陽性表達的 HCC 細胞更具有侵襲性，尤其是更容易侵犯基底膜，而當敲除 K19 基因后，其侵襲能力可下降 34.7%。
綜上，研究[11, 15]發現，HCC-ESM 中具有上述任何一種標志物的表達陽性率為 18%～59.8%，但大多數 HCC-ESM 具有 2 種或 2 種以上標志物的表達。在一項 282 例HCC標本的研究[15]中發現，2 種標志物表達陽性率占 26.4%，3 種占 11.5%，4 種占 2.3%。K19 是最常見的多表達標志物，一項研究[11]發現，92% 的 K19 陽性表達的 HCC 伴有其他標志物的表達。對于哪種標志物或者哪一類標志物能夠完全代表 HCC 的“干細胞性”目前仍沒有統一的認識。因為 HCC 干細胞的起源尚不清楚，有可能存在 3 種或 3 種以上的來源（如起源于干細胞、成熟的肝實質、骨髓細胞等），因此，有可能不存在絕對的特異性標志物。但臨床研究[24-26]發現，多種高靈敏度標志物的聯合更能體現 HCC 細胞的侵襲性，更有利于預測 HCC 術后的復發和轉移，也為靶向治療提供更多的思路。
3 “干細胞性”標志物的特征
3.1 異質性
腫瘤在演進過程中因獲得性遺傳不穩定性常出現多個不同生物學特征的細胞亞群。上述的闡述也發現，不同 HCC 之間存在不同的“干細胞性”標志物表達，即使在同一多發結節的 HCC 患者中，“干細胞性”標志物的表達也不一致。從目前的研究結果來看，“干細胞性”標志物體現的是 HCC 細胞的一種狀態而并非是一個固定的細胞群體，因為“干細胞性”標志物表達和非表達的 HCC 細胞間是一種動態變化的關系，可互相轉化，這一變化可受干細胞所處微環境的調控[8, 27]。因此，這導致了“干細胞性”標志物的異質性。Lo 等[28]在一項研究中發現，21 例多發性 HCC 患者中有 16（76.2%）例“干細胞性”標志物表達為陽性（表達一種或多種標志物）；而在這 16 例 HCC 中 14 例患者的 Sox9 表達水平均不一致；僅有 6 例患者同時表達相同程度的 EpCAM、Sox9、K19 水平（其中 5 例表達水平均為 0，即表達陰性）。Kumagai 等[29]的研究按 HCC 的直徑大小分成 2 cm、2～5 cm 和 5～8 cm 3 組，免疫組織化學研究發現，K19、CD56 及 EpCAM 表達陽性率隨著腫瘤直徑的增加而升高，結果提示，“干細胞性”標志物的表達是動態變化的。因此，“干細胞性”標志物的表達具有異質性，這也為 HCC 的靶向治療帶來了難度，同時也為精準治療提出了要求。
3.2 非特有
上述常見的標志物并非 HCC 細胞所特有，其他正常的組織細胞如膽管細胞、正常干細胞以及其他惡性腫瘤如膽管細胞癌、乳腺癌等均可表達這些標志物。一項對慢性肝病各個階段的免疫組織化學研究[21]發現，CD44 表達陽性率在丙型肝炎（HCV）患者中為 33.7%、肝硬變患者中為 58.65%、HCC 患者中為 78.53%，CD133 表達陽性率也呈現同樣逐漸上升的趨勢，在 HCV 患者中為 20.5%、肝硬變患者中為 37.75%、HCC 患者中為 76.7%，由此可見，“干細胞性”標志物并非癌細胞所特有。因此，對 HCC-ESM 的鑒別需要同時結合臨床和進行多標志物的聯合鑒別。
3.3 可誘導性
HCC 在介入或射頻治療后，由于腫瘤周圍微環境的改變可能導致“干細胞性”標志物表達譜的改變[28, 30]。HCC 射頻治療后可快速出現復發，且復發腫瘤的表型可發生改變，如分化程度更低、血管侵犯更多等，其惡性潛能的加強很可能是通過不充分熱損失導致的[31]。有研究[32-33]對 HCC 射頻治療后復發再切除和未行射頻治療直接切除標本分析發現，EpCAM 和 CD133 在射頻治療后表達明顯增加，也因此導致了更多的肝外轉移和更低的生存率（5 年生存率分別為 39% 和 68%）。
4 “干細胞性”標志物與 HCC 患者臨床病理特征的關系
與常規 HCC 相比，HCC-ESM 在臨床特征方面具有一定的獨特特征。有研究[13]發現，“干細胞性”標志物的表達更易發生在年輕 HCC 患者中，其 AFP 水平也更高。Durnez 等[34]研究發現，K19 表達陽性 HCC 患者的 AFP>400 μg/L 占 56%，而 K19 表達陰性 HCC 患者的 AFP>400 μg/L 只占 28%。
影像學方面，增強磁共振掃描發現，K19 和 EpCAM 表達陽性的 HCC 在動脈期呈現出強化，在門靜脈期和肝靜脈期仍有持續性強化的特點[35]。
臨床病理方面，HCC-ESM 常無包膜，更易呈浸潤性生長、血管侵犯、腫瘤更大、分化程度更差、纖維基質成分更常見等特征[8, 11, 18-19, 36]。Yamashita 等[13]通過對 60 例 EpCAM+AFP+ HCC 患者和 96 例 EpCAM–AFP– HCC 患者比較發現，EpCAM+AFP+ HCC 的年齡更小 ［（46±10.7）歲比（52.9±10.5）歲］、具有更加晚期的 TNM 分期（Ⅲ 期患者 23.3% 比 8.3%）以及更高的門靜脈癌栓比例（18.3% 比 9.3%）。Govaere 等[10]對 242 例 HCC 標本的研究發現，K19 陽性表達的 HCC 微血管侵犯達到 100%、轉移率達到 83.33%、低分化程度比例占 57.89%，而陰性患者相應的比例只有 52.03%、48.25% 及 18.24%；K19 陽性表達 HCC 的腫瘤平均直徑為 6.8 cm，而陰性表達者只有 4.5 cm，結果提示，K19 陽性表達的 HCC 具有腫瘤大、分化程度低、有血管侵犯、易轉移等惡性程度高的特點；研究同時還發現，HCC-ESM 還與致癌相關基因相關，如“干細胞性”標志物表達增加了上皮-間質轉化蛋白以及 mRNA 表達，減少了癌細胞的凋亡和增加了其增殖活性；K19 陽性表達的 HCC 細胞還高表達與腫瘤侵犯或轉移相關的基因（VASP、TACSTD2、LAMB1、LAMC2 及 PDGFRA）以及與干細胞相關的基因（如 CD133、GSTP1、NOTCH2 及 JAG1）。
總之，從臨床、影像學以及病理學均顯示 HCC-ESM 具有更為惡性的腫瘤生物學行為。
5 “干細胞性”標志物與 HCC 預后的關系
HCC-ESM 的特征不僅體現在臨床病理，最主要的還是其侵襲性特征能夠促進 HCC 復發和轉移。 Durnez 等[34]對 HCC 肝移植術后的研究發現，K19 陽性表達 HCC 患者肝移植后的 5 年復發率高達 50%，而陰性表達者只有 25%。對 HCC 肝切除患者的研究也證實了“干細胞性”標志物對復發的影響，如 Chan 等[15]研究了 282 例 HCC 患者，結果發現，表達 CD133、EpCAM 和 K19 均影響 HCC 切除術后的復發和總體生存；對于 AJCC 分期Ⅰ期患者，CD133 陽性患者 5 年無瘤生存率為 38%，而陰性患者為 67%；進一步的研究結果提示，CD133 陽性主要影響早期 HCC 術后的復發，而 CD90 和 EpCAM 則主要影響中晚期 HCC 患者的腫瘤復發。
標志物的雙表達對 HCC 預后的預測更加準確，如 Dai 等[37]研究聯合 AFP 和 CD133 將根治性切除 HCC 患者分成 4 組，研究發現，CD133+AFP+ HCC 患者的生存率最低，其次是 CD133+AFP– HCC 患者和 CD133–AFP+ HCC 患者，而 CD133–AFP– HCC 患者的預后最好；同樣，K19 與 Hep Par 1[38]、CD44 與 CD133[39]、EpCAM 與 AFP 雙表達模式[13]對預后的預測也有重要的臨床意義。
近年來的一項研究[40]發現，HCC 癌旁組織中 EpCAM 和 CD13 的表達不僅與腫瘤大小、肝硬變及血管侵犯相關，也與根治性切除后復發相關，EpCAM 表達陽性的癌旁組織其無瘤生存率和總生存率更低，而 CD13 的陽性表達主要影響總生存率，這很可能是由于 EpCAM 和 CD13 的陽性表達激活了肝干細胞，進一步促進了匯管區反應和炎癥形成，從而導致了新的腫瘤形成。還有研究[41]發現，HCC 細胞質中的 CD133 表達水平越高，其術后無瘤生存率和總生存率越低，但細胞核中的 CD133 表達水平反而對腫瘤復發轉移具有保護作用，即細胞核中的 CD133 表達水平越高，其術后無瘤生存率和總生存率越高。
目前大量的臨床研究已經證實“干細胞性”標志物與 HCC 術后復發和轉移密切相關，其機制除了上述闡述的各分子標志物自身的機制外，還可能與 HCC-ESM 的循環腫瘤細胞相關。臨床研究[42]已經證實，HCC 患者血液循環中 CK19、CD90 和 CD133 表達陽性率明顯高于慢性肝炎患者和健康對照組，而且其表達陽性率與 HCC 分化程度和分期相關。Zhou 等[43]的研究發現，EpCAMmRNA+循環腫瘤細胞是 HCC 患者根治性術后復發的獨立危險因素。一項對比前入路和常規入路肝切除的對照研究[44]發現，前入路 HCC 患者循環中 EpCAMmRNA+循環腫瘤細胞數量明顯少于常規入路組，且其根治性切除術后 2 年復發率為 27.1%，明顯低于常規入路組的 44.9%，結果提示，常規入路肝切除對肝臟的翻動導致了更多的 EpCAMmRNA+循環腫瘤細胞進入外周血液，也成為 HCC 術后復發的根源。因此，“干細胞性”標志物很可能是通過循環腫瘤細胞促進 HCC 的復發和轉移。
上述研究表明“干細胞性”標志物的表達影響 HCC 的復發和預后，且其作用在雙表達時更明顯。因此，HCC-ESM 很可能是 HCC 復發轉移的根源，根治性切除后外周血中殘留的 HCC-ESM 循環腫瘤細胞能夠播散在全身組織器官并通過 K19、EpCAM及CD133 分子的侵襲能力而形成新腫瘤。
6 HCC-ESM 的臨床應用前景
HCC-ESM 這一亞型的提出對 HCC 病理生理機制有了更深入的認識，同時也為其治療提供了新的思路。
6.1 HCC 分子病理分型
在過去 10 年來，HCC 的病理檢查已經逐漸從純粹的形態學描述進而進展為一個整體的檢測，同時提供重要的功能和臨床相關信息，并尋求理想的形態學和具有預后和靶向治療的病理分子生物學亞型[6]。HCC-ESM 亞型的識別有助于對高危復發 HCC 患者的識別并及時提供新的輔助治療和嚴密檢測，從而提高患者長期生存。
6.2 個體化治療
對 HCC-ESM 或其亞型可針對性開展新的治療方式，如表達 K19 的 HCC 具有化療抵抗和耐藥，但 K19 敲除的 HCC 對索拉非尼、阿霉素及氟尿嘧啶的化療抵抗性減弱[10]。目前的研究[45-46]發現，TACC3、NEK2 等基因能促進 HCC 的干性特征，因此，其基因抑制劑可能能夠減少干性表達和腫瘤侵襲性而成為新的治療靶點，但是靶向性不強仍是亟需解決的關鍵問題，是否可通過雙靶向或多靶向聯合解決靶向性的問題還需進一步研究證實。
7 小結
表達“干細胞性”標志物的 HCC-ESM 是 HCC 的一種特殊亞型，其常見的為 EpCAM、CD133、K19 和 CD44，這幾種標志物通常以幾種共表達形式出現且各具特點。HCC-ESM 侵襲性更強，患者預后更差，是 HCC 術后復發及轉移的關鍵危險因素，“干細胞性”標志物的提出為 HCC 的靶向和個體化治療及預測預后提供了新思路，但“干細胞性”標志物的異質性也增加了其臨床應用的難度，目前仍需大量動物實驗和臨床試驗進一步驗證。
肝細胞癌（HCC）是我國常見的肝臟原發腫瘤，起病隱匿，惡性程度高，臨床上只有 20% 的 HCC 患者能夠獲得根治性切除[1-2]，且其對放化療敏感性差，長期生存率低。因此，如何探索新的治療靶點和提高 HCC 患者生存率一直都是該領域的焦點。現有越來越多的研究發現有一部分 HCC 細胞表面表達了“干細胞性”標志物，這些標志物的表達很可能是 HCC 復發和轉移的根源，并認為是 HCC 的一種特殊亞型。筆者在此對表達“干細胞性”標志物 HCC 的特征及臨床病理表現進行綜述，為探索其新的靶向治療提供方向。
1 表達“干細胞性”標志物 HCC 亞型的定義
近年來，隨著 HCC 干細胞理論的提出，研究者[3-4]對 HCC 發生、發展、復發及轉移機制有了新認識，并為其治療及預后提供了新思路。但是目前的技術手段尚不能從形態學上鑒定腫瘤干細胞，而只能用功能學方法對其自我更新能力和分化潛能兩個主要生物學特征進行評價，也就是通過篩選 HCC 干細胞特性標志物這一技術手段來篩選干細胞[5]。但由于 HCC 在組織病理學、腫瘤形成和生物學行為方面具有異質性[6]，如部分正常肝組織或 HCC 細胞也可表達“干細胞性”標志物，而部分 HCC 干細胞并不表達“干細胞性”相關標志物，這也限制了 HCC 干細胞的鑒別及其在臨床上的應用。
目前研究[2]發現，最能體現 HCC 細胞惡性特征的是一部分表達“干細胞性”標志物的 HCC 細胞，其具有干細胞侵襲性強的特征，也是其復發和轉移的主要來源，研究者將這一類型的 HCC 稱為“干性相關標志物表達的肝細胞癌（hepatocellular carcinoma expressing stemness-related markers，HCC-ESM）”，其具有常規 HCC 一致的組織形態學特征，但至少有 5% 的腫瘤細胞經免疫組織化學檢測出表達肝干細胞相關的標志物，因此，將它定義為一類特殊的 HCC 亞型[1, 6-9]。
關于 HCC-ESM 的形成，推測其可能是來源于肝干細胞的惡性轉化或者是 HCC 在形成過程中干細胞的特征未能完全去分化[6]。但是 HCC-ESM 定義中關于“干細胞性”這一說法仍有爭議，因為這似乎在暗示這些腫瘤細胞具有干細胞功能，即與正常組織的干細胞具有相同的自我更新、無限增殖能力、多能性等功能特性[7]，而實際上其“干細胞性”指的是 HCC 細胞表面表達的一類“干細胞性”分子標志物，這些“干細胞性”特征代表了腫瘤細胞具有更強的侵襲性，這部分細胞大多數仍是成熟的 HCC 細胞，但也含有一部分 HCC 干細胞，而不是專指肝干細胞的腫瘤轉換以及具有干細胞的功能[1]。因此，目前對“干細胞性”特征的定義是根據其功能特征而并不是根據其細胞起源。
HCC-ESM 與常規 HCC 雖然在形態學上并沒有明顯的差異，但其侵襲性更強和預后更差，是 HCC 根治性治療后復發和轉移的關鍵[7]。
2 常見“干細胞性”標志物
肝細胞在分化成熟過程中的不同階段可表達不同的細胞表面標志物，這些標志物需要通過免疫組織化學進行篩選和鑒別。肝干細胞表面常表達 K7、K19、上皮細胞黏附分子（EpCAM）、CD56、甲胎蛋白（AFP）等標志物；同時肝干細胞具有雙向分化成膽管細胞和肝細胞的潛能，在分化成肝細胞后細胞表面不再表達 K7、K19、EpCAM 和 CD56，而表達肝細胞特異性標志物如 Hep Par1 等，但在分化成膽管細胞后細胞表面卻仍表達 K19 和 EpCAM[6]。因此，在鑒別 HCC-ESM 時，首先需要排除膽管細胞癌和肝細胞-膽管細胞混合癌。目前研究[1, 6-7, 10-13]已經鑒別的“干細胞性”標志物多達 10 余種，常見的為 EpCAM、CD133、K19、CD13、CD44 等。
2.1 EpCAM
EpCAM 屬于黏附分子家族，是腫瘤相關鈣信號轉導物 1 基因編碼的單次跨膜糖蛋白，由胞外結構域、單次跨膜結構域和胞內結構域三部分組成。胚胎時期肝細胞 EpCAM 表達陽性，而成熟肝細胞 EpCAM 表達陰性，但是膽管上皮細胞 EpCAM 表達為陽性，其作為上皮細胞間黏附分子在上皮細胞癌變過程中發揮著重要作用，主要通過調節細胞增殖、免疫逃逸等機制促進腫瘤的發生，并與腫瘤的遷移和侵襲性密切相關[14]；EpCAM 通過參與 β-連環蛋白依賴的 Wnt 級聯反應而激活 c-myc 基因、cyclin A/cyclin E 等原癌基因的表達，從而具有致瘤作用；同時 EpCAM 陽性 HCC 細胞內的聚 ADP 核糖聚合酶及由聚 ADP 核糖聚合酶募集的染色質域解螺旋酶 DNA 結合蛋白 4 可迅速修復 DNA 損傷、維持染色體穩定，從而增強腫瘤侵襲性。EpCAM 是 HCC 主要的表達標志物之一，其在 HCC 中表達陽性率為 19.9%～35%，EpCAM 表達陽性的 HCC 患者年齡更小、腫瘤直徑更小及分化程度低[10, 13, 15]。
2.2 CD133
CD133 是人類造血干細胞或祖細胞的 5 次跨膜糖蛋白分子，相對分子質量為 120×103，是最常見的“干細胞性”標志物之一，常在肝、肺、結直腸、前列腺等實體腫瘤細胞表面表達[16]，其在正常肝組織中可能參與肝臟的再生。早期研究[17]發現，CD133 陽性 HCC 細胞因具備自我更新及分化特征而具有強大的增殖及成瘤能力，其成瘤能力與絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）/磷脂酰肌醇 3 激酶（PI3K）信號通路的異常激活相關，而敲除 CD133 基因后則導致腫瘤細胞增殖及成瘤能力下降。文獻[18-19]報道，13.5%～24.8% 的 HCC-ESM 可表達 CD133。還有研究[15, 17]發現，CD133 更易出現在伴有肝硬化的 HCC 中，其陽性表達對早期 HCC 復發預測有一定價值。目前的一項研究[20]發現，血管內皮生長因子通過激活血管內皮生長因子受體-2、增加 CD133 陽性腫瘤細胞的數量和增強其自我更新能力，從而促進了 HCC 術后的復發。
2.3 CD44
CD44 是一個完整的跨膜糖蛋白，是透明質酸的受體，對細胞與基質之間的黏附、淋巴細胞的激活及歸巢、腫瘤的侵襲及轉移起著重要作用，主要參與了細胞間的黏附和遷移，并已發現其在 HCC 中可能與腫瘤細胞的侵襲和轉移相關。文獻[21]報道，在 HCC-ESM 中 CD44 表達陽性率可達到 78.35%。Gao 等[22]的一項研究發現，CD44 陽性細胞主要是通過轉化生長因子（TGF）β1 激活 Akt/GSK-3β/β-catenin 信號通路介導的上皮-間質轉化而促進腫瘤細胞的轉移，敲除 CD44 基因后 HCC 細胞轉移能力則明顯下降。
2.4 CD13
CD13 即氨肽酶 N，屬于 Zn2+結合的金屬蛋白酶超家族，由 967 個氨基酸組成的糖蛋白，在細胞膜上形成同源二聚體；在胞外部有近羧基端的結構域和近膜的結構域，前者結合底物，后者為酶催化區；是一種跨膜的金屬結合蛋白酶，能將氨基酸的氮端切除。有研究[23]發現，CD13 富集與 HCC 早期復發和較差的預后有關，CD13 可通過降解細胞外基質促進腫瘤的轉移，輔助血管生成增加腫瘤的侵襲性，還通過其蛋白水解功能、干擾抗原呈遞及逃避免疫識別，在腫瘤細胞的形成和發展中扮演重要的角色，CD13 是 HCC 的潛在治療靶點。
2.5 K19
K19 是一種膽管型細胞角蛋白，常表達于膽管細胞和肝干細胞，是最常見的 HCC“干細胞性”標志物。有文獻[11]報道，K19 在 HCC 中表達陽性率為 9.6%～25%，常與其他標志物共同表達，K19 表達陽性的 HCC-ESM 常有明顯增加的上皮-間質轉化，顯示了 K19 表達陽性的 HCC 細胞具有更強的侵襲性；同時還發現，K19 陽性表達的 HCC-ESM 具有腫瘤直徑更大、血管侵犯更常見、分化程度更差、腫瘤包膜不完整等特征。K19 能激活 TGFβ/Smad 通路，從而促進腫瘤的轉移。體外實驗[10]也表明，K19 陽性表達的 HCC 細胞更具有侵襲性，尤其是更容易侵犯基底膜，而當敲除 K19 基因后，其侵襲能力可下降 34.7%。
綜上，研究[11, 15]發現，HCC-ESM 中具有上述任何一種標志物的表達陽性率為 18%～59.8%，但大多數 HCC-ESM 具有 2 種或 2 種以上標志物的表達。在一項 282 例HCC標本的研究[15]中發現，2 種標志物表達陽性率占 26.4%，3 種占 11.5%，4 種占 2.3%。K19 是最常見的多表達標志物，一項研究[11]發現，92% 的 K19 陽性表達的 HCC 伴有其他標志物的表達。對于哪種標志物或者哪一類標志物能夠完全代表 HCC 的“干細胞性”目前仍沒有統一的認識。因為 HCC 干細胞的起源尚不清楚，有可能存在 3 種或 3 種以上的來源（如起源于干細胞、成熟的肝實質、骨髓細胞等），因此，有可能不存在絕對的特異性標志物。但臨床研究[24-26]發現，多種高靈敏度標志物的聯合更能體現 HCC 細胞的侵襲性，更有利于預測 HCC 術后的復發和轉移，也為靶向治療提供更多的思路。
3 “干細胞性”標志物的特征
3.1 異質性
腫瘤在演進過程中因獲得性遺傳不穩定性常出現多個不同生物學特征的細胞亞群。上述的闡述也發現，不同 HCC 之間存在不同的“干細胞性”標志物表達，即使在同一多發結節的 HCC 患者中，“干細胞性”標志物的表達也不一致。從目前的研究結果來看，“干細胞性”標志物體現的是 HCC 細胞的一種狀態而并非是一個固定的細胞群體，因為“干細胞性”標志物表達和非表達的 HCC 細胞間是一種動態變化的關系，可互相轉化，這一變化可受干細胞所處微環境的調控[8, 27]。因此，這導致了“干細胞性”標志物的異質性。Lo 等[28]在一項研究中發現，21 例多發性 HCC 患者中有 16（76.2%）例“干細胞性”標志物表達為陽性（表達一種或多種標志物）；而在這 16 例 HCC 中 14 例患者的 Sox9 表達水平均不一致；僅有 6 例患者同時表達相同程度的 EpCAM、Sox9、K19 水平（其中 5 例表達水平均為 0，即表達陰性）。Kumagai 等[29]的研究按 HCC 的直徑大小分成 2 cm、2～5 cm 和 5～8 cm 3 組，免疫組織化學研究發現，K19、CD56 及 EpCAM 表達陽性率隨著腫瘤直徑的增加而升高，結果提示，“干細胞性”標志物的表達是動態變化的。因此，“干細胞性”標志物的表達具有異質性，這也為 HCC 的靶向治療帶來了難度，同時也為精準治療提出了要求。
3.2 非特有
上述常見的標志物并非 HCC 細胞所特有，其他正常的組織細胞如膽管細胞、正常干細胞以及其他惡性腫瘤如膽管細胞癌、乳腺癌等均可表達這些標志物。一項對慢性肝病各個階段的免疫組織化學研究[21]發現，CD44 表達陽性率在丙型肝炎（HCV）患者中為 33.7%、肝硬變患者中為 58.65%、HCC 患者中為 78.53%，CD133 表達陽性率也呈現同樣逐漸上升的趨勢，在 HCV 患者中為 20.5%、肝硬變患者中為 37.75%、HCC 患者中為 76.7%，由此可見，“干細胞性”標志物并非癌細胞所特有。因此，對 HCC-ESM 的鑒別需要同時結合臨床和進行多標志物的聯合鑒別。
3.3 可誘導性
HCC 在介入或射頻治療后，由于腫瘤周圍微環境的改變可能導致“干細胞性”標志物表達譜的改變[28, 30]。HCC 射頻治療后可快速出現復發，且復發腫瘤的表型可發生改變，如分化程度更低、血管侵犯更多等，其惡性潛能的加強很可能是通過不充分熱損失導致的[31]。有研究[32-33]對 HCC 射頻治療后復發再切除和未行射頻治療直接切除標本分析發現，EpCAM 和 CD133 在射頻治療后表達明顯增加，也因此導致了更多的肝外轉移和更低的生存率（5 年生存率分別為 39% 和 68%）。
4 “干細胞性”標志物與 HCC 患者臨床病理特征的關系
與常規 HCC 相比，HCC-ESM 在臨床特征方面具有一定的獨特特征。有研究[13]發現，“干細胞性”標志物的表達更易發生在年輕 HCC 患者中，其 AFP 水平也更高。Durnez 等[34]研究發現，K19 表達陽性 HCC 患者的 AFP>400 μg/L 占 56%，而 K19 表達陰性 HCC 患者的 AFP>400 μg/L 只占 28%。
影像學方面，增強磁共振掃描發現，K19 和 EpCAM 表達陽性的 HCC 在動脈期呈現出強化，在門靜脈期和肝靜脈期仍有持續性強化的特點[35]。
臨床病理方面，HCC-ESM 常無包膜，更易呈浸潤性生長、血管侵犯、腫瘤更大、分化程度更差、纖維基質成分更常見等特征[8, 11, 18-19, 36]。Yamashita 等[13]通過對 60 例 EpCAM+AFP+ HCC 患者和 96 例 EpCAM–AFP– HCC 患者比較發現，EpCAM+AFP+ HCC 的年齡更小 ［（46±10.7）歲比（52.9±10.5）歲］、具有更加晚期的 TNM 分期（Ⅲ 期患者 23.3% 比 8.3%）以及更高的門靜脈癌栓比例（18.3% 比 9.3%）。Govaere 等[10]對 242 例 HCC 標本的研究發現，K19 陽性表達的 HCC 微血管侵犯達到 100%、轉移率達到 83.33%、低分化程度比例占 57.89%，而陰性患者相應的比例只有 52.03%、48.25% 及 18.24%；K19 陽性表達 HCC 的腫瘤平均直徑為 6.8 cm，而陰性表達者只有 4.5 cm，結果提示，K19 陽性表達的 HCC 具有腫瘤大、分化程度低、有血管侵犯、易轉移等惡性程度高的特點；研究同時還發現，HCC-ESM 還與致癌相關基因相關，如“干細胞性”標志物表達增加了上皮-間質轉化蛋白以及 mRNA 表達，減少了癌細胞的凋亡和增加了其增殖活性；K19 陽性表達的 HCC 細胞還高表達與腫瘤侵犯或轉移相關的基因（VASP、TACSTD2、LAMB1、LAMC2 及 PDGFRA）以及與干細胞相關的基因（如 CD133、GSTP1、NOTCH2 及 JAG1）。
總之，從臨床、影像學以及病理學均顯示 HCC-ESM 具有更為惡性的腫瘤生物學行為。
5 “干細胞性”標志物與 HCC 預后的關系
HCC-ESM 的特征不僅體現在臨床病理，最主要的還是其侵襲性特征能夠促進 HCC 復發和轉移。 Durnez 等[34]對 HCC 肝移植術后的研究發現，K19 陽性表達 HCC 患者肝移植后的 5 年復發率高達 50%，而陰性表達者只有 25%。對 HCC 肝切除患者的研究也證實了“干細胞性”標志物對復發的影響，如 Chan 等[15]研究了 282 例 HCC 患者，結果發現，表達 CD133、EpCAM 和 K19 均影響 HCC 切除術后的復發和總體生存；對于 AJCC 分期Ⅰ期患者，CD133 陽性患者 5 年無瘤生存率為 38%，而陰性患者為 67%；進一步的研究結果提示，CD133 陽性主要影響早期 HCC 術后的復發，而 CD90 和 EpCAM 則主要影響中晚期 HCC 患者的腫瘤復發。
標志物的雙表達對 HCC 預后的預測更加準確，如 Dai 等[37]研究聯合 AFP 和 CD133 將根治性切除 HCC 患者分成 4 組，研究發現，CD133+AFP+ HCC 患者的生存率最低，其次是 CD133+AFP– HCC 患者和 CD133–AFP+ HCC 患者，而 CD133–AFP– HCC 患者的預后最好；同樣，K19 與 Hep Par 1[38]、CD44 與 CD133[39]、EpCAM 與 AFP 雙表達模式[13]對預后的預測也有重要的臨床意義。
近年來的一項研究[40]發現，HCC 癌旁組織中 EpCAM 和 CD13 的表達不僅與腫瘤大小、肝硬變及血管侵犯相關，也與根治性切除后復發相關，EpCAM 表達陽性的癌旁組織其無瘤生存率和總生存率更低，而 CD13 的陽性表達主要影響總生存率，這很可能是由于 EpCAM 和 CD13 的陽性表達激活了肝干細胞，進一步促進了匯管區反應和炎癥形成，從而導致了新的腫瘤形成。還有研究[41]發現，HCC 細胞質中的 CD133 表達水平越高，其術后無瘤生存率和總生存率越低，但細胞核中的 CD133 表達水平反而對腫瘤復發轉移具有保護作用，即細胞核中的 CD133 表達水平越高，其術后無瘤生存率和總生存率越高。
目前大量的臨床研究已經證實“干細胞性”標志物與 HCC 術后復發和轉移密切相關，其機制除了上述闡述的各分子標志物自身的機制外，還可能與 HCC-ESM 的循環腫瘤細胞相關。臨床研究[42]已經證實，HCC 患者血液循環中 CK19、CD90 和 CD133 表達陽性率明顯高于慢性肝炎患者和健康對照組，而且其表達陽性率與 HCC 分化程度和分期相關。Zhou 等[43]的研究發現，EpCAMmRNA+循環腫瘤細胞是 HCC 患者根治性術后復發的獨立危險因素。一項對比前入路和常規入路肝切除的對照研究[44]發現，前入路 HCC 患者循環中 EpCAMmRNA+循環腫瘤細胞數量明顯少于常規入路組，且其根治性切除術后 2 年復發率為 27.1%，明顯低于常規入路組的 44.9%，結果提示，常規入路肝切除對肝臟的翻動導致了更多的 EpCAMmRNA+循環腫瘤細胞進入外周血液，也成為 HCC 術后復發的根源。因此，“干細胞性”標志物很可能是通過循環腫瘤細胞促進 HCC 的復發和轉移。
上述研究表明“干細胞性”標志物的表達影響 HCC 的復發和預后，且其作用在雙表達時更明顯。因此，HCC-ESM 很可能是 HCC 復發轉移的根源，根治性切除后外周血中殘留的 HCC-ESM 循環腫瘤細胞能夠播散在全身組織器官并通過 K19、EpCAM及CD133 分子的侵襲能力而形成新腫瘤。
6 HCC-ESM 的臨床應用前景
HCC-ESM 這一亞型的提出對 HCC 病理生理機制有了更深入的認識，同時也為其治療提供了新的思路。
6.1 HCC 分子病理分型
在過去 10 年來，HCC 的病理檢查已經逐漸從純粹的形態學描述進而進展為一個整體的檢測，同時提供重要的功能和臨床相關信息，并尋求理想的形態學和具有預后和靶向治療的病理分子生物學亞型[6]。HCC-ESM 亞型的識別有助于對高危復發 HCC 患者的識別并及時提供新的輔助治療和嚴密檢測，從而提高患者長期生存。
6.2 個體化治療
對 HCC-ESM 或其亞型可針對性開展新的治療方式，如表達 K19 的 HCC 具有化療抵抗和耐藥，但 K19 敲除的 HCC 對索拉非尼、阿霉素及氟尿嘧啶的化療抵抗性減弱[10]。目前的研究[45-46]發現，TACC3、NEK2 等基因能促進 HCC 的干性特征，因此，其基因抑制劑可能能夠減少干性表達和腫瘤侵襲性而成為新的治療靶點，但是靶向性不強仍是亟需解決的關鍵問題，是否可通過雙靶向或多靶向聯合解決靶向性的問題還需進一步研究證實。
7 小結
表達“干細胞性”標志物的 HCC-ESM 是 HCC 的一種特殊亞型，其常見的為 EpCAM、CD133、K19 和 CD44，這幾種標志物通常以幾種共表達形式出現且各具特點。HCC-ESM 侵襲性更強，患者預后更差，是 HCC 術后復發及轉移的關鍵危險因素，“干細胞性”標志物的提出為 HCC 的靶向和個體化治療及預測預后提供了新思路，但“干細胞性”標志物的異質性也增加了其臨床應用的難度，目前仍需大量動物實驗和臨床試驗進一步驗證。