引用本文： 苗春木, 龔建平, 熊彬, 游科, 鄧開. microRNA-196b、microRNA-217 與 TGFβR1 蛋白在胰腺導管腺癌組織中的表達及其意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(9): 1077-1082. doi: 10.7507/1007-9424.201802009 復制
在全世界范圍內，胰腺癌的發病率和病死率逐年上升，被稱為“癌中之王”，是惡性程度最高的消化道腫瘤之一[1-2]。胰腺癌發病隱秘，早期診斷困難，一旦被發現，大部分都是晚期患者[3]。因此，外科手術根治胰腺癌的機會很小。而針對晚期患者，主要進行化療或者其他姑息療法。但是，胰腺癌極易發生治療耐受和轉移[4]。針對目前臨床上治療胰腺癌的困境，只有尋找到新的有效的治療靶點，才能夠有效地抑制胰腺癌的發生和發展。微小 RNA（microRNA，miR）是一種長度為 19～24 個核苷酸的內源性非編碼單鏈小分子 RNA，可以調節轉錄后的基因表達[5-6]。成熟的 miR 通過 5′ 端的 2～8 個堿基序列結合靶 mRNA 的 3′ 端非翻譯區的序列，抑制 mRNA 翻譯和（或）降解[7-8]。新近報道，miR-196b 的高表達與胰腺癌的預后顯著相關[9]。同時，Idichi 等[10]報道，miR-217 通過調控肌動蛋白結合蛋白 Anillin 的表達，從而抑制胰腺癌細胞的侵襲能力。有研究者[11-12]通過 DIANA TOOLS 軟件對 miR-196b 和 miR-217 的下游靶基因進行檢索，發現兩者分別在宮頸癌細胞和肝癌細胞中通過影響轉化生長因子 β 受體 1（transforming growth factor β receptor 1，TGFβR1）的轉錄而發揮調控作用。TGFβR1 蛋白作為轉化生長因子-β（TGF-β）的細胞表面受體，通過募集細胞信號轉導分子 2（signal mothers against decapentaplegic homolog 2，SMAD2）、SMAD3 等，擴大絲裂原活化蛋白激酶激酶/細胞外信號調節激酶（mitogen-activated protein kinase kinase/extracellular signal-regulated kinase，MEK/ERK）信號轉導，調控胰腺癌細胞的凋亡、侵襲等能力[13-14]。但是，胰腺癌組織中 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白間是否存在相互作用關系，尚無定論。因此，筆者收集了于重慶醫科大學附屬第二醫院進行手術切除的 30 例胰腺導管腺癌患者的臨床資料，比較了胰腺導管腺癌組織及其癌旁組織中 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白表達的差異，旨在為胰腺癌患者的靶向治療提供實驗依據。
1 資料與方法
1.1 研究對象
納入標準：首次發現胰腺占位，能夠外科手術切除，并經術后病理學檢查診斷為胰腺導管腺癌，且術前未行放療和化療。排除標準：胰腺占位非首次發現，且術前接受過放療和化療，術后病理排除胰腺導管腺癌。胰腺導管腺癌的診治原則參照“胰腺癌診療指南（2014）”[15]。前瞻性收集 2014 年 3 月到 2017 年 3 月期間在重慶醫科大學附屬第二醫院行胰腺癌根治術的 30 例胰腺導管腺癌患者的組織標本（包括胰腺癌組織及其癌旁組織，癌旁組織距離癌組織以遠 3～5 mm）。本研究通過了筆者所在醫院理論委員會審查并征得患者及家屬知情同意。
1.2 主要試劑和設備
microRNA 快速提取試劑盒（RP5301）、miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（PR6621）和 miRNA 熒光定量檢測試劑盒（PR7021）均購自北京百泰克生物技術公司，兔抗 TGFβR1 抗體（ab155258）購自美國 Abcam 公司，兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（AF1186）、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG（A0208）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（P0012S）、RIPA 裂解液（P0013B）和極超敏 ECL 化學發光試劑盒（P0018F）均購自上海碧云天生物技術有限公司。PCR 儀（CFX96）、垂直電泳裝置（165-8000）、凝膠成像系統（1708195）和 ImageLab 軟件（4.0）均為美國 Bio-Rad 公司產品。
1.3 檢測指標及其檢測方法
1.3.1 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）法檢測基因表達
胰腺導管腺癌組織及其癌旁組織經勻漿后，嚴格參照 microRNA 快速提取試劑盒說明書提取 miR。接著，行 miR cDNA 的第一鏈合成，即 miR 的 3′ 末端進行加 Poly（A）處理， Poly（A）修飾的 miR 再進行逆轉錄反應。然后，進行 miR 熒光定量：20.0 μL 體系包括 10.0 μL 的 2×miR qPCR Premix、0.4 μL 的 Forword Primer（10 μmol/L）、0.4 μL 的 Reverse Primer（10 μmol/L）、2.0 μL 的 miR 第一鏈 cDNA、1.0 μL 的 Rnasin（40 U/μL）及 6.2 μL的 Rnase-Free ddH2O。反應條件如下。① 預變性：94 ℃、2 min，1 個循環；② 變性、退火和延伸：94 ℃、2 s，60 ℃、34 s，共 40 個循環。最后用 2–△△Ct=2–［（癌組織目的基因 Ct–內參 Ct）–（癌旁組織目的基因 Ct–內參Ct）］進行半定量分析。miR-196b 引物的正義鏈序列為：5′-GAAGA- TCTTTCCTTGGCGGCGACA-3′（擴增長度為 77 bp）。miR-217 引物的正義鏈序列為：5′-TCCAATC- AGTTCCTGATGCAGTA-3′（擴增長度為 76 bp）。GAPDH 引物的正義鏈序列為：5′-ACAACTTTG- GTATCGTGGAAGG-3′，反義鏈序列為：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′（擴增長度為 101 bp）。
1.3.2 Western blotting 法檢測蛋白表達
每 100 mg 胰腺導管腺癌組織和癌旁組織用 RIPA 裂解液提取總蛋白后，用 BCA 法測定樣品濃度。接著，每個樣本以 50 μg 質量等體積上樣，進行 10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE，100 V，110 min）；然后，濕轉（250 mA，110 min）至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜中，以 5% 脫脂奶粉溫封閉 1.5 h；加入 TGFβR1 抗體（1∶500）或 GAPDH 抗體（1∶200），4 ℃ 過夜；洗滌后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG 二抗（1∶5 000），室溫孵育 2 h 后，用 ECL 法進行顯影。采用 ImageLab 軟件測定目的條帶和相應 GAPDH 條帶的灰度值，然后進行蛋白半定量分析，目的條帶灰度值與相應組別的 GAPDH 條帶灰度值的比值即為目的蛋白的相對表達量。
1.4 統計學方法
所有數據采用 SPSS 18.0 軟件進行統計分析。計量資料的統計方法采用配對 t 檢驗；計數資料的統計方法采用配對 χ2 檢驗或者 Fisher 確切概率法；相關性分析采用簡單相關分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 患者的一般資料及術后恢復情況
本次研究納入的 30 例原發性胰腺導管腺癌患者中，22 例患者的癌灶位置為胰頭部，臨床上接受胰十二指腸切除術+胰腺周圍淋巴結清掃術；8 例患者的癌灶位置為胰尾部，其中 3 例行胰體尾部切除術+胰腺周圍淋巴結清掃術，另 5 例行胰體尾部及脾切除術+胰腺周圍淋巴結清掃術。女 14 例，男 16 例；年齡 43～77 歲、（62±12）歲，其中大于 60 歲者 18 例；15 例患者的最終病理學診斷為高分化胰腺導管腺癌，15 例為中低分化胰腺導管腺癌；腫瘤直徑 1.5～4.3 cm、（3.5±1.4）cm，其中 17 例患者的腫瘤直徑大于 2 cm，13 例小于或等于 2 cm；9 例患者出現淋巴結轉移，6 例患者侵犯周圍神經；17 例患者綜合診斷為 T1+T2 期，13 例患者診斷為 T3+T4 期。本研究納入患者均無手術相關死亡病例，但是有 7 例患者出現嚴重并發癥：胰瘺導致腹腔感染 2 例，不明原因腹腔感染 1 例，胃潴留 2 例，膽汁漏 1 例，胃腸吻合口漏 1 例，保守治療后均好轉出院。
2.2 胰腺導管腺癌及其癌旁組織中 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白的表達
qPCR 檢測結果顯示，胰腺導管腺癌組織中 miR-196b 的相對表達水平高于癌旁組織（t=5.46，P<0.001），而 miR-217 的相對表達水平低于癌旁組織（t=－3.57，P=0.001），見圖 1a、1b。Western blotting 檢測結果顯示，胰腺導管腺癌組織中 TGFβR1 蛋白的相對表達水平高于癌旁組織（t=16.69，P<0.001），見圖 1c、1d。該結果提示，胰腺導管腺癌組織和癌旁組織中 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白的表達水平不同，它們可能參與胰腺導管腺癌的發生和發展過程。
圖1
示 qPCR 和 Western blotting 法檢測的胰腺導管腺癌組織和癌旁組織中 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白的表達結果
a：miR-196b 表達水平；b：miR-217 表達水平 c：3 例胰腺導管腺癌組織及其癌旁組織中 TGFβR1 蛋白表達的電泳圖，癌旁組織中 TGFβR1 蛋白的表達較胰腺導管腺癌組織下調；d：胰腺導管腺癌組織及其癌旁組織中 TGFβR1 蛋白的表達水平
2.3 胰腺導管腺癌中 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白表達的相關性分析
胰腺導管腺癌組織中 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白的表達水平的中位數分別為 3.47、0.56 和 2.47，根據中位數將三者的表達水平分為高表達（大于等于中位數）和低表達（小于中位數）。然后，分析胰腺導管腺癌組織中 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白的表達與患者臨床病理學特征的關系，結果表明：① miR-196b 的高表達與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、分化程度及神經浸潤均無關（P>0.05），而與淋巴結轉移、臨床 T 分期、miR-217 表達和 TGFβR1 蛋白的表達均相關（P<0.05）。有淋巴結轉移、T3+T4 期、miR-217 低表達及 TGFβR1 蛋白高表達患者的 miR-196b 高表達率較高。見表 1。② miR-217 的高表達與性別、年齡、腫瘤部位及神經浸潤均無關（P>0.05），而與腫瘤直徑、分化程度、淋巴結轉移、臨床 T 分期、miR-196b 表達及 TGFβR1 蛋白表達均相關（P<0.05）。腫瘤直徑≤2 cm、分化程度高、有淋巴結轉移、T1+T2 期、miR-19b6 低表達及 TGFβR1 蛋白低表達患者的 miR-217 高表達率較高。見表 2。③ TGFβR1 蛋白的高表達與性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、分化程度、神經浸潤及臨床 T 分期均無關（P>0.05），而與淋巴結轉移、miR-217 表達及 miR-196b 表達均相關（P<0.05）。有淋巴結轉移、miR-217 低表達及 miR-196b 高表達患者的 TGFβR1 蛋白的高表達率高。見表 3。
再以 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白的表達水平進行相關性分析，結果顯示：胰腺導管腺癌組織中 miR-196b 的表達水平與 TGFβR1 蛋白的表達水平間呈正相關關系 ［r=0.803，95%CI 為（0.494，0.932），t=49.17，P<0.001］；miR-217 的表達水平與 TGFβR1 蛋白的表達水平間呈負相關關系［r=–0.839，95% CI 為（–0.943，–0.573），t=64.18，P<0.001］。見圖 2。
以上結果提示：miR-217 可能是胰腺導管腺癌的一種抑癌因素，miR-196b 和 TGFβR1 蛋白可能是胰腺導管腺癌的促癌因素；TGFβR1 蛋白在胰腺導管腺癌中的表達有可能同時受到 miR-217 的負向調控以及 miR-196b 的正向調控。
表1
胰腺導管腺癌組織中 miR-196b 的高表達與患者一般臨床特征的相關性分析（例）
表2
胰腺導管腺癌組織中 miR-217 的高表達與患者一般臨床特征的相關性分析（例）
表3
胰腺導管腺癌組織中 TGFβR1 蛋白的高表達與患者一般臨床特征的相關性分析（例）
圖2
示胰腺導管腺癌組織中 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白表達關系的散點圖
a：miR-196b 的表達水平與 TGFβR1 蛋白的表達水平間呈正相關關系；b：miR-217 的表達水平與 TGFβR1 蛋白的表達水平間呈負相關關系
3 討論
本研究通過 qPCR 法和 Western blotting 法分別檢測了胰腺導管腺癌組織和癌旁組織中 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白的表達水平，發現 miR-196b 和 miR-217 可能是 TGFβR1 蛋白重要的調節因子，參與胰腺導管腺癌的發生和發展。
miR 作為內源性的小 RNA 片段，通過構建復雜而精細的調控網絡，從而參與調控多種疾病的病理過程[16]。近年來，文獻[17-19]報道，多種 miR（如 miR-21、miR-34a、miR-1247 等）可促進或者抑制胰腺癌細胞的增殖、凋亡、轉移、耐藥、復發等過程。miR-196b 被報道與胰腺導管腺癌的手術后生存率和復發高度相關，而 miR-217 則能在體外抑制胰腺癌細胞的侵襲能力[9-10]。本研究結果表明，miR-196b 在胰腺導管腺癌組織中的表達水平高于癌旁組織，高表達的 miR-196b 還與胰腺導管腺癌的 T 分期和周圍淋巴轉移有關；同時 miR-217 在癌旁組織中的表達水平則明顯高于胰腺導管腺癌組織，同時低表達的 miR-217 與胰腺導管腺癌的腫瘤直徑、分化程度、周圍淋巴結轉移和 T 分期相關。這提示，miR-196b 在胰腺導管腺癌的發生過程是一種促癌因素，而 miR-217 則是抑癌因素。但是，兩者參與調控胰腺導管腺癌發生發展的機制尚需進一步研究。
通過數據庫軟件預測，miR-196b 和 miR-217 下游共同的靶分子是 TGFβR1 蛋白[11-12]。TGFβR1 蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，是 TGF-β 直接作用的表面分子之一，可通過 TGF-β 信號通路中的細胞內信號轉導蛋白 SMAD 傳遞細胞信號[20]。Zhao 等[21]報道，14-3-3ζ/TGFβR1 與肺鱗狀細胞癌的惡性轉移密切相關。Hu 等[22]報道，血小板中 TGFβR1 蛋白可促進小鼠原位卵巢癌的生長；沉默 TGFβR1 基因表達后，可降低卵巢癌細胞早期在裸鼠皮下的移植瘤生長。Craven 等[23]報道，TGF-β 通過作用于 TGFβR1 蛋白促進胰腺導管腺癌的周圍血管新生。Principe 等[24]報道，TGF-β 通過作用于胰腺癌細胞表面的 TGFβR1 蛋白，并通過控制 MEK/ERK 通路的激活程度，調控胰腺癌向惡性分化。本研究結果表明，TGFβR1 蛋白在胰腺導管腺癌組織中的表達水平高于癌旁組織，且高表達的 TGFβR1 蛋白與胰腺導管腺癌的周圍神經浸潤密切相關。綜合這些實驗結果以及上述文獻報道，可推測，TGFβR1 蛋白在胰腺導管腺癌發生發展過程中起著關鍵的調節作用。Xu 等[25]報道，內源性的 miR-490-3p 可通過靶向抑制 TGFβR1 蛋白的表達，從而抑制結腸癌的轉移。但是在胰腺導管腺癌中 miR 是如何通過 TGFβR1 蛋白調控胰腺導管腺癌發生發展的機制尚未見報道。此外，本研究結果還表明，胰腺導管腺癌組織中 miR-196b 的表達水平與 TGFβR1 蛋白的表達水平呈正相關關系，而 miR-217 的表達水平與 TGFβR1 蛋白的表達水平呈負相關關系。這說明胰腺導管腺癌中 TGFβR1 蛋白的表達有可能同時受到來自 miR-196b 和 miR-217 的雙向調控，miR-196b 和 miR-217 兩者在胰腺組織的表達平衡有可能是制約胰腺癌發生和發展的重要機制。但是，要明確三者之間的關系，仍需細胞及動物實驗進行進一步驗證。本實驗所發現的胰腺導管腺癌組織中 miR-196b 和 miR-217 的表達均與 TGFβR1 蛋白的表達存在相關性，可為進一步明確三者在胰腺導管腺癌發生發展中的作用提供實驗依據。
綜上所述，miR-196b 和 miR-217 的表達平衡有可能參與調控胰腺組織中 TGFβR1 蛋白的表達，胰腺導管腺癌中 TGFβR1 蛋白的表達有可能同時受到來自 miR-196b 和 miR-217 的雙向調控，這種雙向調控機制可能是制約胰腺導管腺癌發生發展的重要機制之一，也可能是治療胰腺癌的潛在靶點。
在全世界范圍內，胰腺癌的發病率和病死率逐年上升，被稱為“癌中之王”，是惡性程度最高的消化道腫瘤之一[1-2]。胰腺癌發病隱秘，早期診斷困難，一旦被發現，大部分都是晚期患者[3]。因此，外科手術根治胰腺癌的機會很小。而針對晚期患者，主要進行化療或者其他姑息療法。但是，胰腺癌極易發生治療耐受和轉移[4]。針對目前臨床上治療胰腺癌的困境，只有尋找到新的有效的治療靶點，才能夠有效地抑制胰腺癌的發生和發展。微小 RNA（microRNA，miR）是一種長度為 19～24 個核苷酸的內源性非編碼單鏈小分子 RNA，可以調節轉錄后的基因表達[5-6]。成熟的 miR 通過 5′ 端的 2～8 個堿基序列結合靶 mRNA 的 3′ 端非翻譯區的序列，抑制 mRNA 翻譯和（或）降解[7-8]。新近報道，miR-196b 的高表達與胰腺癌的預后顯著相關[9]。同時，Idichi 等[10]報道，miR-217 通過調控肌動蛋白結合蛋白 Anillin 的表達，從而抑制胰腺癌細胞的侵襲能力。有研究者[11-12]通過 DIANA TOOLS 軟件對 miR-196b 和 miR-217 的下游靶基因進行檢索，發現兩者分別在宮頸癌細胞和肝癌細胞中通過影響轉化生長因子 β 受體 1（transforming growth factor β receptor 1，TGFβR1）的轉錄而發揮調控作用。TGFβR1 蛋白作為轉化生長因子-β（TGF-β）的細胞表面受體，通過募集細胞信號轉導分子 2（signal mothers against decapentaplegic homolog 2，SMAD2）、SMAD3 等，擴大絲裂原活化蛋白激酶激酶/細胞外信號調節激酶（mitogen-activated protein kinase kinase/extracellular signal-regulated kinase，MEK/ERK）信號轉導，調控胰腺癌細胞的凋亡、侵襲等能力[13-14]。但是，胰腺癌組織中 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白間是否存在相互作用關系，尚無定論。因此，筆者收集了于重慶醫科大學附屬第二醫院進行手術切除的 30 例胰腺導管腺癌患者的臨床資料，比較了胰腺導管腺癌組織及其癌旁組織中 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白表達的差異，旨在為胰腺癌患者的靶向治療提供實驗依據。
1 資料與方法
1.1 研究對象
納入標準：首次發現胰腺占位，能夠外科手術切除，并經術后病理學檢查診斷為胰腺導管腺癌，且術前未行放療和化療。排除標準：胰腺占位非首次發現，且術前接受過放療和化療，術后病理排除胰腺導管腺癌。胰腺導管腺癌的診治原則參照“胰腺癌診療指南（2014）”[15]。前瞻性收集 2014 年 3 月到 2017 年 3 月期間在重慶醫科大學附屬第二醫院行胰腺癌根治術的 30 例胰腺導管腺癌患者的組織標本（包括胰腺癌組織及其癌旁組織，癌旁組織距離癌組織以遠 3～5 mm）。本研究通過了筆者所在醫院理論委員會審查并征得患者及家屬知情同意。
1.2 主要試劑和設備
microRNA 快速提取試劑盒（RP5301）、miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（PR6621）和 miRNA 熒光定量檢測試劑盒（PR7021）均購自北京百泰克生物技術公司，兔抗 TGFβR1 抗體（ab155258）購自美國 Abcam 公司，兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（AF1186）、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG（A0208）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（P0012S）、RIPA 裂解液（P0013B）和極超敏 ECL 化學發光試劑盒（P0018F）均購自上海碧云天生物技術有限公司。PCR 儀（CFX96）、垂直電泳裝置（165-8000）、凝膠成像系統（1708195）和 ImageLab 軟件（4.0）均為美國 Bio-Rad 公司產品。
1.3 檢測指標及其檢測方法
1.3.1 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）法檢測基因表達
胰腺導管腺癌組織及其癌旁組織經勻漿后，嚴格參照 microRNA 快速提取試劑盒說明書提取 miR。接著，行 miR cDNA 的第一鏈合成，即 miR 的 3′ 末端進行加 Poly（A）處理， Poly（A）修飾的 miR 再進行逆轉錄反應。然后，進行 miR 熒光定量：20.0 μL 體系包括 10.0 μL 的 2×miR qPCR Premix、0.4 μL 的 Forword Primer（10 μmol/L）、0.4 μL 的 Reverse Primer（10 μmol/L）、2.0 μL 的 miR 第一鏈 cDNA、1.0 μL 的 Rnasin（40 U/μL）及 6.2 μL的 Rnase-Free ddH2O。反應條件如下。① 預變性：94 ℃、2 min，1 個循環；② 變性、退火和延伸：94 ℃、2 s，60 ℃、34 s，共 40 個循環。最后用 2–△△Ct=2–［（癌組織目的基因 Ct–內參 Ct）–（癌旁組織目的基因 Ct–內參Ct）］進行半定量分析。miR-196b 引物的正義鏈序列為：5′-GAAGA- TCTTTCCTTGGCGGCGACA-3′（擴增長度為 77 bp）。miR-217 引物的正義鏈序列為：5′-TCCAATC- AGTTCCTGATGCAGTA-3′（擴增長度為 76 bp）。GAPDH 引物的正義鏈序列為：5′-ACAACTTTG- GTATCGTGGAAGG-3′，反義鏈序列為：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′（擴增長度為 101 bp）。
1.3.2 Western blotting 法檢測蛋白表達
每 100 mg 胰腺導管腺癌組織和癌旁組織用 RIPA 裂解液提取總蛋白后，用 BCA 法測定樣品濃度。接著，每個樣本以 50 μg 質量等體積上樣，進行 10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE，100 V，110 min）；然后，濕轉（250 mA，110 min）至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜中，以 5% 脫脂奶粉溫封閉 1.5 h；加入 TGFβR1 抗體（1∶500）或 GAPDH 抗體（1∶200），4 ℃ 過夜；洗滌后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG 二抗（1∶5 000），室溫孵育 2 h 后，用 ECL 法進行顯影。采用 ImageLab 軟件測定目的條帶和相應 GAPDH 條帶的灰度值，然后進行蛋白半定量分析，目的條帶灰度值與相應組別的 GAPDH 條帶灰度值的比值即為目的蛋白的相對表達量。
1.4 統計學方法
所有數據采用 SPSS 18.0 軟件進行統計分析。計量資料的統計方法采用配對 t 檢驗；計數資料的統計方法采用配對 χ2 檢驗或者 Fisher 確切概率法；相關性分析采用簡單相關分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 患者的一般資料及術后恢復情況
本次研究納入的 30 例原發性胰腺導管腺癌患者中，22 例患者的癌灶位置為胰頭部，臨床上接受胰十二指腸切除術+胰腺周圍淋巴結清掃術；8 例患者的癌灶位置為胰尾部，其中 3 例行胰體尾部切除術+胰腺周圍淋巴結清掃術，另 5 例行胰體尾部及脾切除術+胰腺周圍淋巴結清掃術。女 14 例，男 16 例；年齡 43～77 歲、（62±12）歲，其中大于 60 歲者 18 例；15 例患者的最終病理學診斷為高分化胰腺導管腺癌，15 例為中低分化胰腺導管腺癌；腫瘤直徑 1.5～4.3 cm、（3.5±1.4）cm，其中 17 例患者的腫瘤直徑大于 2 cm，13 例小于或等于 2 cm；9 例患者出現淋巴結轉移，6 例患者侵犯周圍神經；17 例患者綜合診斷為 T1+T2 期，13 例患者診斷為 T3+T4 期。本研究納入患者均無手術相關死亡病例，但是有 7 例患者出現嚴重并發癥：胰瘺導致腹腔感染 2 例，不明原因腹腔感染 1 例，胃潴留 2 例，膽汁漏 1 例，胃腸吻合口漏 1 例，保守治療后均好轉出院。
2.2 胰腺導管腺癌及其癌旁組織中 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白的表達
qPCR 檢測結果顯示，胰腺導管腺癌組織中 miR-196b 的相對表達水平高于癌旁組織（t=5.46，P<0.001），而 miR-217 的相對表達水平低于癌旁組織（t=－3.57，P=0.001），見圖 1a、1b。Western blotting 檢測結果顯示，胰腺導管腺癌組織中 TGFβR1 蛋白的相對表達水平高于癌旁組織（t=16.69，P<0.001），見圖 1c、1d。該結果提示，胰腺導管腺癌組織和癌旁組織中 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白的表達水平不同，它們可能參與胰腺導管腺癌的發生和發展過程。
圖1
示 qPCR 和 Western blotting 法檢測的胰腺導管腺癌組織和癌旁組織中 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白的表達結果
a：miR-196b 表達水平；b：miR-217 表達水平 c：3 例胰腺導管腺癌組織及其癌旁組織中 TGFβR1 蛋白表達的電泳圖，癌旁組織中 TGFβR1 蛋白的表達較胰腺導管腺癌組織下調；d：胰腺導管腺癌組織及其癌旁組織中 TGFβR1 蛋白的表達水平
2.3 胰腺導管腺癌中 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白表達的相關性分析
胰腺導管腺癌組織中 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白的表達水平的中位數分別為 3.47、0.56 和 2.47，根據中位數將三者的表達水平分為高表達（大于等于中位數）和低表達（小于中位數）。然后，分析胰腺導管腺癌組織中 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白的表達與患者臨床病理學特征的關系，結果表明：① miR-196b 的高表達與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、分化程度及神經浸潤均無關（P>0.05），而與淋巴結轉移、臨床 T 分期、miR-217 表達和 TGFβR1 蛋白的表達均相關（P<0.05）。有淋巴結轉移、T3+T4 期、miR-217 低表達及 TGFβR1 蛋白高表達患者的 miR-196b 高表達率較高。見表 1。② miR-217 的高表達與性別、年齡、腫瘤部位及神經浸潤均無關（P>0.05），而與腫瘤直徑、分化程度、淋巴結轉移、臨床 T 分期、miR-196b 表達及 TGFβR1 蛋白表達均相關（P<0.05）。腫瘤直徑≤2 cm、分化程度高、有淋巴結轉移、T1+T2 期、miR-19b6 低表達及 TGFβR1 蛋白低表達患者的 miR-217 高表達率較高。見表 2。③ TGFβR1 蛋白的高表達與性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、分化程度、神經浸潤及臨床 T 分期均無關（P>0.05），而與淋巴結轉移、miR-217 表達及 miR-196b 表達均相關（P<0.05）。有淋巴結轉移、miR-217 低表達及 miR-196b 高表達患者的 TGFβR1 蛋白的高表達率高。見表 3。
再以 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白的表達水平進行相關性分析，結果顯示：胰腺導管腺癌組織中 miR-196b 的表達水平與 TGFβR1 蛋白的表達水平間呈正相關關系 ［r=0.803，95%CI 為（0.494，0.932），t=49.17，P<0.001］；miR-217 的表達水平與 TGFβR1 蛋白的表達水平間呈負相關關系［r=–0.839，95% CI 為（–0.943，–0.573），t=64.18，P<0.001］。見圖 2。
以上結果提示：miR-217 可能是胰腺導管腺癌的一種抑癌因素，miR-196b 和 TGFβR1 蛋白可能是胰腺導管腺癌的促癌因素；TGFβR1 蛋白在胰腺導管腺癌中的表達有可能同時受到 miR-217 的負向調控以及 miR-196b 的正向調控。
表1
胰腺導管腺癌組織中 miR-196b 的高表達與患者一般臨床特征的相關性分析（例）
表2
胰腺導管腺癌組織中 miR-217 的高表達與患者一般臨床特征的相關性分析（例）
表3
胰腺導管腺癌組織中 TGFβR1 蛋白的高表達與患者一般臨床特征的相關性分析（例）
圖2
示胰腺導管腺癌組織中 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白表達關系的散點圖
a：miR-196b 的表達水平與 TGFβR1 蛋白的表達水平間呈正相關關系；b：miR-217 的表達水平與 TGFβR1 蛋白的表達水平間呈負相關關系
3 討論
本研究通過 qPCR 法和 Western blotting 法分別檢測了胰腺導管腺癌組織和癌旁組織中 miR-196b、miR-217 和 TGFβR1 蛋白的表達水平，發現 miR-196b 和 miR-217 可能是 TGFβR1 蛋白重要的調節因子，參與胰腺導管腺癌的發生和發展。
miR 作為內源性的小 RNA 片段，通過構建復雜而精細的調控網絡，從而參與調控多種疾病的病理過程[16]。近年來，文獻[17-19]報道，多種 miR（如 miR-21、miR-34a、miR-1247 等）可促進或者抑制胰腺癌細胞的增殖、凋亡、轉移、耐藥、復發等過程。miR-196b 被報道與胰腺導管腺癌的手術后生存率和復發高度相關，而 miR-217 則能在體外抑制胰腺癌細胞的侵襲能力[9-10]。本研究結果表明，miR-196b 在胰腺導管腺癌組織中的表達水平高于癌旁組織，高表達的 miR-196b 還與胰腺導管腺癌的 T 分期和周圍淋巴轉移有關；同時 miR-217 在癌旁組織中的表達水平則明顯高于胰腺導管腺癌組織，同時低表達的 miR-217 與胰腺導管腺癌的腫瘤直徑、分化程度、周圍淋巴結轉移和 T 分期相關。這提示，miR-196b 在胰腺導管腺癌的發生過程是一種促癌因素，而 miR-217 則是抑癌因素。但是，兩者參與調控胰腺導管腺癌發生發展的機制尚需進一步研究。
通過數據庫軟件預測，miR-196b 和 miR-217 下游共同的靶分子是 TGFβR1 蛋白[11-12]。TGFβR1 蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，是 TGF-β 直接作用的表面分子之一，可通過 TGF-β 信號通路中的細胞內信號轉導蛋白 SMAD 傳遞細胞信號[20]。Zhao 等[21]報道，14-3-3ζ/TGFβR1 與肺鱗狀細胞癌的惡性轉移密切相關。Hu 等[22]報道，血小板中 TGFβR1 蛋白可促進小鼠原位卵巢癌的生長；沉默 TGFβR1 基因表達后，可降低卵巢癌細胞早期在裸鼠皮下的移植瘤生長。Craven 等[23]報道，TGF-β 通過作用于 TGFβR1 蛋白促進胰腺導管腺癌的周圍血管新生。Principe 等[24]報道，TGF-β 通過作用于胰腺癌細胞表面的 TGFβR1 蛋白，并通過控制 MEK/ERK 通路的激活程度，調控胰腺癌向惡性分化。本研究結果表明，TGFβR1 蛋白在胰腺導管腺癌組織中的表達水平高于癌旁組織，且高表達的 TGFβR1 蛋白與胰腺導管腺癌的周圍神經浸潤密切相關。綜合這些實驗結果以及上述文獻報道，可推測，TGFβR1 蛋白在胰腺導管腺癌發生發展過程中起著關鍵的調節作用。Xu 等[25]報道，內源性的 miR-490-3p 可通過靶向抑制 TGFβR1 蛋白的表達，從而抑制結腸癌的轉移。但是在胰腺導管腺癌中 miR 是如何通過 TGFβR1 蛋白調控胰腺導管腺癌發生發展的機制尚未見報道。此外，本研究結果還表明，胰腺導管腺癌組織中 miR-196b 的表達水平與 TGFβR1 蛋白的表達水平呈正相關關系，而 miR-217 的表達水平與 TGFβR1 蛋白的表達水平呈負相關關系。這說明胰腺導管腺癌中 TGFβR1 蛋白的表達有可能同時受到來自 miR-196b 和 miR-217 的雙向調控，miR-196b 和 miR-217 兩者在胰腺組織的表達平衡有可能是制約胰腺癌發生和發展的重要機制。但是，要明確三者之間的關系，仍需細胞及動物實驗進行進一步驗證。本實驗所發現的胰腺導管腺癌組織中 miR-196b 和 miR-217 的表達均與 TGFβR1 蛋白的表達存在相關性，可為進一步明確三者在胰腺導管腺癌發生發展中的作用提供實驗依據。
綜上所述，miR-196b 和 miR-217 的表達平衡有可能參與調控胰腺組織中 TGFβR1 蛋白的表達，胰腺導管腺癌中 TGFβR1 蛋白的表達有可能同時受到來自 miR-196b 和 miR-217 的雙向調控，這種雙向調控機制可能是制約胰腺導管腺癌發生發展的重要機制之一，也可能是治療胰腺癌的潛在靶點。
