引用本文： 江晶晶, 王建華, 丁文波, 徐書杭, 武心萍, 李明宏. FNAC 聯合 BRAFV600E 基因檢測對甲狀腺癌頸部淋巴結轉移的診斷價值 . 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(9): 1083-1086. doi: 10.7507/1007-9424.201801056 復制
甲狀腺癌的發病率逐年上升，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid cancer，PTC）是最常見的類型，占甲狀腺惡性腫瘤的 90% 左右，且易發生頸部淋巴結轉移，頸部淋巴結轉移率為 30%～80%[1-2]。術前判斷是否有淋巴結轉移對手術方式的選擇有重要意義。目前，對頸部是否有轉移淋巴結的判斷主要依賴超聲及 CT 檢查，但定性診斷仍需細針穿刺細胞學（fine needle aspiration cytology，FNAC）明確。然而，FNAC 受取材量、穿刺醫師、病理診斷醫師經驗等的限制，常伴有 20%～25% 的不確定性[3-5]。2015 版 美國甲狀腺協會（American Thyroid Association，ATA）指南[5] 提出，可以通過增加細針穿刺洗脫液中的甲狀腺球蛋白（thyroglobulin，TG）含量測定來對可疑淋巴結進行定性，然而因為受穿刺血液中 TG 的影響，限制了其診斷價值[6]。在另一方面，BRAFV600E 突變有著重要的臨床意義，是 PTC 患者最常出現的基因突變，其診斷敏感性可達 81.5%[7]。循證醫學研究[8-10] 表明，BRAFV600E 基因突變與 PTC 淋巴結轉移呈明顯正相關，BRAFV600E 基因突變可顯著提高 PTC 患者淋巴結轉移的發生概率。那是否可以通過檢測可疑轉移淋巴結中的 BRAFV600E 基因突變情況，直接以此判斷淋巴結是否為轉移灶呢？目前，直接通過對可疑淋巴結進行穿刺細胞學檢查并進行 BRAFV600E 基因檢測來判斷淋巴結是否為轉移灶的報道很少，本研究旨在探討超聲引導下頸部淋巴結 FNAC 聯合 BRAFV600E 基因檢測對甲狀腺癌頸部淋巴結轉移的診斷價值。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
病例納入標準：術前超聲檢查提示甲狀腺癌可疑淋巴結轉移灶；術前已行可疑淋巴結 FNAC 檢查及 BRAFV600E 基因檢測；行甲狀腺癌根治性手術治療。排除標準：檢查后未行手術治療；行核素治療者；死亡或者失訪患者。回顧性收集 2016 年 1 月至 2017 年 6 月期間于江蘇省中西醫結合醫院行頸部超聲檢查疑似甲狀腺癌頸部淋巴結轉移的 230 例患者。該 230 例患者經超聲檢查提示淋巴結回聲異常、可疑陽性淋巴結 ［本研究可疑淋巴結的判斷標準為超聲出現以下任何一項特點：高回聲、囊性改變、鈣化、異常血供、回聲異常、淋巴結呈圓形（縱橫比<1.5）、淋巴門回聲消失以及淋巴結直徑超過 8 mm］，為進一步明確診斷，行頸部可疑病變淋巴結 FNAC 檢查及 BRAFV600E 基因檢測。其中 124 例為甲狀腺癌術后，隨訪期間超聲檢查示可疑淋巴結轉移灶；106 例為超聲檢查高度懷疑甲狀腺癌伴頸部淋巴結轉移。檢查后，23 例失訪，20 例行131I 治療，46 例未予治療、定期復查，1 例死亡，余 140 例行甲狀腺切除和（或）頸部淋巴結清掃術，納入本研究分析。140 例患者均接受了甲狀腺癌根治術，其中男 56 例，女 84 例；年齡 19～72 歲、（49±16）歲。
1.2 方法
1.2.1 超聲引導下的 FNAC 檢測
患者取平臥位，將枕頭墊于肩和頸下，充分暴露頸前區。常規消毒，采用 7 號針頭及 10 mL 注射器，超聲實時引導下進針，直至顯示針尖到達病灶區，持續負壓，在不同方向抽吸標本，拔除針頭前消除負壓。將吸出物噴打在載玻片上制成細胞涂片，行 HE 染色后由 2 位細胞病理學醫生閱片，結果不一致時請上級主任醫師審核復片。
1.2.2 BRAFV600E 基因檢測
DNA 基因突變的檢測方法為：取新鮮穿刺細胞，提取 DNA 樣本，按人類 BRAF 基因 V600E 突變檢測試劑盒（廈門艾德生物公司，熒光 PCR 法）操作說明，將洗脫液及盒內各試劑加入 PCR 反應管內，將 PCR 反應管放入實時 PCR 儀器。按試劑盒說明書收集信號進行分析，判斷樣本基因是否是突變陽性。
1.3 陰性和陽性的判斷標準
FNAC 結果陽性定義為，見異型細胞或符合轉移癌/乳頭狀癌細胞表現（穿刺細胞豐富、涂片細胞大小不一、異型性明顯及核漿比例失常），炎性病變則視為陰性結果（穿刺成分少、涂片背景復雜；細胞大小不一、以小淋巴細胞為主、散在一些大細胞，小細胞為分化成熟的淋巴細胞），結核性病變及惡性淋巴瘤則排除。BRAFV600E 陽性定義為 BRAFV600E 基因見突變，未見突變定義為陰性。FNAC 聯合 BRAFV600E 陽性的定義為，FNAC 及 BRAFV600E 中的 2 項或者任意一項為陽性，陰性則定義為 2 項均為陰性。以術后病理學檢查為“金標準”，分析超聲引導下頸部淋巴結 FNAC 以及 BRAFV600E 單獨和聯合診斷甲狀腺癌淋巴結轉移的靈敏度、特異度、準確率、陽性預測值以及陰性預測值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 18.0 軟件進行統計學分析。計算每種方法的診斷效能指標，包括靈敏度、特異度、準確率、陽性預測值及陰性預測值，并計算每種方法的受試者工作特性（receiver operating characte- ristic，ROC）曲線下面積。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
140 例患者中，88 例為首次發現病變，超聲檢查考慮甲狀腺癌合并頸部淋巴結轉移，行甲狀腺切除術加頸淋巴結清掃術。術后病理學檢查提示 87 例為 PTC，1 例為髓樣癌；80 例伴有淋巴結轉移，8 例未見轉移。52 例為 PTC 術后患者，行頸部淋巴結清掃術（有殘葉者行補充切除），術后病理學檢查證實 52 例患者均存在頸部淋巴結轉移。FNAC、BRAFV600E 基因檢測及兩者聯合對甲狀腺癌頸部淋巴結轉移的診斷結果見表 1–表 3。
2.1 FNAC 檢查對淋巴結轉移的診斷價值
FNAC 檢查對淋巴結轉移的診斷結果和診斷價值分別見表 1、表 4和表5。由表 4 可見，FNAC 檢查診斷淋巴結轉移的靈敏度和準確率較低，特異度及陽性預測值較高（達 100%）。
表1
淋巴結 FNAC 檢查與術后病理學檢查結果的一致性（例）
表2
淋巴結 BRAFV600E 基因檢測與術后病理學檢查結果的一致性（例）
表3
淋巴結 FNAC 聯合 BRAFV600E 基因檢測結果與術后病理學檢查結果的一致性（例）
2.2 BRAFV600E 基因檢測對淋巴結轉移的診斷價值
BRAFV600E 基因檢測對淋巴結轉移的診斷結果和診斷價值分別見表 2、表 4和表 5。可見 BRAFV600E 基因檢測診斷淋巴結轉移的靈敏度和準確率均較高，特異度及陽性預測值均為 100%。
表4
3 種方法的診斷效能比較［%（95% CI） ］
2.3 FNAC 檢查聯合 BRAFV600E 基因檢測對淋巴結轉移的診斷價值
FNAC 檢查聯合 BRAFV600E 基因檢測對淋巴結轉移的診斷結果及其價值分別見表 3–表 5。可見 FNAC 檢查聯合 BRAFV600E 基因檢測診斷淋巴結轉移的靈敏度和準確率均達 90.0% 以上，特異度和陽性預測值均為 100%。FACN 檢查聯合 BRAFV600E 基因檢測的 ROC 曲線下面積最大，提示診斷價值最高。
表5
3 種方法的 ROC 曲線下面積
3 討論
近些年，甲狀腺癌的發病率逐年上升，甲狀腺癌已位居女性惡性腫瘤的第 6 位，甲狀腺癌中 PTC 約占 90% 左右[5]。盡管 PTC 有良好的預后，但其頸部淋巴結轉移率較高，即使是乳頭狀微小癌也有近 47% 的淋巴結轉移率，頸側區淋巴結轉移率約為 20%[11]。淋巴結轉移情況對患者手術后的危險分層及治療指導均具有重要的臨床意義。目前國外指南[5] 的頸部淋巴結清掃指征主要依據術前是否明確有淋巴結轉移，并不建議進行預防性頸部淋巴結清掃。因此有無頸部淋巴結轉移是臨床醫師選擇何種手術方式的關鍵之一。如術前明確淋巴結轉移，進行頸部淋巴結清掃將減少再次手術對患者造成的創傷。目前超聲、CT 等影像學檢查可提供影像學證據，但頸部淋巴結轉移的確診仍需依靠淋巴結穿刺病理學診斷，此外還可以將細針穿刺沖洗液中的 TG 水平作為參考。然而，各種評估方法都存在一定的局限性。超聲對中央區淋巴結以及深部淋巴結的診斷靈敏度遠低于頸側區淋巴結，需要借助其他的檢查（如 CT 檢查）。2015 版 ATA 指南[5] 提出，可以通過增加細針穿刺洗脫液中 TG 含量的測定來對淋巴結轉移情況進行定性，然而因為受穿刺血液中 TG 的影響，以及目前對 TG 的界值未有統一標準，其并未在臨床廣泛使用[12-20]。
BRAF 基因屬于 RAF 基因家族，其編碼的蛋白是 RAS/RAF/MEK/細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號轉導調節通路的關鍵成分，該信號通路參與調節細胞的生長、增殖和凋亡，當其發生改變時則可能導致腫瘤發生。目前普遍認為，在甲狀腺癌的進程中，BRAF 基因突變是 PTC 形成的早期事件，而持續性激活 RAS/RAF/MEK/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路能夠促使甲狀腺細胞增殖，從而導致甲狀腺癌的發生[9]。
目前的研究[7-9] 表明，BRAFV600E 基因突變是 PTC 所特有的遺傳學改變，BRAFV600E 基因突變與 PTC 淋巴結轉移呈明顯正相關，BRAFV600E 基因突變可顯著提高 PTC 患者淋巴結轉移的發生概率。然而，BRAFV600E 基因突變對診斷 PTC 淋巴結轉移灶是否同樣存在特異性，值得研究。
靈敏度、特異度、準確率、陽性預測值及陰性預測值是評估診斷效能的常用指標。本研究以術后病理學檢查結果為“金標準”，分析了 FNAC 檢查和 BRAFV600E 基因檢測單獨及聯合應用對甲狀腺癌頸部淋巴結轉移的診斷價值。140 例患者中，FNAC 檢查診斷甲狀腺癌淋巴結轉移的的靈敏度為 63.6%，特異度為 100%，準確率為 65.7%，陽性預測值為 100%，陰性預測值為 14.3%；BRAFV600E 基因檢測的靈敏度為 84.8%，特異度為 100%，準確率為 85.7%，陽性預測值為 100%，陰性預測值為 28.5%；FNAC 檢查聯合 BRAFV600E 基因檢測的靈敏度為 90.9%，特異度為 100%，準確率為 91.4%，陽性預測值為 100%，陰性預測值為 40.0%；FNAC 檢查、BRAFV600E 基因檢測及 FNAC 檢查聯合 BRAFV600E 基因檢測的特異度及陽性預測值均能達到 100%，且 FNAC 檢查聯合 BRAFV600E 基因檢測的診斷價值最高。超聲引導下頸部淋巴結 FNAC 檢查聯合 BRAFV600E 基因檢測的診斷效能值得肯定，明顯提高了甲狀腺癌患者頸部淋巴結轉移的診斷準確率。因此，FNAC 檢查聯合 BRAFV600E 基因檢測可作為判斷淋巴結是否轉移的指標之一，具有一定的臨床意義。
甲狀腺癌的發病率逐年上升，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid cancer，PTC）是最常見的類型，占甲狀腺惡性腫瘤的 90% 左右，且易發生頸部淋巴結轉移，頸部淋巴結轉移率為 30%～80%[1-2]。術前判斷是否有淋巴結轉移對手術方式的選擇有重要意義。目前，對頸部是否有轉移淋巴結的判斷主要依賴超聲及 CT 檢查，但定性診斷仍需細針穿刺細胞學（fine needle aspiration cytology，FNAC）明確。然而，FNAC 受取材量、穿刺醫師、病理診斷醫師經驗等的限制，常伴有 20%～25% 的不確定性[3-5]。2015 版 美國甲狀腺協會（American Thyroid Association，ATA）指南[5] 提出，可以通過增加細針穿刺洗脫液中的甲狀腺球蛋白（thyroglobulin，TG）含量測定來對可疑淋巴結進行定性，然而因為受穿刺血液中 TG 的影響，限制了其診斷價值[6]。在另一方面，BRAFV600E 突變有著重要的臨床意義，是 PTC 患者最常出現的基因突變，其診斷敏感性可達 81.5%[7]。循證醫學研究[8-10] 表明，BRAFV600E 基因突變與 PTC 淋巴結轉移呈明顯正相關，BRAFV600E 基因突變可顯著提高 PTC 患者淋巴結轉移的發生概率。那是否可以通過檢測可疑轉移淋巴結中的 BRAFV600E 基因突變情況，直接以此判斷淋巴結是否為轉移灶呢？目前，直接通過對可疑淋巴結進行穿刺細胞學檢查并進行 BRAFV600E 基因檢測來判斷淋巴結是否為轉移灶的報道很少，本研究旨在探討超聲引導下頸部淋巴結 FNAC 聯合 BRAFV600E 基因檢測對甲狀腺癌頸部淋巴結轉移的診斷價值。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
病例納入標準：術前超聲檢查提示甲狀腺癌可疑淋巴結轉移灶；術前已行可疑淋巴結 FNAC 檢查及 BRAFV600E 基因檢測；行甲狀腺癌根治性手術治療。排除標準：檢查后未行手術治療；行核素治療者；死亡或者失訪患者。回顧性收集 2016 年 1 月至 2017 年 6 月期間于江蘇省中西醫結合醫院行頸部超聲檢查疑似甲狀腺癌頸部淋巴結轉移的 230 例患者。該 230 例患者經超聲檢查提示淋巴結回聲異常、可疑陽性淋巴結 ［本研究可疑淋巴結的判斷標準為超聲出現以下任何一項特點：高回聲、囊性改變、鈣化、異常血供、回聲異常、淋巴結呈圓形（縱橫比<1.5）、淋巴門回聲消失以及淋巴結直徑超過 8 mm］，為進一步明確診斷，行頸部可疑病變淋巴結 FNAC 檢查及 BRAFV600E 基因檢測。其中 124 例為甲狀腺癌術后，隨訪期間超聲檢查示可疑淋巴結轉移灶；106 例為超聲檢查高度懷疑甲狀腺癌伴頸部淋巴結轉移。檢查后，23 例失訪，20 例行131I 治療，46 例未予治療、定期復查，1 例死亡，余 140 例行甲狀腺切除和（或）頸部淋巴結清掃術，納入本研究分析。140 例患者均接受了甲狀腺癌根治術，其中男 56 例，女 84 例；年齡 19～72 歲、（49±16）歲。
1.2 方法
1.2.1 超聲引導下的 FNAC 檢測
患者取平臥位，將枕頭墊于肩和頸下，充分暴露頸前區。常規消毒，采用 7 號針頭及 10 mL 注射器，超聲實時引導下進針，直至顯示針尖到達病灶區，持續負壓，在不同方向抽吸標本，拔除針頭前消除負壓。將吸出物噴打在載玻片上制成細胞涂片，行 HE 染色后由 2 位細胞病理學醫生閱片，結果不一致時請上級主任醫師審核復片。
1.2.2 BRAFV600E 基因檢測
DNA 基因突變的檢測方法為：取新鮮穿刺細胞，提取 DNA 樣本，按人類 BRAF 基因 V600E 突變檢測試劑盒（廈門艾德生物公司，熒光 PCR 法）操作說明，將洗脫液及盒內各試劑加入 PCR 反應管內，將 PCR 反應管放入實時 PCR 儀器。按試劑盒說明書收集信號進行分析，判斷樣本基因是否是突變陽性。
1.3 陰性和陽性的判斷標準
FNAC 結果陽性定義為，見異型細胞或符合轉移癌/乳頭狀癌細胞表現（穿刺細胞豐富、涂片細胞大小不一、異型性明顯及核漿比例失常），炎性病變則視為陰性結果（穿刺成分少、涂片背景復雜；細胞大小不一、以小淋巴細胞為主、散在一些大細胞，小細胞為分化成熟的淋巴細胞），結核性病變及惡性淋巴瘤則排除。BRAFV600E 陽性定義為 BRAFV600E 基因見突變，未見突變定義為陰性。FNAC 聯合 BRAFV600E 陽性的定義為，FNAC 及 BRAFV600E 中的 2 項或者任意一項為陽性，陰性則定義為 2 項均為陰性。以術后病理學檢查為“金標準”，分析超聲引導下頸部淋巴結 FNAC 以及 BRAFV600E 單獨和聯合診斷甲狀腺癌淋巴結轉移的靈敏度、特異度、準確率、陽性預測值以及陰性預測值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 18.0 軟件進行統計學分析。計算每種方法的診斷效能指標，包括靈敏度、特異度、準確率、陽性預測值及陰性預測值，并計算每種方法的受試者工作特性（receiver operating characte- ristic，ROC）曲線下面積。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
140 例患者中，88 例為首次發現病變，超聲檢查考慮甲狀腺癌合并頸部淋巴結轉移，行甲狀腺切除術加頸淋巴結清掃術。術后病理學檢查提示 87 例為 PTC，1 例為髓樣癌；80 例伴有淋巴結轉移，8 例未見轉移。52 例為 PTC 術后患者，行頸部淋巴結清掃術（有殘葉者行補充切除），術后病理學檢查證實 52 例患者均存在頸部淋巴結轉移。FNAC、BRAFV600E 基因檢測及兩者聯合對甲狀腺癌頸部淋巴結轉移的診斷結果見表 1–表 3。
2.1 FNAC 檢查對淋巴結轉移的診斷價值
FNAC 檢查對淋巴結轉移的診斷結果和診斷價值分別見表 1、表 4和表5。由表 4 可見，FNAC 檢查診斷淋巴結轉移的靈敏度和準確率較低，特異度及陽性預測值較高（達 100%）。
表1
淋巴結 FNAC 檢查與術后病理學檢查結果的一致性（例）
表2
淋巴結 BRAFV600E 基因檢測與術后病理學檢查結果的一致性（例）
表3
淋巴結 FNAC 聯合 BRAFV600E 基因檢測結果與術后病理學檢查結果的一致性（例）
2.2 BRAFV600E 基因檢測對淋巴結轉移的診斷價值
BRAFV600E 基因檢測對淋巴結轉移的診斷結果和診斷價值分別見表 2、表 4和表 5。可見 BRAFV600E 基因檢測診斷淋巴結轉移的靈敏度和準確率均較高，特異度及陽性預測值均為 100%。
表4
3 種方法的診斷效能比較［%（95% CI） ］
2.3 FNAC 檢查聯合 BRAFV600E 基因檢測對淋巴結轉移的診斷價值
FNAC 檢查聯合 BRAFV600E 基因檢測對淋巴結轉移的診斷結果及其價值分別見表 3–表 5。可見 FNAC 檢查聯合 BRAFV600E 基因檢測診斷淋巴結轉移的靈敏度和準確率均達 90.0% 以上，特異度和陽性預測值均為 100%。FACN 檢查聯合 BRAFV600E 基因檢測的 ROC 曲線下面積最大，提示診斷價值最高。
表5
3 種方法的 ROC 曲線下面積
3 討論
近些年，甲狀腺癌的發病率逐年上升，甲狀腺癌已位居女性惡性腫瘤的第 6 位，甲狀腺癌中 PTC 約占 90% 左右[5]。盡管 PTC 有良好的預后，但其頸部淋巴結轉移率較高，即使是乳頭狀微小癌也有近 47% 的淋巴結轉移率，頸側區淋巴結轉移率約為 20%[11]。淋巴結轉移情況對患者手術后的危險分層及治療指導均具有重要的臨床意義。目前國外指南[5] 的頸部淋巴結清掃指征主要依據術前是否明確有淋巴結轉移，并不建議進行預防性頸部淋巴結清掃。因此有無頸部淋巴結轉移是臨床醫師選擇何種手術方式的關鍵之一。如術前明確淋巴結轉移，進行頸部淋巴結清掃將減少再次手術對患者造成的創傷。目前超聲、CT 等影像學檢查可提供影像學證據，但頸部淋巴結轉移的確診仍需依靠淋巴結穿刺病理學診斷，此外還可以將細針穿刺沖洗液中的 TG 水平作為參考。然而，各種評估方法都存在一定的局限性。超聲對中央區淋巴結以及深部淋巴結的診斷靈敏度遠低于頸側區淋巴結，需要借助其他的檢查（如 CT 檢查）。2015 版 ATA 指南[5] 提出，可以通過增加細針穿刺洗脫液中 TG 含量的測定來對淋巴結轉移情況進行定性，然而因為受穿刺血液中 TG 的影響，以及目前對 TG 的界值未有統一標準，其并未在臨床廣泛使用[12-20]。
BRAF 基因屬于 RAF 基因家族，其編碼的蛋白是 RAS/RAF/MEK/細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號轉導調節通路的關鍵成分，該信號通路參與調節細胞的生長、增殖和凋亡，當其發生改變時則可能導致腫瘤發生。目前普遍認為，在甲狀腺癌的進程中，BRAF 基因突變是 PTC 形成的早期事件，而持續性激活 RAS/RAF/MEK/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路能夠促使甲狀腺細胞增殖，從而導致甲狀腺癌的發生[9]。
目前的研究[7-9] 表明，BRAFV600E 基因突變是 PTC 所特有的遺傳學改變，BRAFV600E 基因突變與 PTC 淋巴結轉移呈明顯正相關，BRAFV600E 基因突變可顯著提高 PTC 患者淋巴結轉移的發生概率。然而，BRAFV600E 基因突變對診斷 PTC 淋巴結轉移灶是否同樣存在特異性，值得研究。
靈敏度、特異度、準確率、陽性預測值及陰性預測值是評估診斷效能的常用指標。本研究以術后病理學檢查結果為“金標準”，分析了 FNAC 檢查和 BRAFV600E 基因檢測單獨及聯合應用對甲狀腺癌頸部淋巴結轉移的診斷價值。140 例患者中，FNAC 檢查診斷甲狀腺癌淋巴結轉移的的靈敏度為 63.6%，特異度為 100%，準確率為 65.7%，陽性預測值為 100%，陰性預測值為 14.3%；BRAFV600E 基因檢測的靈敏度為 84.8%，特異度為 100%，準確率為 85.7%，陽性預測值為 100%，陰性預測值為 28.5%；FNAC 檢查聯合 BRAFV600E 基因檢測的靈敏度為 90.9%，特異度為 100%，準確率為 91.4%，陽性預測值為 100%，陰性預測值為 40.0%；FNAC 檢查、BRAFV600E 基因檢測及 FNAC 檢查聯合 BRAFV600E 基因檢測的特異度及陽性預測值均能達到 100%，且 FNAC 檢查聯合 BRAFV600E 基因檢測的診斷價值最高。超聲引導下頸部淋巴結 FNAC 檢查聯合 BRAFV600E 基因檢測的診斷效能值得肯定，明顯提高了甲狀腺癌患者頸部淋巴結轉移的診斷準確率。因此，FNAC 檢查聯合 BRAFV600E 基因檢測可作為判斷淋巴結是否轉移的指標之一，具有一定的臨床意義。
