引用本文： 代智, 楊怡. 肝癌診斷標志物的新進展及應用. 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(4): 391-395. doi: 10.7507/1007-9424.201801127 復制
肝癌是一種高發病率、高死亡率的惡性腫瘤，在世界范圍內肝癌的發病率在男性中占第 5 位，死亡率占第 2 位；在女性中肝癌的發病率占第 9 位，死亡率占第 6 位，且保持逐年上升的趨勢[1]。而中國作為一個肝癌高發國家，肝癌死亡例數占全球死亡例數的一半以上[2]。Kudo 等[3]對日本 1978–2005 年期間的 173 378 例肝癌患者的 5 年生存率進行了統計分析，發現隨著時間推移，從 1978 到 2005 年，平均最大腫瘤直徑明顯下降，隨之 5 年生存率從 3.7% 上升到 42.7%，中位生存時間從 3 個月延長到 50 個月。這不僅僅是由于肝癌切除術、肝動脈化療栓塞術（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）及射頻消融術的發展和分子靶向治療的興起，也與肝癌的篩查及診斷技術提升、早期肝癌的發現率升高有關，提示肝癌的早診早治有利于生存率的提高。現認為，肝癌預后不良的主要原因是，臨床上確診的患者往往已有明顯癥狀，腫瘤已發展至中晚期，錯過了手術切除的治療時機，僅有 15%～30% 的晚期肝癌患者能夠通過手術切除延長生存時間[4]。因此，臨床上，早期診斷和早期治療（包括手術、TACE、射頻消融等）仍是目前提高患者生存率最有效的方法。
肝癌的篩查主要依靠影像學和生物標志物，現在臨床上常用的方式即為甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）結合影像學檢查，依據病理學檢查進行確診。然而，該種篩查方式仍存在較大缺陷，如檢查不夠便捷，對早期肝癌的診斷不夠靈敏，對于 AFP 陰性患者的漏診率高。因此，臨床需要不同的診斷標志物，分別用于分辨肝癌和肝硬變、乙肝患者、丙肝患者及健康人。近年來諸多專家學者取得不少成果，現就近年來肝癌診斷標志物的研究作一概括。
1 腫瘤生物標志物的概念
生物標志物是可以被客觀測量的用于識別、監測疾病進展的蛋白質或其他分子，包括活檢組織樣本中檢測到的生化指標、體液中可檢測的生化指標或者細胞及影像學指標。腫瘤生物標志物一般在腫瘤細胞中特異性高表達，而在正常細胞中幾乎不表達，具備診斷、評判預后、預測復發等臨床價值。
2 傳統的肝癌診斷標志物
2.1 AFP
AFP 是一種單鏈多肽蛋白聚糖，是目前臨床上最常用的肝癌生物標志物，最早由 Bergstrand 等發現，常與超聲檢查聯合應用。AFP 的出現大幅提高了肝癌的臨床診斷率，但由于慢性肝臟疾病、胚胎腫瘤及消化道腫瘤也會導致 AFP 升高[5]，且 AFP 陰性的肝癌患者占肝癌總數的 30%～40%[6]，AFP 作為肝癌篩查的標志物仍有較大的局限性。
不同的 AFP 糖基可結合不同的植物凝集素。其中，AFP-L3 是一種能與扁豆凝集素特異性結合的 AFP 異質體，肝癌主要表現為 AFP-L3 特異性增加，而良性肝臟疾病常表現為 AFP-p4/5 增加[7]。然而，AFP-L3 的表達水平與 AFP 并不完全一致[8]，且 AFP-L3 的診斷價值優于 AFP。
2.2 脫-γ-羧基凝血酶原（des-γ- carboxy-prothrombin，DCP）
DCP 是在肝癌病程中特異產生的異常凝血酶原，肝癌術后復發患者血清中該物質水平高于未復發病例，是繼 AFP 外最常用的肝癌標志物。因為 DCP 水平與 AFP 水平無關[9]，其與 AFP 聯合應用可顯著提高肝癌檢出率，減少漏診。美國學者[10]納入 1999–2001 年期間收治的肝癌病例進行分析，發現 AFP-L3、DCP 和 AFP 的敏感性分別為 61.6%、72.7% 和 67.7%，而結合這 3 種標志物，肝癌的診斷敏感性高達 85.9%。我國也已將肝癌三聯檢（AFP-L3、DCP 和 AFP）列入國家“十三五”傳染病防治規劃中，積極應用于臨床實踐。
2.3 磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3（glypican-3，GPC3）
GPC3 是一種與細胞增殖與胚胎發育相關的硫酸肝素蛋白多糖，錨定在細胞膜上[11]，該蛋白分子僅在肝癌患者的癌組織及血清中表達升高，在健康人及良性肝臟疾病患者體內幾乎檢測不到，其表達與 AFP 無相關性，且其敏感性和特異性不亞于 AFP[12-13]，因此對 AFP 陰性的肝癌患者的診斷有重大價值[14]。
2.4 α-L 巖藻糖苷酶（AFU）
肝癌患者的 AFU 活力顯著增高，可用于診斷原發性肝癌，但其診斷標準模糊，表達量在轉移性肝癌、肺癌及乳腺癌之間有重疊，并且肝炎及肝硬變患者均有輕度升高。
3 新型的肝癌診斷標志物
3.1 microRNA（miRNA）
miRNA 是一類長度為 19～25 nt 的短鏈非編碼 RNA，可通過非嚴格的堿基互補配對，結合 mRNA 的 3x-UTR 區，促進 mRNA 的翻譯表達或降解，調節 mRNA 的表達水平，從而廣泛參與基因轉錄后調控過程。近年來，復旦大學中山醫院肝癌研究所進行了多項研究[15-18]，也證實了檢測組織和血清中 miRNA 的表達水平可用于肝癌的診斷，預測肝癌的病理學分型和肝癌預后，在肝癌的篩查和隨訪中具有一定的參考價值。
Xu 等[19]研究發現，血漿 miRNA-21、miRNA-122 和 miRNA-223 在肝癌患者的血漿中明顯升高。Qu 等[20]報道，血漿 miRNA-16 和 miRNA-199a 在肝癌患者的血漿中顯著下降。Li 等[21]通過檢測 HBV 陽性肝癌患者和對照組人群的血樣后發現，聯合檢測 miRNA-23b、miRNA-423、miRNA-375、miRNA-23a 及 miRNA-342-3p 時，其受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）的曲線下面積（area under curve，AUC）可達 （99.9±0.1）%，敏感度為 96.9%，特異度為 99.4%。Zhou 等[22]對肝癌患者血漿中的 723 種 miRNA 進行篩選，該試驗入選了 934 例受試者，經過基因芯片篩選后，評估差異 miRNA 的診斷準確率，得到了7 種差異性 miRNA 的 AUC：hsa-miRNA-122 為 0.553，hsa-miRNA-192 為 0.569，hsa-miRNA-21 為 0.626，hsa-miRNA-223 為 0.643，hsa-miRNA-26a 為 0.665，hsa-miRNA-27a 為 0.638，hsa-miRNA-801 為 0.629，而 7 種 miRNA 組合診斷肝癌的 AUC 可高達 0.864，敏感度達 68.6%，特異度達 90.1%。進一步研究發現，這 7 種 miRNA 組成的肝癌診斷試劑盒區分肝癌和正常人群的準確率達 94.1%，區分肝癌和肝炎的準確率達 84.2%，區分肝癌和肝硬變的準確率達 88.4%[22]，現已獲得 CFDA 批準。該檢測方法簡單易行且經濟成本相對較低，有利于臨床實踐的應用及推廣。
3.2 長鏈非編碼 RNA（long non coding RNA，LncRNA）
LncRNA 是一類長度介于 200～100 000 個核苷酸的非編碼 RNA。近年來，越來越多的研究[23-25]表明，LncRNA 在細胞生長、分化、代謝等生物學功能中發揮強大的調控作用，影響各種生物學過程，已成為各種慢性疾病尤其是腫瘤學的研究熱點。LncRNA 比 mRNA 更具時間及空間特異性，且在細胞內穩定表達。LncRNA 的二級結構穩定，因此在體液中不易被降解，容易檢測[26]，可為臨床決策的制定提供有力證據。
現有多篇文獻報道了 LncRNA 與多種類型腫瘤的發生發展間具有密切關系，如 H19[27]、肝癌高表達轉錄本（highly up-regulated in liver cancer，HULC）[28]、HOX 轉錄反義 RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）[29]等。Yang 等[30]通過分析 20 例肝癌患者的 60 個樣本（癌組織、癌旁組織及門靜脈癌栓）的 RNA-seq 數據，新發現 8 603 種差異性 LncRNA，再聯合已發表的肝癌數據和癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, ，TCGA）數據庫中的 13 870 種 LncRNA，在以上的 LncRNA 中，用 GFOLD、DESeq2 及 Wilcoxon 符號秩檢驗 3 種統計方法，篩選出了 525 種下調、323 種上調的與肝癌發生相關的 LncRNA；通過對比同一患者的原發腫瘤灶和門靜脈癌栓標本，發現 HAND2-AS1 在門靜脈癌栓中顯著下調，提示細胞內 HAND2-AS1 的下調導致腫瘤細胞的侵襲力增強，功能實驗證實 HAND2-AS1 與細胞遷移和侵襲能力密切相關。同時，Yang 等[30]發現，根據腫瘤侵襲相關的 RP11-166D19.1 的表達量，可將 TCGA 隊列分為高生存率和低生存率 2 組，且 RP11-166D19.1 的表達量與生存時間密切相關（P=0.003 7），提示 RP11-166D19.1 也可作為肝癌預后的診斷標志物。
3.3 DKK-1（dickkopf-1）
DKK-1 是一種可以拮抗 Wnt 通路的分泌蛋白[31]，在正常組織中幾乎不表達，而在肝癌、肺癌、乳腺癌及宮頸癌組織中呈高表達，提示 DKK-1 是一種潛在的血清腫瘤標志物。Shen 等[32]在一項大樣本、多中心研究中，通過 ELISA 法檢測了 1 284 位入選者的血清 DKK-1 濃度，發現 DKK-1 在肝癌患者血清中濃度顯著升高，且患者行手術切除后降低至正常，診斷價值高于常規的 AFP；同時，血清中 DKK-1 水平可區分肝癌、肝硬變及慢性乙肝，對早期肝癌的診斷準確率高，檢測方便。
3.4 熱休克蛋白 90α（heat shock protein 90α，Hsp90α）
Hsp90α 是一種存在于細胞膜表面并分泌至細胞外的保守的分子伴侶[33]，Hsp90α 在多種腫瘤患者的血清中大幅度升高，且和腫瘤惡性程度成正相關[34]。Fu 等[35]在一項大樣本、多中心臨床試驗中，檢測了 1 647 例入選者的血樣，發現 Hsp90α 診斷肝癌的敏感度可達 92.7%，特異度為 91.3%，甚至可以檢測早期肝癌、小肝癌（<3 cm）和 AFP 陰性肝癌，相應的 Hsp90α 檢測試劑盒已獲 CFDA 批準在臨床中使用，這對提高腫瘤患者的病情監測和療效評價水平，以及實現腫瘤的個體化治療均具有重要的推動作用。
4 生物標志物的應用
4.1 液體活檢
miRNA 和 LncRNA 均與肝癌的發生、發展及侵襲能力密切相關，而這些分子不僅表達在細胞中，并且能夠進入體液。通過抽血，可快速檢測到這些反映腫瘤進程的 miRNA 和 LncRNA，或者包裹這些分子的外泌體，甚至可以檢測到循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs），這種可以通過驗血對腫瘤進行動態活檢和實時監測的方式，稱為液體活檢技術，其可以較為直觀地檢測到腫瘤細胞的特異性突變，及時發現腫瘤復發和耐藥征兆，為無法手術及活檢的患者提供基因突變檢測結果，協助個體精確治療，同時可應用于術后患者的定期隨訪，早期發現高危復發患者，提前進行干預，提高生存率[36-37]。
4.2 循環游離 DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）
cfDNA 常攜帶腫瘤特異性的基因信息及突變信息，如 DNA 甲基化是調控基因表觀的常見方式之一，常導致基因沉默[38]，因此早期在血液中檢測到抑癌基因的 DNA 甲基化，有助于篩選腫瘤發生的高危人群[39-40]。Wen 等[41]認為，雖然早期肝癌的 cfDNA 主要來源于癌旁組織，但 cfDNA 的甲基化水平與肝癌密切相關。Xu 等[42]通過分析 1 098 例肝癌患者和 835 位正常對照的血漿 cfDNA 樣本后發現，循環腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的甲基化水平與肝癌高度相關，10 種 ctDNA 甲基化標志物在診斷肝癌方面具有高敏感性和高特異性，且與腫瘤負荷、腫瘤分期、治療反應等密切相關。因此，如何確認有效及定量的 cfDNA 檢測手段，并應用于臨床肝癌的診斷，制定評估標準，是未來亟待攻克的一項重大挑戰。
4.3 CTCs
基于血液檢測手段，CTCs 可視為實時評估實體瘤的非入侵性的活檢術。復旦大學中山醫院肝研所樊嘉教授團隊[43]分析了 123 例肝癌患者的血樣，發現 CTCs 可排除肝癌組織病理多樣性和腫瘤細胞異質性的干擾，更準確地反映肝癌細胞的分子分型和細胞侵襲性，有助于尋找治療靶點和耐藥機制，故 CTCs 檢測結果可以用于指導肝癌手術方式和術后個體化治療，具有獨特的臨床意義。并且，血樣中的 CTCs 由于采血的血管不同，CTCs 的上皮表型和分子特性不同，具有空間異質性，可預測患者的不同預后。研究[44]表明，外周靜脈 CTCs>2 個細胞/7.5 mL 血樣或者外周動脈 CTC>1 個細胞/7.5 mL 血樣時，可提示患者肝內復發，肝靜脈 CTCs>18 個細胞/7.5 mL 血樣或者肝下下腔靜脈 CTCs>3 個細胞/7.5 mL 血樣提示有肺轉移可能。因此，CTCs 的檢測不僅能早期篩查和診斷，還可以評估轉移風險，篩選復發和轉移的高危人群。隨著單細胞測序等手段的發展，CTCs 必將在腫瘤形成和發展機制的研究中提供重要信息。
4.4 外泌體
外泌體是一種保存著細胞特異性蛋白及小分子物質的小型囊泡[45]，可在血漿、尿液、唾液、乳汁、關節滑液等體液中檢測到[46]。外泌體中不僅有 mRNA、miRNA、LncRNA、環狀 RNA 等，還有可以反映腫瘤存在的其他形式，例如抗原和酶，故外泌體的研究有助于腫瘤的診斷。外泌體對內部的 miRNA 等具有保護作用，可減少 miRNA 被細胞外的 RNA 酶降解[47]。隨著分子生物學和分子影像學的發展，以及等離子體共振成像（SPRI）技術的成熟，使得定量檢測腫瘤來源的外泌體和標志物成為現實[48]。
Sohn 等[49]收集了慢性乙肝患者、肝硬變患者及肝癌患者 3 組人群血清中的外泌體 miRNA 和循環 miRNA，RT-PCR 結果顯示，肝癌患者血清中 miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-222 和 miRNA-224 的表達顯著上調，而 miRNA-101、miRNA-106b、miRNA-122 和 miRNA-195 的表達顯著下調。有趣的是，血漿循環 miRNA 在 3 組人群血清中存在相同的差異趨勢，但差異水平不明顯[49]，證實外泌體中 miRNA 具有相對穩定、容易檢測等特點。同時，外泌體中 miRNA 的表達水平可提示其來源的腫瘤細胞的正常及異常生物學過程，如 miRNA-18a 通過降低雌激素受體-α 水平，影響肝癌細胞增生[50]；miRNA-221 調控 DNA 損傷，導致肝癌細胞凋亡[51]；miR-222 協助激活蛋白激酶 B（protein kinases B，PKB）通路，影響肝癌細胞的遷移。這些改變的 miRNA 可從細胞的生長、凋亡、細胞周期等各個方面影響肝癌細胞，反映腫瘤細胞的侵襲、轉移、抗原提呈及凋亡過程[52]。此外，外泌體的腫瘤相關性 miRNA 在卵巢癌、肺癌等中也表現出作為診斷標志物的極大的生物價值[53-54]。
5 小結
提高肝癌患者的生存率，早診早治是關鍵，因此肝癌生物標志物的研究依舊是未來肝癌領域的熱點和重點。近年來，隨著關于肝癌腫瘤標志物研究的不斷深入，同時隨著蛋白質組學、基因組學及代謝組學的發展，各種潛在的生物標志物層出不窮，但腫瘤的生物標志物從實驗室研究到臨床轉化之間依舊需要大量的后續研究，且過程漫長。我們期望這些標志物的優化組合能提高肝癌早診的可靠性和準確性，同時結合液體活檢技術提高肝癌患者的診斷效率，以協助化療用藥指導及診療用藥規范。
肝癌是一種高發病率、高死亡率的惡性腫瘤，在世界范圍內肝癌的發病率在男性中占第 5 位，死亡率占第 2 位；在女性中肝癌的發病率占第 9 位，死亡率占第 6 位，且保持逐年上升的趨勢[1]。而中國作為一個肝癌高發國家，肝癌死亡例數占全球死亡例數的一半以上[2]。Kudo 等[3]對日本 1978–2005 年期間的 173 378 例肝癌患者的 5 年生存率進行了統計分析，發現隨著時間推移，從 1978 到 2005 年，平均最大腫瘤直徑明顯下降，隨之 5 年生存率從 3.7% 上升到 42.7%，中位生存時間從 3 個月延長到 50 個月。這不僅僅是由于肝癌切除術、肝動脈化療栓塞術（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）及射頻消融術的發展和分子靶向治療的興起，也與肝癌的篩查及診斷技術提升、早期肝癌的發現率升高有關，提示肝癌的早診早治有利于生存率的提高。現認為，肝癌預后不良的主要原因是，臨床上確診的患者往往已有明顯癥狀，腫瘤已發展至中晚期，錯過了手術切除的治療時機，僅有 15%～30% 的晚期肝癌患者能夠通過手術切除延長生存時間[4]。因此，臨床上，早期診斷和早期治療（包括手術、TACE、射頻消融等）仍是目前提高患者生存率最有效的方法。
肝癌的篩查主要依靠影像學和生物標志物，現在臨床上常用的方式即為甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）結合影像學檢查，依據病理學檢查進行確診。然而，該種篩查方式仍存在較大缺陷，如檢查不夠便捷，對早期肝癌的診斷不夠靈敏，對于 AFP 陰性患者的漏診率高。因此，臨床需要不同的診斷標志物，分別用于分辨肝癌和肝硬變、乙肝患者、丙肝患者及健康人。近年來諸多專家學者取得不少成果，現就近年來肝癌診斷標志物的研究作一概括。
1 腫瘤生物標志物的概念
生物標志物是可以被客觀測量的用于識別、監測疾病進展的蛋白質或其他分子，包括活檢組織樣本中檢測到的生化指標、體液中可檢測的生化指標或者細胞及影像學指標。腫瘤生物標志物一般在腫瘤細胞中特異性高表達，而在正常細胞中幾乎不表達，具備診斷、評判預后、預測復發等臨床價值。
2 傳統的肝癌診斷標志物
2.1 AFP
AFP 是一種單鏈多肽蛋白聚糖，是目前臨床上最常用的肝癌生物標志物，最早由 Bergstrand 等發現，常與超聲檢查聯合應用。AFP 的出現大幅提高了肝癌的臨床診斷率，但由于慢性肝臟疾病、胚胎腫瘤及消化道腫瘤也會導致 AFP 升高[5]，且 AFP 陰性的肝癌患者占肝癌總數的 30%～40%[6]，AFP 作為肝癌篩查的標志物仍有較大的局限性。
不同的 AFP 糖基可結合不同的植物凝集素。其中，AFP-L3 是一種能與扁豆凝集素特異性結合的 AFP 異質體，肝癌主要表現為 AFP-L3 特異性增加，而良性肝臟疾病常表現為 AFP-p4/5 增加[7]。然而，AFP-L3 的表達水平與 AFP 并不完全一致[8]，且 AFP-L3 的診斷價值優于 AFP。
2.2 脫-γ-羧基凝血酶原（des-γ- carboxy-prothrombin，DCP）
DCP 是在肝癌病程中特異產生的異常凝血酶原，肝癌術后復發患者血清中該物質水平高于未復發病例，是繼 AFP 外最常用的肝癌標志物。因為 DCP 水平與 AFP 水平無關[9]，其與 AFP 聯合應用可顯著提高肝癌檢出率，減少漏診。美國學者[10]納入 1999–2001 年期間收治的肝癌病例進行分析，發現 AFP-L3、DCP 和 AFP 的敏感性分別為 61.6%、72.7% 和 67.7%，而結合這 3 種標志物，肝癌的診斷敏感性高達 85.9%。我國也已將肝癌三聯檢（AFP-L3、DCP 和 AFP）列入國家“十三五”傳染病防治規劃中，積極應用于臨床實踐。
2.3 磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3（glypican-3，GPC3）
GPC3 是一種與細胞增殖與胚胎發育相關的硫酸肝素蛋白多糖，錨定在細胞膜上[11]，該蛋白分子僅在肝癌患者的癌組織及血清中表達升高，在健康人及良性肝臟疾病患者體內幾乎檢測不到，其表達與 AFP 無相關性，且其敏感性和特異性不亞于 AFP[12-13]，因此對 AFP 陰性的肝癌患者的診斷有重大價值[14]。
2.4 α-L 巖藻糖苷酶（AFU）
肝癌患者的 AFU 活力顯著增高，可用于診斷原發性肝癌，但其診斷標準模糊，表達量在轉移性肝癌、肺癌及乳腺癌之間有重疊，并且肝炎及肝硬變患者均有輕度升高。
3 新型的肝癌診斷標志物
3.1 microRNA（miRNA）
miRNA 是一類長度為 19～25 nt 的短鏈非編碼 RNA，可通過非嚴格的堿基互補配對，結合 mRNA 的 3x-UTR 區，促進 mRNA 的翻譯表達或降解，調節 mRNA 的表達水平，從而廣泛參與基因轉錄后調控過程。近年來，復旦大學中山醫院肝癌研究所進行了多項研究[15-18]，也證實了檢測組織和血清中 miRNA 的表達水平可用于肝癌的診斷，預測肝癌的病理學分型和肝癌預后，在肝癌的篩查和隨訪中具有一定的參考價值。
Xu 等[19]研究發現，血漿 miRNA-21、miRNA-122 和 miRNA-223 在肝癌患者的血漿中明顯升高。Qu 等[20]報道，血漿 miRNA-16 和 miRNA-199a 在肝癌患者的血漿中顯著下降。Li 等[21]通過檢測 HBV 陽性肝癌患者和對照組人群的血樣后發現，聯合檢測 miRNA-23b、miRNA-423、miRNA-375、miRNA-23a 及 miRNA-342-3p 時，其受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）的曲線下面積（area under curve，AUC）可達 （99.9±0.1）%，敏感度為 96.9%，特異度為 99.4%。Zhou 等[22]對肝癌患者血漿中的 723 種 miRNA 進行篩選，該試驗入選了 934 例受試者，經過基因芯片篩選后，評估差異 miRNA 的診斷準確率，得到了7 種差異性 miRNA 的 AUC：hsa-miRNA-122 為 0.553，hsa-miRNA-192 為 0.569，hsa-miRNA-21 為 0.626，hsa-miRNA-223 為 0.643，hsa-miRNA-26a 為 0.665，hsa-miRNA-27a 為 0.638，hsa-miRNA-801 為 0.629，而 7 種 miRNA 組合診斷肝癌的 AUC 可高達 0.864，敏感度達 68.6%，特異度達 90.1%。進一步研究發現，這 7 種 miRNA 組成的肝癌診斷試劑盒區分肝癌和正常人群的準確率達 94.1%，區分肝癌和肝炎的準確率達 84.2%，區分肝癌和肝硬變的準確率達 88.4%[22]，現已獲得 CFDA 批準。該檢測方法簡單易行且經濟成本相對較低，有利于臨床實踐的應用及推廣。
3.2 長鏈非編碼 RNA（long non coding RNA，LncRNA）
LncRNA 是一類長度介于 200～100 000 個核苷酸的非編碼 RNA。近年來，越來越多的研究[23-25]表明，LncRNA 在細胞生長、分化、代謝等生物學功能中發揮強大的調控作用，影響各種生物學過程，已成為各種慢性疾病尤其是腫瘤學的研究熱點。LncRNA 比 mRNA 更具時間及空間特異性，且在細胞內穩定表達。LncRNA 的二級結構穩定，因此在體液中不易被降解，容易檢測[26]，可為臨床決策的制定提供有力證據。
現有多篇文獻報道了 LncRNA 與多種類型腫瘤的發生發展間具有密切關系，如 H19[27]、肝癌高表達轉錄本（highly up-regulated in liver cancer，HULC）[28]、HOX 轉錄反義 RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）[29]等。Yang 等[30]通過分析 20 例肝癌患者的 60 個樣本（癌組織、癌旁組織及門靜脈癌栓）的 RNA-seq 數據，新發現 8 603 種差異性 LncRNA，再聯合已發表的肝癌數據和癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, ，TCGA）數據庫中的 13 870 種 LncRNA，在以上的 LncRNA 中，用 GFOLD、DESeq2 及 Wilcoxon 符號秩檢驗 3 種統計方法，篩選出了 525 種下調、323 種上調的與肝癌發生相關的 LncRNA；通過對比同一患者的原發腫瘤灶和門靜脈癌栓標本，發現 HAND2-AS1 在門靜脈癌栓中顯著下調，提示細胞內 HAND2-AS1 的下調導致腫瘤細胞的侵襲力增強，功能實驗證實 HAND2-AS1 與細胞遷移和侵襲能力密切相關。同時，Yang 等[30]發現，根據腫瘤侵襲相關的 RP11-166D19.1 的表達量，可將 TCGA 隊列分為高生存率和低生存率 2 組，且 RP11-166D19.1 的表達量與生存時間密切相關（P=0.003 7），提示 RP11-166D19.1 也可作為肝癌預后的診斷標志物。
3.3 DKK-1（dickkopf-1）
DKK-1 是一種可以拮抗 Wnt 通路的分泌蛋白[31]，在正常組織中幾乎不表達，而在肝癌、肺癌、乳腺癌及宮頸癌組織中呈高表達，提示 DKK-1 是一種潛在的血清腫瘤標志物。Shen 等[32]在一項大樣本、多中心研究中，通過 ELISA 法檢測了 1 284 位入選者的血清 DKK-1 濃度，發現 DKK-1 在肝癌患者血清中濃度顯著升高，且患者行手術切除后降低至正常，診斷價值高于常規的 AFP；同時，血清中 DKK-1 水平可區分肝癌、肝硬變及慢性乙肝，對早期肝癌的診斷準確率高，檢測方便。
3.4 熱休克蛋白 90α（heat shock protein 90α，Hsp90α）
Hsp90α 是一種存在于細胞膜表面并分泌至細胞外的保守的分子伴侶[33]，Hsp90α 在多種腫瘤患者的血清中大幅度升高，且和腫瘤惡性程度成正相關[34]。Fu 等[35]在一項大樣本、多中心臨床試驗中，檢測了 1 647 例入選者的血樣，發現 Hsp90α 診斷肝癌的敏感度可達 92.7%，特異度為 91.3%，甚至可以檢測早期肝癌、小肝癌（<3 cm）和 AFP 陰性肝癌，相應的 Hsp90α 檢測試劑盒已獲 CFDA 批準在臨床中使用，這對提高腫瘤患者的病情監測和療效評價水平，以及實現腫瘤的個體化治療均具有重要的推動作用。
4 生物標志物的應用
4.1 液體活檢
miRNA 和 LncRNA 均與肝癌的發生、發展及侵襲能力密切相關，而這些分子不僅表達在細胞中，并且能夠進入體液。通過抽血，可快速檢測到這些反映腫瘤進程的 miRNA 和 LncRNA，或者包裹這些分子的外泌體，甚至可以檢測到循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs），這種可以通過驗血對腫瘤進行動態活檢和實時監測的方式，稱為液體活檢技術，其可以較為直觀地檢測到腫瘤細胞的特異性突變，及時發現腫瘤復發和耐藥征兆，為無法手術及活檢的患者提供基因突變檢測結果，協助個體精確治療，同時可應用于術后患者的定期隨訪，早期發現高危復發患者，提前進行干預，提高生存率[36-37]。
4.2 循環游離 DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）
cfDNA 常攜帶腫瘤特異性的基因信息及突變信息，如 DNA 甲基化是調控基因表觀的常見方式之一，常導致基因沉默[38]，因此早期在血液中檢測到抑癌基因的 DNA 甲基化，有助于篩選腫瘤發生的高危人群[39-40]。Wen 等[41]認為，雖然早期肝癌的 cfDNA 主要來源于癌旁組織，但 cfDNA 的甲基化水平與肝癌密切相關。Xu 等[42]通過分析 1 098 例肝癌患者和 835 位正常對照的血漿 cfDNA 樣本后發現，循環腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的甲基化水平與肝癌高度相關，10 種 ctDNA 甲基化標志物在診斷肝癌方面具有高敏感性和高特異性，且與腫瘤負荷、腫瘤分期、治療反應等密切相關。因此，如何確認有效及定量的 cfDNA 檢測手段，并應用于臨床肝癌的診斷，制定評估標準，是未來亟待攻克的一項重大挑戰。
4.3 CTCs
基于血液檢測手段，CTCs 可視為實時評估實體瘤的非入侵性的活檢術。復旦大學中山醫院肝研所樊嘉教授團隊[43]分析了 123 例肝癌患者的血樣，發現 CTCs 可排除肝癌組織病理多樣性和腫瘤細胞異質性的干擾，更準確地反映肝癌細胞的分子分型和細胞侵襲性，有助于尋找治療靶點和耐藥機制，故 CTCs 檢測結果可以用于指導肝癌手術方式和術后個體化治療，具有獨特的臨床意義。并且，血樣中的 CTCs 由于采血的血管不同，CTCs 的上皮表型和分子特性不同，具有空間異質性，可預測患者的不同預后。研究[44]表明，外周靜脈 CTCs>2 個細胞/7.5 mL 血樣或者外周動脈 CTC>1 個細胞/7.5 mL 血樣時，可提示患者肝內復發，肝靜脈 CTCs>18 個細胞/7.5 mL 血樣或者肝下下腔靜脈 CTCs>3 個細胞/7.5 mL 血樣提示有肺轉移可能。因此，CTCs 的檢測不僅能早期篩查和診斷，還可以評估轉移風險，篩選復發和轉移的高危人群。隨著單細胞測序等手段的發展，CTCs 必將在腫瘤形成和發展機制的研究中提供重要信息。
4.4 外泌體
外泌體是一種保存著細胞特異性蛋白及小分子物質的小型囊泡[45]，可在血漿、尿液、唾液、乳汁、關節滑液等體液中檢測到[46]。外泌體中不僅有 mRNA、miRNA、LncRNA、環狀 RNA 等，還有可以反映腫瘤存在的其他形式，例如抗原和酶，故外泌體的研究有助于腫瘤的診斷。外泌體對內部的 miRNA 等具有保護作用，可減少 miRNA 被細胞外的 RNA 酶降解[47]。隨著分子生物學和分子影像學的發展，以及等離子體共振成像（SPRI）技術的成熟，使得定量檢測腫瘤來源的外泌體和標志物成為現實[48]。
Sohn 等[49]收集了慢性乙肝患者、肝硬變患者及肝癌患者 3 組人群血清中的外泌體 miRNA 和循環 miRNA，RT-PCR 結果顯示，肝癌患者血清中 miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-222 和 miRNA-224 的表達顯著上調，而 miRNA-101、miRNA-106b、miRNA-122 和 miRNA-195 的表達顯著下調。有趣的是，血漿循環 miRNA 在 3 組人群血清中存在相同的差異趨勢，但差異水平不明顯[49]，證實外泌體中 miRNA 具有相對穩定、容易檢測等特點。同時，外泌體中 miRNA 的表達水平可提示其來源的腫瘤細胞的正常及異常生物學過程，如 miRNA-18a 通過降低雌激素受體-α 水平，影響肝癌細胞增生[50]；miRNA-221 調控 DNA 損傷，導致肝癌細胞凋亡[51]；miR-222 協助激活蛋白激酶 B（protein kinases B，PKB）通路，影響肝癌細胞的遷移。這些改變的 miRNA 可從細胞的生長、凋亡、細胞周期等各個方面影響肝癌細胞，反映腫瘤細胞的侵襲、轉移、抗原提呈及凋亡過程[52]。此外，外泌體的腫瘤相關性 miRNA 在卵巢癌、肺癌等中也表現出作為診斷標志物的極大的生物價值[53-54]。
5 小結
提高肝癌患者的生存率，早診早治是關鍵，因此肝癌生物標志物的研究依舊是未來肝癌領域的熱點和重點。近年來，隨著關于肝癌腫瘤標志物研究的不斷深入，同時隨著蛋白質組學、基因組學及代謝組學的發展，各種潛在的生物標志物層出不窮，但腫瘤的生物標志物從實驗室研究到臨床轉化之間依舊需要大量的后續研究，且過程漫長。我們期望這些標志物的優化組合能提高肝癌早診的可靠性和準確性，同時結合液體活檢技術提高肝癌患者的診斷效率，以協助化療用藥指導及診療用藥規范。