引用本文： 胡偉, 沈豐, 張楨, 吳紅偉, 周文波. 胰腺癌組織中 Beclin-1 mRNA 和 miR-216a 的表達及 VEGF 蛋白表達與 p-MAPK-ERK1/2信號通路的關系. 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(7): 859-862. doi: 10.7507/1007-9424.201712086 復制
胰腺癌因早期診斷困難和惡性程度高，多數患者確診時已處進展期或晚期[1-2]，故手術切除的療效和預后差，死亡率居高不下[3]，因此探究胰腺癌的發生與發展機制意義重大。近年來諸多循證醫學和病例研究提出，胰腺癌的發生發展與慢性胰腺炎密切相關[4-5]，而血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具有介導血管生成的作用，可參與腫瘤轉移時新生血管的發生[6-7]。腫瘤細胞具有極強的增殖能力，這與腫瘤細胞的凋亡下調或功能紊亂有關，Beclin-1（BH3-only domain autophagy protein-1）是酵母自噬基因 Atg6/Vps30 的同源基因，Beclin-1 自噬基因的過表達可發揮一定的腫瘤抑制作用[8]。除此之外，microRNA（miR）是在轉錄水平上調控基因表達的非編碼單鏈 RNA，具有抑癌基因的作用，其中 miR-216a 與胰腺癌具有一定的相關性[9-10]。本研究回顧性收集了因胰腺疾病行手術治療的 40 例患者的切除組織標本，提取手術切除組織的基因，對比不同胰腺組織中 Beclin-1 和 miR-216a 基因表達是否存在差異；并對病變組織行細胞培養，探究 VEGF 的表達是否與磷酸化絲裂原活化蛋白激酶（phosphor-mitogen-activated protein kinase，p-MAPK）-細胞外調節蛋白激酶 1/2（ERK1/2）信號通路的活化有關，進而尋找有效的分子靶標以實現胰腺癌的早期篩查。
1 臨床資料
1.1 標本來源
回顧性收集 2012 年 1 月至 2017 年 4 月期間于湖北醫藥學院附屬東風醫院肝膽胰外科住院行手術治療的 40 例胰腺疾病患者的術中標本，標本經由 2 名病理科醫師診斷定性為：腺癌 8 例（腺癌組），鱗癌 8 例（鱗癌組），黏液性囊腺瘤 8 例（黏液性囊腺瘤組），慢性胰腺炎 8 例（慢性胰腺炎組）和正常胰腺組織 8 例（正常對照組，其中 3 例來源于胰腺漿液性囊腺瘤，3 例來源于胰腺假性囊腫，2 例來源于胰島素瘤）。正常組織取自疑似胰腺良性腫瘤需行手術治療的患者，術中切取微量腫物周圍組織（沿腫瘤邊緣以遠 2 cm 切除腫瘤，并經術中快速冰凍病理學檢查證實切緣陰性，取剩余正常胰腺組織鄰近切緣處少許組織）。手術取材后立即轉入–80 ℃ 冰箱保存并盡快行原代細胞培養和基因檢測。40 例患者中，男 24 例，女 16 例；年齡 43～76 歲，中位年齡為 58.4 歲。以上患者均簽署知情同意書，且術前均未行化療、放療和免疫治療。
1.2 主要儀器和試劑
主要儀器：icycler 熒光定量 PCR 儀、i-mark 酶標儀、DDY-10 型三恒電泳儀、半干轉槽和 GelDocEZ 全自動凝膠圖象分析儀均購自美國 BIO-RAD 公司，Leica 光學顯微鏡購自德國 Leica Microsystems Ltd 公司，3111 型 CO2 孵箱和 FRESCO 17 冷凍離心機均購自美國 Thermo 公司，芯片生物掃描儀（2 100 B ioanalyzer）購自安捷倫科技（中國）有限公司。
主要試劑：Trizol 試劑和引物（β-actin 引物：前體鏈 5′-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3′，互補鏈 5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′；Beclin-1 引物：前體鏈 5′-GAACTCACAGCTCCATTACT-3′，互補鏈 5′-GTTTCAATAAATGGCTCCT-3′，引物長度為 25 bp）均購自寶生物工程（大連）有限公司，DAB 顯色試劑盒和 β-actin 小鼠抗人多克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術公司，胎牛血清購自美國 Gibco 公司，RPMI 1640 和無血清 RPMI 1640 培養基購于美國 Hyclone 公司，PD98095 購自美國 Sigma 公司。Anti-Beclin-1 兔抗人單克隆抗體購自美國 Epitomics 公司，miRNA 寡核苷酸基因芯片（p/n5190-0456）購自安捷倫科技（中國）有限公司，彩色預染蛋白質 Marker 購自賽默飛世爾科技有限公司，PD98095 Promega（V1191，ECL）購自美國 Bio-RAD 公司，二抗山羊抗鼠免疫球蛋白 G（IgG）/辣根過氧化物酶（HRP）、VEGF 一抗和磷酸化細胞外信號調節激酶 1/2（p-ERK1/2 ）一抗均購自美國 AbCam 公司。
1.3 實時熒光定量 PCR 法檢測 Beclin-1 mRNA 的表達
采用 Trizol 法提取 5 組組織的總 RNA，依據逆轉錄試劑盒和 PCR 試劑盒說明（反應條件：94 ℃、20 s 預變性，1 個循環；55 ℃、30 s 變性，60 ℃、40 s 退火延伸，45 個循環。總體系為 30 μL）操作并進行 PCR 擴增。5 組組織中 Beclin-1 mRNA 的表達水平通過 β-actin 校正以減少誤差。通過計算 Beclin-1 mRNA 的 ΔCt 值以計算 Beclin-1 mRNA 的表達水平，比較 5 組組織中 Beclin-1 mRNA 的表達。
1.4 基因芯片檢測 miR-216a 的表達
以 Trizol 法提取 5 組組織的總 RNA，37 ℃ 孵育 30 min 去磷酸化后熱變性，連接雜交后分別加入到 miR-216a 寡核苷酸基因芯片（型號為 v 12.0）中，操作步驟依據試劑盒說明進行。通過 2100 Bioanalyzer 掃描以檢測 5 組組織中 miR-216a 的表達。每個樣本重復測量 3 次，取平均值。
1.5 VEGF 蛋白的表達與 p-MAPK-ERK1/2 信號通路活化的相關性
1.5.1 原代細胞培養
將術中取到的病變組織剪碎并研磨細碎，加入適量含 10% 滅活胎牛血清的 RPMI1640 培養基與細碎組織混勻。移入細胞培養瓶后放入 37 ℃、5% CO2 培養箱中培養，適時更換培養基并搜集對數期細胞。細胞計數為 1×105個/mL后接種于 6 孔細胞培養板內（5 組標本，每組各培養 6 孔），并加入含 10%滅活胎牛血清的 RPMI1640 培養基培養。5 組培養的細胞中任選 3 孔（其余3 孔作為相應組織的空白對照組）加入 20 μL 的p-MAPK-ERK1/2 通路抑制劑 PD98095 刺激 48 h，進行相應蛋白的檢測。每個復孔檢測 3 次，以均值作為該復孔的檢測結果。
1.5.2 Western blot 法檢測 VEGF 和 p-ERK1/2 蛋白的表達
收集上述 5 組培養的細胞，用 PBS 緩沖液清洗后加入放射免疫沉淀分析（radio immunoprecipitation assay，RIPA）細胞裂解液，裂解完全后采用高速冷凍離心法提取總蛋白，并通過 BCA 蛋白檢測試劑盒為所提取的蛋白定量。采用 Western blot 法檢測 VEGF 和 p-ERK 1/2 蛋白的表達，以 β-actin 作為內參。每孔以 40 μg 可溶性蛋白含量加樣到 8% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）中，電泳后電轉至硝酸纖維素膜（PVDF）上，取封閉液室溫封閉 1 h，漂洗 3 次后，分別加入 VEGF 一抗（1∶1 000）和 p-ERK1/2 一抗（1∶1 500）， 4 ℃冰箱過夜；以 TBST 清洗液洗 3 遍，將 PVDF 膜放入二抗 IgG/HRP 中，室溫下輕搖孵育 2 h。洗膜3 次后在膜中央均勻滴加 DAB 顯色劑曝光，迅速轉移至成像分析儀中顯影成像。計算目的條帶與內參 β-actin 條帶灰度值的比值，計算結果即為目的蛋白的相對表達量。每個復孔檢測 3 次，以均值作為該復孔的檢測結果。
1.6 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件進行分析。每個樣本的結果為 3 次獨立實驗的均值。5 組間 Beclin-1 mRNA 和 miR-216a 的表達水平比較采用方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；5 類細胞 PD98095 組和空白對照組的 p-ERK1/2 和 VEGF 蛋白的表達水平比較采用成組 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 5 組組織中 Beclin-1 mRNA 的表達水平
PCR 基因檢測結果顯示，與正常對照組比較，腺癌組和鱗癌組組織中 Beclin-1 mRNA 的表達水平較低，差異有統計學意義（P<0.05），但黏液性囊腺瘤組和慢性胰腺炎組組織中 Beclin-1 mRNA 的表達水平與正常對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05）；腺癌組、鱗癌組、黏液性囊腺瘤組和慢性胰腺炎組組織中 Beclin-1 mRNA 的表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）。具體見表 1。
表1
5 組組織中 Beclin-1 mRNA 和 miR-216a 的表達（
）
2.2 5 組組織中 miR-216a 的表達水平
基因芯片法檢測結果顯示，與正常對照組比較，腺癌組和鱗癌組組織中 miR-216a 的表達水平較低，差異有統計學意義（P<0.05），但黏液性囊腺瘤組和慢性胰腺炎組組織中 miR-216a 的表達水平與正常對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05）；腺癌組、鱗癌組、黏液性囊腺瘤組和慢性胰腺炎組組織中 miR-216a 的表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）。具體見表 1。
2.3 5 組細胞中 p-ERK1/2 和 VEGF 蛋白的表達
2.3.1 PD98095 刺激后 5 組細胞中 p-ERK1/2 蛋白的表達
實驗結果顯示，腺癌組和鱗癌組中，未加入 PD98095 時細胞中 p-ERK1/2 細胞信號傳導通路明顯激活，PD98095 刺激后p-ERK1/2 蛋白的表達明顯下調；黏液性囊腺瘤組和慢性胰腺炎組未加入 PD98095 處理時 p-ERK1/2 細胞信號傳導通路輕度激活，而 PD98095 刺激后 p-ERK1/2 蛋白的表達稍有下調。正常對照組幾乎無變化。具體見圖 1。
與同類組織的空白對照組比較，腺癌組和鱗癌組加入 PD98095 后，細胞中 p-ERK1/2 蛋白的表達水平下調（P<0.05），但黏液性囊腺瘤組、慢性胰腺炎組和正常對照組加入 PD98095 前后細胞中p-ERK1/2 蛋白的表達水平變化不大，差異無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 2a。
圖1
示 5 種細胞中 p-ERK1/2 蛋白表達的電泳圖
①：空白對照組，②：PD98095 組
圖2
示 5 種細胞中 p-ERK1/2 蛋白和 VEGF 蛋白的表達水平
a：p-ERK1/2 蛋白；b：VEGF 蛋白；①：腺癌；②：鱗癌；③：黏液性囊腺瘤；④：慢性胰腺炎；⑤：正常胰腺；與同類型細胞的空白對照組比較，*
2.3.2 PD98095 刺激后 5 組細胞中 VEGF 蛋白的表達
實驗結果顯示，腺癌組和鱗癌組中，未加入 PD98095 時細胞中 VEGF 蛋白表達明顯，PD98095 刺激后 VEGF 蛋白的表達明顯下調；黏液性囊腺瘤組和慢性胰腺炎組未加入 PD98095 處理時 VEGF 蛋白表達也較明顯，而 PD98095 刺激后 VEGF 蛋白的表達輕微下降。正常對照組幾乎無變化。
與同類組織的空白對照組比較，腺癌組和鱗癌組加入 PD98095 后，細胞中 VEGF 蛋白的表達下調（P<0.05），但黏液性囊腺瘤組、慢性胰腺炎組和正常對照組加入 PD98095 前后細胞中 p-MAPK-ERK1/2 蛋白的表達水平變化不大，差異無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 2b。
3 討論
胰腺癌作為病死率較高的腫瘤，其發病機制尚不明確，發生發展過程復雜，早期診治困難，術后患者的 5 年生存率在 5%以下[11]。而目前檢測胰腺癌的相關指標和基因過于單一，對于多基因調控的胰腺癌來說過于片面[12]。因此，探索多基因和轉錄后蛋白質的表達變化與胰腺癌之間的關系，對其發病機制的研究尤為重要。
Beclin-1 mRNA 作為自噬誘導基因，可發揮抗腫瘤的作用，Beclin-1 mRNA 參與人類皮膚黑素細胞癌的發生與發展過程，在腫瘤生存的不同階段其表達水平存在差異[13]。本研究通過對比 Beclin-1 mRNA 在胰腺癌、胰腺良性腫瘤和慢性胰腺炎組織中的表達，發現與正常胰腺組織相比，胰腺癌（腺癌和鱗癌）組織中 Beclin-1 mRNA 的表達水平明顯下調，而在胰腺良性腫瘤和慢性胰腺炎中下調不明顯。因此筆者認為，Beclin-1 mRNA 與胰腺癌的發生和發展有一定相關性，這與 Beclin-1 mRNA 誘導腫瘤細胞的自噬有關。
Szafranska 等[14]發現，胰腺組織以 miR-216a 等的表達為特征，在胰腺炎患者血清中明顯升高，其特異性較血淀粉酶和脂肪酶更高，是急性胰腺炎的特異分子標志物。Kong 等[15]發現，miR-216a 在胰腺炎組織中的表達與正常胰腺組織的表達相近，而在胰腺癌組織中 miR-216a 的表達明顯低于正常組織[16]。本研究通過基因芯片技術發現，較正常胰腺組織相比，胰腺癌組織（腺癌和鱗癌）中 miR-216a 的表達水平明顯下調，而在胰腺良性腫瘤和慢性胰腺炎中下調不明顯。因此筆者認為，miR-216a 與胰腺癌的發生發展有一定相關性，這與 miR-216a 可發揮抑癌基因的作用有關。
VEGF 蛋白的過表達是介導腫瘤新生血管大量形成的主要原因，在胰腺癌的發展中起重要作用，是造成腫瘤轉移和血管泛化的原因之一[17]。本研究通過對比加入 p-ERK1/2 通路特異性抑制劑 PD98095 后的胰腺癌細胞與未加入抑制劑的胰腺癌細胞中 VEGF 和 p-ERK1/2 蛋白的表達，發現加入 PD98095 的胰腺癌細胞中 VEGF 蛋白的表達明顯下調，提示 VEGF 蛋白通過 p-ERK1/2 通路高表達，這可能與胰腺癌的發展有一定相關性。而加入p-ERK1/2 通路特異性抑制劑 PD98095 后的胰腺良性腫瘤和慢性胰腺炎細胞與未加入抑制劑的同類細胞相比，VEGF 和 p-ERK1/2 蛋白的表達僅出現輕微下調。因此，筆者認為，胰腺癌細胞內 VEGF 蛋白的高表達與 p-ERK1/2 通路的激活存在相關性。
鑒于本研究納入的樣本量較少，且研究的相關基因和細胞信號通路也比較有限，還不能提出如何能早期診斷胰腺癌，以及如何抑制胰腺癌進展的有效方案，故仍需進一步研究。在未來的研究中，我們將納入更多的病例，期待從分子機制入手，在闡明胰腺癌發病機制的同時為胰腺癌提供可靠的診療方案。
胰腺癌因早期診斷困難和惡性程度高，多數患者確診時已處進展期或晚期[1-2]，故手術切除的療效和預后差，死亡率居高不下[3]，因此探究胰腺癌的發生與發展機制意義重大。近年來諸多循證醫學和病例研究提出，胰腺癌的發生發展與慢性胰腺炎密切相關[4-5]，而血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具有介導血管生成的作用，可參與腫瘤轉移時新生血管的發生[6-7]。腫瘤細胞具有極強的增殖能力，這與腫瘤細胞的凋亡下調或功能紊亂有關，Beclin-1（BH3-only domain autophagy protein-1）是酵母自噬基因 Atg6/Vps30 的同源基因，Beclin-1 自噬基因的過表達可發揮一定的腫瘤抑制作用[8]。除此之外，microRNA（miR）是在轉錄水平上調控基因表達的非編碼單鏈 RNA，具有抑癌基因的作用，其中 miR-216a 與胰腺癌具有一定的相關性[9-10]。本研究回顧性收集了因胰腺疾病行手術治療的 40 例患者的切除組織標本，提取手術切除組織的基因，對比不同胰腺組織中 Beclin-1 和 miR-216a 基因表達是否存在差異；并對病變組織行細胞培養，探究 VEGF 的表達是否與磷酸化絲裂原活化蛋白激酶（phosphor-mitogen-activated protein kinase，p-MAPK）-細胞外調節蛋白激酶 1/2（ERK1/2）信號通路的活化有關，進而尋找有效的分子靶標以實現胰腺癌的早期篩查。
1 臨床資料
1.1 標本來源
回顧性收集 2012 年 1 月至 2017 年 4 月期間于湖北醫藥學院附屬東風醫院肝膽胰外科住院行手術治療的 40 例胰腺疾病患者的術中標本，標本經由 2 名病理科醫師診斷定性為：腺癌 8 例（腺癌組），鱗癌 8 例（鱗癌組），黏液性囊腺瘤 8 例（黏液性囊腺瘤組），慢性胰腺炎 8 例（慢性胰腺炎組）和正常胰腺組織 8 例（正常對照組，其中 3 例來源于胰腺漿液性囊腺瘤，3 例來源于胰腺假性囊腫，2 例來源于胰島素瘤）。正常組織取自疑似胰腺良性腫瘤需行手術治療的患者，術中切取微量腫物周圍組織（沿腫瘤邊緣以遠 2 cm 切除腫瘤，并經術中快速冰凍病理學檢查證實切緣陰性，取剩余正常胰腺組織鄰近切緣處少許組織）。手術取材后立即轉入–80 ℃ 冰箱保存并盡快行原代細胞培養和基因檢測。40 例患者中，男 24 例，女 16 例；年齡 43～76 歲，中位年齡為 58.4 歲。以上患者均簽署知情同意書，且術前均未行化療、放療和免疫治療。
1.2 主要儀器和試劑
主要儀器：icycler 熒光定量 PCR 儀、i-mark 酶標儀、DDY-10 型三恒電泳儀、半干轉槽和 GelDocEZ 全自動凝膠圖象分析儀均購自美國 BIO-RAD 公司，Leica 光學顯微鏡購自德國 Leica Microsystems Ltd 公司，3111 型 CO2 孵箱和 FRESCO 17 冷凍離心機均購自美國 Thermo 公司，芯片生物掃描儀（2 100 B ioanalyzer）購自安捷倫科技（中國）有限公司。
主要試劑：Trizol 試劑和引物（β-actin 引物：前體鏈 5′-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3′，互補鏈 5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′；Beclin-1 引物：前體鏈 5′-GAACTCACAGCTCCATTACT-3′，互補鏈 5′-GTTTCAATAAATGGCTCCT-3′，引物長度為 25 bp）均購自寶生物工程（大連）有限公司，DAB 顯色試劑盒和 β-actin 小鼠抗人多克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術公司，胎牛血清購自美國 Gibco 公司，RPMI 1640 和無血清 RPMI 1640 培養基購于美國 Hyclone 公司，PD98095 購自美國 Sigma 公司。Anti-Beclin-1 兔抗人單克隆抗體購自美國 Epitomics 公司，miRNA 寡核苷酸基因芯片（p/n5190-0456）購自安捷倫科技（中國）有限公司，彩色預染蛋白質 Marker 購自賽默飛世爾科技有限公司，PD98095 Promega（V1191，ECL）購自美國 Bio-RAD 公司，二抗山羊抗鼠免疫球蛋白 G（IgG）/辣根過氧化物酶（HRP）、VEGF 一抗和磷酸化細胞外信號調節激酶 1/2（p-ERK1/2 ）一抗均購自美國 AbCam 公司。
1.3 實時熒光定量 PCR 法檢測 Beclin-1 mRNA 的表達
采用 Trizol 法提取 5 組組織的總 RNA，依據逆轉錄試劑盒和 PCR 試劑盒說明（反應條件：94 ℃、20 s 預變性，1 個循環；55 ℃、30 s 變性，60 ℃、40 s 退火延伸，45 個循環。總體系為 30 μL）操作并進行 PCR 擴增。5 組組織中 Beclin-1 mRNA 的表達水平通過 β-actin 校正以減少誤差。通過計算 Beclin-1 mRNA 的 ΔCt 值以計算 Beclin-1 mRNA 的表達水平，比較 5 組組織中 Beclin-1 mRNA 的表達。
1.4 基因芯片檢測 miR-216a 的表達
以 Trizol 法提取 5 組組織的總 RNA，37 ℃ 孵育 30 min 去磷酸化后熱變性，連接雜交后分別加入到 miR-216a 寡核苷酸基因芯片（型號為 v 12.0）中，操作步驟依據試劑盒說明進行。通過 2100 Bioanalyzer 掃描以檢測 5 組組織中 miR-216a 的表達。每個樣本重復測量 3 次，取平均值。
1.5 VEGF 蛋白的表達與 p-MAPK-ERK1/2 信號通路活化的相關性
1.5.1 原代細胞培養
將術中取到的病變組織剪碎并研磨細碎，加入適量含 10% 滅活胎牛血清的 RPMI1640 培養基與細碎組織混勻。移入細胞培養瓶后放入 37 ℃、5% CO2 培養箱中培養，適時更換培養基并搜集對數期細胞。細胞計數為 1×105個/mL后接種于 6 孔細胞培養板內（5 組標本，每組各培養 6 孔），并加入含 10%滅活胎牛血清的 RPMI1640 培養基培養。5 組培養的細胞中任選 3 孔（其余3 孔作為相應組織的空白對照組）加入 20 μL 的p-MAPK-ERK1/2 通路抑制劑 PD98095 刺激 48 h，進行相應蛋白的檢測。每個復孔檢測 3 次，以均值作為該復孔的檢測結果。
1.5.2 Western blot 法檢測 VEGF 和 p-ERK1/2 蛋白的表達
收集上述 5 組培養的細胞，用 PBS 緩沖液清洗后加入放射免疫沉淀分析（radio immunoprecipitation assay，RIPA）細胞裂解液，裂解完全后采用高速冷凍離心法提取總蛋白，并通過 BCA 蛋白檢測試劑盒為所提取的蛋白定量。采用 Western blot 法檢測 VEGF 和 p-ERK 1/2 蛋白的表達，以 β-actin 作為內參。每孔以 40 μg 可溶性蛋白含量加樣到 8% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）中，電泳后電轉至硝酸纖維素膜（PVDF）上，取封閉液室溫封閉 1 h，漂洗 3 次后，分別加入 VEGF 一抗（1∶1 000）和 p-ERK1/2 一抗（1∶1 500）， 4 ℃冰箱過夜；以 TBST 清洗液洗 3 遍，將 PVDF 膜放入二抗 IgG/HRP 中，室溫下輕搖孵育 2 h。洗膜3 次后在膜中央均勻滴加 DAB 顯色劑曝光，迅速轉移至成像分析儀中顯影成像。計算目的條帶與內參 β-actin 條帶灰度值的比值，計算結果即為目的蛋白的相對表達量。每個復孔檢測 3 次，以均值作為該復孔的檢測結果。
1.6 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件進行分析。每個樣本的結果為 3 次獨立實驗的均值。5 組間 Beclin-1 mRNA 和 miR-216a 的表達水平比較采用方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；5 類細胞 PD98095 組和空白對照組的 p-ERK1/2 和 VEGF 蛋白的表達水平比較采用成組 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 5 組組織中 Beclin-1 mRNA 的表達水平
PCR 基因檢測結果顯示，與正常對照組比較，腺癌組和鱗癌組組織中 Beclin-1 mRNA 的表達水平較低，差異有統計學意義（P<0.05），但黏液性囊腺瘤組和慢性胰腺炎組組織中 Beclin-1 mRNA 的表達水平與正常對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05）；腺癌組、鱗癌組、黏液性囊腺瘤組和慢性胰腺炎組組織中 Beclin-1 mRNA 的表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）。具體見表 1。
表1
5 組組織中 Beclin-1 mRNA 和 miR-216a 的表達（
）
2.2 5 組組織中 miR-216a 的表達水平
基因芯片法檢測結果顯示，與正常對照組比較，腺癌組和鱗癌組組織中 miR-216a 的表達水平較低，差異有統計學意義（P<0.05），但黏液性囊腺瘤組和慢性胰腺炎組組織中 miR-216a 的表達水平與正常對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05）；腺癌組、鱗癌組、黏液性囊腺瘤組和慢性胰腺炎組組織中 miR-216a 的表達水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）。具體見表 1。
2.3 5 組細胞中 p-ERK1/2 和 VEGF 蛋白的表達
2.3.1 PD98095 刺激后 5 組細胞中 p-ERK1/2 蛋白的表達
實驗結果顯示，腺癌組和鱗癌組中，未加入 PD98095 時細胞中 p-ERK1/2 細胞信號傳導通路明顯激活，PD98095 刺激后p-ERK1/2 蛋白的表達明顯下調；黏液性囊腺瘤組和慢性胰腺炎組未加入 PD98095 處理時 p-ERK1/2 細胞信號傳導通路輕度激活，而 PD98095 刺激后 p-ERK1/2 蛋白的表達稍有下調。正常對照組幾乎無變化。具體見圖 1。
與同類組織的空白對照組比較，腺癌組和鱗癌組加入 PD98095 后，細胞中 p-ERK1/2 蛋白的表達水平下調（P<0.05），但黏液性囊腺瘤組、慢性胰腺炎組和正常對照組加入 PD98095 前后細胞中p-ERK1/2 蛋白的表達水平變化不大，差異無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 2a。
圖1
示 5 種細胞中 p-ERK1/2 蛋白表達的電泳圖
①：空白對照組，②：PD98095 組
圖2
示 5 種細胞中 p-ERK1/2 蛋白和 VEGF 蛋白的表達水平
a：p-ERK1/2 蛋白；b：VEGF 蛋白；①：腺癌；②：鱗癌；③：黏液性囊腺瘤；④：慢性胰腺炎；⑤：正常胰腺；與同類型細胞的空白對照組比較，*
2.3.2 PD98095 刺激后 5 組細胞中 VEGF 蛋白的表達
實驗結果顯示，腺癌組和鱗癌組中，未加入 PD98095 時細胞中 VEGF 蛋白表達明顯，PD98095 刺激后 VEGF 蛋白的表達明顯下調；黏液性囊腺瘤組和慢性胰腺炎組未加入 PD98095 處理時 VEGF 蛋白表達也較明顯，而 PD98095 刺激后 VEGF 蛋白的表達輕微下降。正常對照組幾乎無變化。
與同類組織的空白對照組比較，腺癌組和鱗癌組加入 PD98095 后，細胞中 VEGF 蛋白的表達下調（P<0.05），但黏液性囊腺瘤組、慢性胰腺炎組和正常對照組加入 PD98095 前后細胞中 p-MAPK-ERK1/2 蛋白的表達水平變化不大，差異無統計學意義（P>0.05）。具體見圖 2b。
3 討論
胰腺癌作為病死率較高的腫瘤，其發病機制尚不明確，發生發展過程復雜，早期診治困難，術后患者的 5 年生存率在 5%以下[11]。而目前檢測胰腺癌的相關指標和基因過于單一，對于多基因調控的胰腺癌來說過于片面[12]。因此，探索多基因和轉錄后蛋白質的表達變化與胰腺癌之間的關系，對其發病機制的研究尤為重要。
Beclin-1 mRNA 作為自噬誘導基因，可發揮抗腫瘤的作用，Beclin-1 mRNA 參與人類皮膚黑素細胞癌的發生與發展過程，在腫瘤生存的不同階段其表達水平存在差異[13]。本研究通過對比 Beclin-1 mRNA 在胰腺癌、胰腺良性腫瘤和慢性胰腺炎組織中的表達，發現與正常胰腺組織相比，胰腺癌（腺癌和鱗癌）組織中 Beclin-1 mRNA 的表達水平明顯下調，而在胰腺良性腫瘤和慢性胰腺炎中下調不明顯。因此筆者認為，Beclin-1 mRNA 與胰腺癌的發生和發展有一定相關性，這與 Beclin-1 mRNA 誘導腫瘤細胞的自噬有關。
Szafranska 等[14]發現，胰腺組織以 miR-216a 等的表達為特征，在胰腺炎患者血清中明顯升高，其特異性較血淀粉酶和脂肪酶更高，是急性胰腺炎的特異分子標志物。Kong 等[15]發現，miR-216a 在胰腺炎組織中的表達與正常胰腺組織的表達相近，而在胰腺癌組織中 miR-216a 的表達明顯低于正常組織[16]。本研究通過基因芯片技術發現，較正常胰腺組織相比，胰腺癌組織（腺癌和鱗癌）中 miR-216a 的表達水平明顯下調，而在胰腺良性腫瘤和慢性胰腺炎中下調不明顯。因此筆者認為，miR-216a 與胰腺癌的發生發展有一定相關性，這與 miR-216a 可發揮抑癌基因的作用有關。
VEGF 蛋白的過表達是介導腫瘤新生血管大量形成的主要原因，在胰腺癌的發展中起重要作用，是造成腫瘤轉移和血管泛化的原因之一[17]。本研究通過對比加入 p-ERK1/2 通路特異性抑制劑 PD98095 后的胰腺癌細胞與未加入抑制劑的胰腺癌細胞中 VEGF 和 p-ERK1/2 蛋白的表達，發現加入 PD98095 的胰腺癌細胞中 VEGF 蛋白的表達明顯下調，提示 VEGF 蛋白通過 p-ERK1/2 通路高表達，這可能與胰腺癌的發展有一定相關性。而加入p-ERK1/2 通路特異性抑制劑 PD98095 后的胰腺良性腫瘤和慢性胰腺炎細胞與未加入抑制劑的同類細胞相比，VEGF 和 p-ERK1/2 蛋白的表達僅出現輕微下調。因此，筆者認為，胰腺癌細胞內 VEGF 蛋白的高表達與 p-ERK1/2 通路的激活存在相關性。
鑒于本研究納入的樣本量較少，且研究的相關基因和細胞信號通路也比較有限，還不能提出如何能早期診斷胰腺癌，以及如何抑制胰腺癌進展的有效方案，故仍需進一步研究。在未來的研究中，我們將納入更多的病例，期待從分子機制入手，在闡明胰腺癌發病機制的同時為胰腺癌提供可靠的診療方案。
