引用本文： 李方平, 溫劍, 胡迎春, 歐志兵, 朱榮濤, 龔建平. Kupffer 細胞通過 Toll 樣受體 4 信號通路調控組織因子及組織因子相關微粒表達誘導急性胰腺炎的發生. 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(7): 784-791. doi: 10.7507/1007-9424.201712084 復制
急性胰腺炎是臨床最常見的急腹癥之一，隨著人民生活水平的提高，急性胰腺炎的發病率有逐年上升的趨勢[1]。近年來的研究[2]發現，組織因子（tissue factor，TF）作為凝血機制的啟動因子之一，在急性胰腺炎的發生和發展過程中起著極其重要的作用，而 TF 的載體主要由單核細胞、血管內皮細胞、血小板等血液細胞在受到激活后通過胞吐所釋放的組織因子相關微粒所構成。有研究[3]顯示，單核細胞在受到內毒素刺激時能表達和釋放出含 TF 膜微粒（ tissue factor-bearing microparticle，TF-MP）。枯否細胞（Kupffer cells，KCs）作為生命體內比例最大的單核-巨噬細胞群，除具有巨噬細胞的一般特征外，在炎癥細胞中既有代表性又有其特殊性[4]，但其是否參與了急性胰腺炎的調控還不得而知。本研究利用小鼠急性胰腺炎模型，探討 KCs 在受到脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激時能否釋放出TF-MP，判斷阻斷 Toll 樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）通路能否對 KCs 表達 TF 產生調控，闡明 KCs 在急性胰腺發生和發展中的作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與材料
1.1.1 實驗動物
野生型 C57/BL6 小鼠（WT 小鼠）和 TLR4-/-小鼠各 35 只，體質量 20～25 g/只，SPF 級，其中 TLR4-/-小鼠由重慶醫科大學檢驗醫學院饋贈，按照倫理學標準進行動物實驗。
1.1.2 主要材料
小鼠 TF-ELISA 試劑盒（武漢優爾生生命科學裝備有限公司），Ⅳ型膠原酶（Sigma公司），RNA 提取試劑盒（北京百泰克公司），TLR4 單克隆抗體和 TF 單克隆抗體（Abcam公司），CD142 PE、Annexin Ⅴ/FITC 凋亡檢測試劑盒和PE control Isok IgG1（Ebioscience公司）。
1.2 急性胰腺炎模型建立及標本采集
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠，采用腹腔注射雨蛙素（50 μg/kg），連續 6 次，每次間隔 1 h，然后立即腹腔注射 LPS 10 mg/kg 建立急性胰腺炎模型。于建模后 6、12、24 h 獲取小鼠的肝臟和胰腺組織樣本，每個時間點各處死 5 只小鼠，一部分肝臟和胰腺組織用 4% 多聚甲醛固定后行 HE 染色及免疫組織化學染色；然后從剩余的肝臟組織中分離出 KCs[5]，分別用 Western blot 和 real-time PCR 法檢測 KCs 中 TF 和 TLR4 蛋白及 mRNA 表達量。剩余 10 只 WT 小鼠和 10 只 TLR4-/-小鼠用于觀察生存情況。每 6 h 觀察并記錄一次小鼠的存活狀況，共觀察 72 h。
1.3 HE 染色觀察胰腺損傷情況
組織標本送病理教研室進行石蠟包埋、切片后，將已入蒸餾水的切片放入蘇木精水溶液中染色 1 min；酸水及氨水中分色，3～5 s；流水沖洗1 h 后入蒸餾水片刻；入 70% 和 90% 乙醇中脫水各 10 min；入乙醇伊紅染色 2～3 min。染色后經無水乙醇脫水，二甲苯使切片透明，最后樹脂封片，光鏡下觀察。
1.4 免疫組織化學方法檢測肝臟及胰腺組織中 TF 蛋白表達
石蠟切片，正常山羊血清封閉，室溫 20 min，滴加純化抗小鼠 TF 單克隆抗體（工作濃度為 1∶100），濕盒中 4 ℃ 過夜。滴加辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗兔 IgG 二抗（1∶200），37 ℃ 孵育 30 min。二氨基聯苯胺（DAB）顯色 30 min。蘇木精復染，樹脂封片，鏡下觀察，細胞核呈紫藍色，陽性產物呈棕黃色或黃色顆粒。實驗結果經過 Image pro plus 6.0 分析。
1.5 從動物實驗角度觀察 KCs 中 TLR4 和 TF 表達
1.5.1 Western blot 方法檢測小鼠 KCs 中 TF 和 TLR4 蛋白表達
提取 KCs 蛋白并測定蛋白濃度，按等質量原則進行上樣，依次完成電泳和轉膜；PVDF 膜在 37 ℃ 下 5% 脫脂奶粉封閉 1 h；分別放入含對應一抗的孵育盒中 4 ℃ 過夜。第 2 天回收一抗后，TBST 搖洗 10 min×3；再放入與一抗對應的二抗孵育盒中于 37 ℃ 下孵育 1 h；TBST 搖洗10 min×3；最后曝光；Quantity One 4.0 測定各組條帶的灰度值。
1.5.2 real-time PCR 方法檢測 KCs 中 TF 和 TLR4 mRNA 表達
嚴格按試劑盒方法提取并測定各樣本總 RNA，逆轉錄：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 冷卻，–20 ℃ 保存。SYBR? Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒檢測 RNA 逆轉錄的表達。所需基因引物均由上海生工合成，具體序列如下：TF 上游引物為 5′-CAACCCAAACCCACCAACT-3′，下游引物為 5′-CCAGGTCACATCCTTCACG-3′，擴增片段長度為 124 bp；TLR4 上游引物為 5′-GGCATCATCTTCATTGTCCTT-3′，下游引物為 5′-TGTCCTCCCATTCCAGGTAG-3′，擴增片段長度為 660 bp；β-actin 上游引物為 5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物為 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，擴增片段長度為 183 bp。采用兩步法進行擴增：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，40 次循環。采用 2 –△△Ct法分析目的基因的表達差異，ΔΔCt=（Ct 目的基因–Ct 管家基因）實驗組–（Ct 目的基因–Ct 管家基因） 對照組。
1.6 從細胞角度觀察 TLR4 和 TF 表達
分離提取 WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠 KCs，按照（3～4）×106個/cm2密度接種到 6 孔板，給予大劑量（300 μg/L）的 LPS 刺激，然后分別于 0、15、30、60 及 120 min 時收集細胞和上清液備檢。
1.6.1 檢測 KCs 胞質中 TLR4 和 TF 蛋白和 mRNA 表達量
檢測方法同 1.5。
1.6.2 ELISA 法檢測小鼠 KCs 上清液中 TF 水平
根據 TF-ELISA 試劑盒操作說明對 KCs 上清液中 TF 水平進行測定，每組至少重復 3 次。
1.6.3 流式細胞儀檢測小鼠 KCs 上清液中 TF-MP 水平
按照上述方法處理細胞后收集對應時間點的上清液。分別取每組上清液 100 μL 加入 1.5 mL EP 管中，向其加入 392 μL 無菌 PBS，再依次加入4 μL 的 Annexin Ⅴ/FITC 及 4 μL CD142 PE，使其混勻后冰盒上避光孵育 30 min。孵育完畢，混勻 EP 管內液體后流式細胞儀檢測并計數。流式細胞儀分析所得數據，當 P2 門集滿 10 000 個標準 6 pm 計數顆粒后停止計數測量。將發生在 P1 門并且 FITC 顯示陽性的事件稱為 MP，MP 同時又包括 PE 事件稱為 TF-MP。
1.7 統計學方法
使用 SPSS 19.0 軟件對數據進行分析，計量數據以均數±標準差（
±s）表示，滿足方差齊性，組間比較用單因素方差分析，兩兩間比較用 LSD t 檢驗；若方差不齊，組間比較用秩和檢驗。2 組小鼠生存率用 log-rank 檢驗進行比較。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 HE 染色觀察胰腺損傷情況
對胰腺組織進行 HE 染色發現，6 h 和 12 h 時 WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠胰腺組織損傷情況變化不明顯，但到 24 h 時，WT 小鼠的胰腺可見大量凝固性壞死，組織結構較混亂，并可見大量炎性細胞浸潤，腺泡破裂、輪廓模糊，腺泡細胞核固縮、壞死，符合重癥急性胰腺炎的病理改變；TLR4-/-小鼠胰腺雖然也可見炎性細胞浸潤，但較 WT 小鼠病理損傷明顯減輕。見圖 1。
圖1
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠急性胰腺炎建模后 24 h 時的胰腺損傷情況（HE ×200）
a：WT 小鼠；b：TLR4-/-小鼠
2.2 WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠急性胰腺炎建模后肝臟和胰腺組織中 TF 蛋白表達結果
免疫組織化學方法檢測 WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠急性胰腺炎建模后肝臟和胰腺組織中 TF 蛋白表達情況見圖 2。建模后 6 h 和 12 h 時，WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠胰腺組織中 TF 表達量變化不明顯；到 24 h 時，WT 小鼠肝血竇中棕色沉著顆粒密度（0.34±0.01）明顯高于 TLR4-/-小鼠（0.28±0.01），二者比較差異有統計學意義（P<0.05）；WT 小鼠胰腺組織中棕色沉著顆粒密度（0.29±0.03）也明顯高于 TLR4-/-小鼠（0.23±0.01），二者比較差異有統計學意義（P<0.05）。
圖2
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠急性胰腺炎建模后 24 h 時肝臟和胰腺組織中 TF 蛋白表達情況（免疫組織化學 ×200）
a：WT 小鼠肝臟組織；b：TLR4-/-小鼠肝臟組織；c：WT 小鼠胰腺組織；d：TLR4-/-小鼠胰腺組織
2.3 急性胰腺炎建模后 WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠的生存情況
建模后發現，WT 小鼠于 12 h 開始出現死亡，24 h 達到高峰，平均存活率為 24%；TLR4-/-小鼠 48 h達死亡高峰，平均存活率為 48%，明顯優于 WT 小鼠（P=0.003 4），WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠的生存曲線見圖 3。結果提示，TLR4 敲除能減輕胰腺炎癥損傷程度，提高小鼠生存率。
圖3
急性胰腺炎模型建立后 WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠生存曲線比較
2.4 從動物實驗角度觀察 KCs 中 TF 和 TLR4 表達結果
2.4.1 KCs 中 TF 和 TLR4 蛋白表達
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠不同時間點時 KCs 中 TLR4 和 TF 蛋白表達的結果見圖 4。由圖 4 可見，WT 小鼠 KCs 中 TLR4 和 TF 蛋白表達均逐漸增強，在實驗觀察時間范圍內于 24 h 時達到峰值，明顯高于 6 h 和12 h 時的表達量（P<0.05）；TLR4-/-小鼠的 KCs 中 TLR4 蛋白表達量較低，而 TF 蛋白的表達量則逐漸增高，在實驗觀察時間范圍內也于 24 h 時達到峰值，也略高于 6 h 和 12 h 時的表達量。與 WT 小鼠相同時間點比較，TLR4-/-小鼠 KCs 中 TLR4 和 TF 蛋白表量達均明顯降低（P<0.05）。
圖4
Western blot 方法檢測 WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠不同時間點時 KCs 中 TLR4 和 TF 蛋白表達的結果
a：定性結果。b：TLR4 蛋白表達的半定量結果；c：TF 蛋白表達的半定量結果。與 TLR4-/-小鼠比較，*
2.4.2 KCs 中 TF 和 TLR4 mRNA 表達結果
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠不同時間點時 KCs 中 TLR4 和 TF mRNA 表達的半定量結果見圖 5。WT 小鼠不同時間點時 KCs 中 TLR4 和 TF mRNA 表達量隨時間變化逐漸增加，在觀察范圍內于 24 h 時達到峰值，明顯高于 6 h 和12 h 時的表達量（P<0.05）；TLR4-/-小鼠 KCs 中 TLR4 mRNA 表達量極少，其 TF mRNA 表達逐漸增強，在觀察范圍內也于 24 h 時達到峰值，略高于 6 h 和 12 h 時的表達量。與 WT 小鼠相同時間點比較，TLR4-/-小鼠 KCs 中 TLR4 和 TF mRNA 表達均明顯降低（P<0.05）。
圖5
real-time PCR 方法檢測 WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠不同時間點時 KCs 中 TLR4 和 TF mRNA 表達結果
a：TLR4 mRNA 表達；b：TF mRNA 表達。與 TLR4-/-小鼠比較，*
2.5 細胞實驗角度檢測 KCs 中 TF 和 TLR4 的表達和 TF-MP 的分泌結果
2.5.1 KCs 胞質中 TF 和 TLR4 蛋白表達
LPS 刺激 KCs 后，WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠不同時間點時 KCs 中 TLR4 和 TF 蛋白表達結果見圖 6。WT 小鼠 KCs 中 TLR4 和 TF 蛋白均隨時間變化表達逐漸增強，TLR4 蛋白表達量與前一時間點比較變化不明顯，但 TF 蛋白表達于 30 min 時升高明顯，明顯高于0 min 和 15 min 時的表達量（P<0.05），隨后一直呈持續高表達。與 WT 小鼠比較，TLR4-/-小鼠各時間點時的 TLR4 蛋白表達均明顯降低（P<0.05），TF 蛋白表達在 30 min、60 min 和 120 min 時明顯降低（P<0.05）。
圖6
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠細胞水平不同時間點時 KCs 中 TLR4 和 TF 蛋白表達結果
a：定性結果。b：TLR4 蛋白表達的半定量結果；c：TF 蛋白表達的半定量結果。與 TLR4-/-小鼠比較，*
2.5.2 KCs 中 TLR4 和 TF mRNA 表達
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠不同時間點時 KCs 中 TLR4 和 TF mRNA 表達的半定量結果見圖 7。從圖 7 中可以看到，WT 小鼠 KCs 中 TLR4 mRNA 表達量從 15 min 開始就明顯增加，并于 60 min 時達到最高水平，顯著高于 0 min 時的水平（P<0.05）；而 TLR4-/-小鼠各時相點時 KCs 中 TLR4 mRNA 表達量均較少（P>0.05）。WT 小鼠 KCs 中 TF mRNA 表達量逐漸增加，至 60 min 時達到峰值且顯著高于 0 min（P<0.001）、15 min（P<0.001）及 30 min（P<0.001），爾后開始下降且明顯高于 120 min（P=0.003）；而 TLR4-/-小鼠 KCs 中 TF mRNA 表達量相對穩定，隨時間變化其表達量無明顯變化（P>0.05）。與 WT 小鼠比較，TLR4-/-小鼠從 30 min 開始各時間點 TF mRNA 表達量均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。
圖7
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠細胞水平不同時間點時 KCs 中 TLR4 和 TF mRNA 表達結果
a：TLR4 mRNA 表達；b：TF mRNA表達。與 TLR4-/-小鼠比較，*
2.5.3 小鼠 KCs 上清液中 TF 水平
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠各時間點 KCs 上清液中的 TF 水平見圖 8。從圖 8 中可以看到，WT 小鼠 KCs 上清液中的 TF 水平逐漸升高，到 60 min 時開始顯著升高，在觀察范圍內于 120 min 時達到最高水平，且明顯高于 0 min、15 min 和 30 min 時的水平（均 P<0.05）；TLR4-/-小鼠 KCs 上清液中的 TF 水平也逐漸升高，也于 120 min 達到最高水平，但各時相間比較差異無統計學意義（P>0.05）。自 30 min 開始，WT 小鼠 KCs 上清液中的 TF 水平明顯高于 TLR4-/-小鼠（P<0.05）。
圖8
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠 KCs 上清液中不同時間點 TF 水平
與 TLR4-/-小鼠比較，*
2.5.4 小鼠 KCs 上清液中 TF-MP 水平
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠各時間點 KCs 上清液中 TF-MP 水平見圖 9。從圖 9 中可以看到，WT 小鼠 KCs 上清液中 TF-MP 水平逐漸升高，到 60 min 時開始顯著升高，在觀察范圍內于 120 min 達到最高水平，且明顯高于 0 min、15 min 和 30 min 時的水平（均 P<0.05）；TLR4-/-小鼠 KCs 上清液中 TF-MP 水平也逐漸升高，也于 120 min 時達峰值，但僅與0 min 時比較差異有統計學意義（P<0.05）。自 30 min 開始，WT 小鼠 KCs 上清液中 TF-MP 水平明顯高于 TLR4-/-小鼠（P<0.05）。
圖9
WT 和 TLR4-/-小鼠不同時相點 KCs 上清液中 TF-MP 水平
與 TLR4-/-小鼠比較，*
3 討論
急性胰腺炎是常見的急腹癥，并且有 15%～30% 的患者發展為重癥急性胰腺炎，其中胰腺微環境障礙就是重要的致病機制之一[6]。
TF 作為脂蛋白復合物，通過與因子 Ⅶ/Ⅶa 結合而啟動血液凝固級聯反應，參與各個器官的凝血機制。為探討 TF 是否對急性胰腺炎的發生、發展有所影響，我們利用野生型 C57/BL6 小鼠建立急性胰腺炎模型后，測定胰腺組織中 TF 表達情況，發現其在胰腺組織中表達量明顯升高，這與急性胰腺炎患者血清中 TF 的表達情況一致[7]，提示了 TF 可能參與了胰腺炎的調控。
在重癥急性胰腺炎中，監測 TF 的水平可作為早期的預后指標判斷肺衰竭的進展和監測肺功能不全的嚴重程度[8-10]，并且 TF 作為重癥急性胰腺炎嚴重程度指標優于 C 反應蛋白[11]。同時，TF 還被選作為其他疾病的潛在治療靶標[12-14]。
TF 是凝血途徑的重要啟動因子，不僅存在于各種組織和血管外膜表面，也存在于血液循環[15]，而參與胰腺炎的 TF 是由胰腺本身合成、分泌的還是由其他器官來源的不得而知。在炎癥因子作用下，血小板可攜帶 TF 參與凝血機制，但血小板本身卻不能夠合成 TF，TF 是如何轉運到血小板上的呢？有研究[3]發現，單核細能夠把 TF 傳遞到血小板上，血小板也能夠把 TF 傳遞到單核細胞上，血小板經過活化后能釋放包含 TF 的 MP 進入血漿， MP 能夠再次被單核細胞攝取，形成血小板和單核細胞之間的 TF-MP 循環，而循環中的單核細胞正是巨噬細胞。KCs 是位于肝臟的一種特別的巨噬細胞，除具有巨噬細胞的一般特征外，作為炎癥細胞時既有代表性又有特殊性。我們利用小鼠建立急性胰腺炎模型后，分離、培養 KCs 發現其中 TF 表達量明顯升高，但其又是如何作用于胰腺微環境的有待進一步研究。
有研究[16]發現，TF 主要以在微粒上表達的形式存在于循環中，這種微粒就是 TF-MP。TF-MP 在糖尿病和動脈粥樣硬化及包含急性胰腺炎在內的炎癥反應中顯著升高，被認為是一種重要的促凝循環微粒[17-19]。LPS 刺激 KCs 后發現上清液中 TF-MP 明顯增加，并且與 KCs 中 TF 表達量相一致。因此，我們推測，KCs 可能是通過 TF-MP 將 TF 轉運到胰腺，從而對胰腺微環境產生影響，加重胰腺炎的進展。
KCs 參與包含急性胰腺炎在內的炎癥及感染炎癥調控，主要依賴 TLR4 的激活[20-21]，所以 TLR4 可能是 KCs 的炎癥反應和 TF 表達啟動凝血途徑的共同通路[22]。本研究結果發現，TLR4 敲除后，小鼠 KCs 中 TF 表達量明顯下降，肝臟和胰腺組織的損傷有所減輕，生存率明顯升高；同時，與 WT 小鼠相比，LPS 刺激 KCs 后 TLR4-/-小鼠 KCs 中 TF 表達量減少，TF-MP 胞外分泌量下降。LPS 可能結合 TLR4而激活 TLR4 通路，促進 KCs 表達 TF，通過 TF-MP 而釋放 TF，從而促進炎癥反應和產生微循環障礙，加重胰腺損害，這與循環中 TF 引起肺損傷的機制相似[23]。這與其他關于抑制 TLR4 減輕急性胰腺炎的研究[24-25]結果相一致。
既往研究[26-27]認為，急性胰腺炎時，循環中凝血機制被激活，導致全身多器官功能障礙、血栓形成等并發癥。在本研究中發現，肝臟 KCs 在處理感染等刺激因素時，可釋放大量 TF 并可轉運作用于胰腺，影響胰腺的局部微環境，導致胰腺炎的發生和發展。當敲除 KCs 中的 TLR4 時，KCs 中 TF 的表達量下降，KCs 上清液中 TF-MP 含量減少，同時胰腺組織中 TF 表達量減少，胰腺炎癥損傷有所減輕。因此，KCs 可能通過 TLR4 信號通路調控 TF 及 TF-MP 表達而誘導急性胰腺炎的發生。本研究發現，KCs 分泌的 TF 對胰腺炎有調控作用，但對胰腺細胞的具體調控機制尚不明確，若能闡明 KCs 與胰腺細胞的相互作用機制，將為急性胰腺炎的治療提供新的思路。
急性胰腺炎是臨床最常見的急腹癥之一，隨著人民生活水平的提高，急性胰腺炎的發病率有逐年上升的趨勢[1]。近年來的研究[2]發現，組織因子（tissue factor，TF）作為凝血機制的啟動因子之一，在急性胰腺炎的發生和發展過程中起著極其重要的作用，而 TF 的載體主要由單核細胞、血管內皮細胞、血小板等血液細胞在受到激活后通過胞吐所釋放的組織因子相關微粒所構成。有研究[3]顯示，單核細胞在受到內毒素刺激時能表達和釋放出含 TF 膜微粒（ tissue factor-bearing microparticle，TF-MP）。枯否細胞（Kupffer cells，KCs）作為生命體內比例最大的單核-巨噬細胞群，除具有巨噬細胞的一般特征外，在炎癥細胞中既有代表性又有其特殊性[4]，但其是否參與了急性胰腺炎的調控還不得而知。本研究利用小鼠急性胰腺炎模型，探討 KCs 在受到脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激時能否釋放出TF-MP，判斷阻斷 Toll 樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）通路能否對 KCs 表達 TF 產生調控，闡明 KCs 在急性胰腺發生和發展中的作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與材料
1.1.1 實驗動物
野生型 C57/BL6 小鼠（WT 小鼠）和 TLR4-/-小鼠各 35 只，體質量 20～25 g/只，SPF 級，其中 TLR4-/-小鼠由重慶醫科大學檢驗醫學院饋贈，按照倫理學標準進行動物實驗。
1.1.2 主要材料
小鼠 TF-ELISA 試劑盒（武漢優爾生生命科學裝備有限公司），Ⅳ型膠原酶（Sigma公司），RNA 提取試劑盒（北京百泰克公司），TLR4 單克隆抗體和 TF 單克隆抗體（Abcam公司），CD142 PE、Annexin Ⅴ/FITC 凋亡檢測試劑盒和PE control Isok IgG1（Ebioscience公司）。
1.2 急性胰腺炎模型建立及標本采集
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠，采用腹腔注射雨蛙素（50 μg/kg），連續 6 次，每次間隔 1 h，然后立即腹腔注射 LPS 10 mg/kg 建立急性胰腺炎模型。于建模后 6、12、24 h 獲取小鼠的肝臟和胰腺組織樣本，每個時間點各處死 5 只小鼠，一部分肝臟和胰腺組織用 4% 多聚甲醛固定后行 HE 染色及免疫組織化學染色；然后從剩余的肝臟組織中分離出 KCs[5]，分別用 Western blot 和 real-time PCR 法檢測 KCs 中 TF 和 TLR4 蛋白及 mRNA 表達量。剩余 10 只 WT 小鼠和 10 只 TLR4-/-小鼠用于觀察生存情況。每 6 h 觀察并記錄一次小鼠的存活狀況，共觀察 72 h。
1.3 HE 染色觀察胰腺損傷情況
組織標本送病理教研室進行石蠟包埋、切片后，將已入蒸餾水的切片放入蘇木精水溶液中染色 1 min；酸水及氨水中分色，3～5 s；流水沖洗1 h 后入蒸餾水片刻；入 70% 和 90% 乙醇中脫水各 10 min；入乙醇伊紅染色 2～3 min。染色后經無水乙醇脫水，二甲苯使切片透明，最后樹脂封片，光鏡下觀察。
1.4 免疫組織化學方法檢測肝臟及胰腺組織中 TF 蛋白表達
石蠟切片，正常山羊血清封閉，室溫 20 min，滴加純化抗小鼠 TF 單克隆抗體（工作濃度為 1∶100），濕盒中 4 ℃ 過夜。滴加辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗兔 IgG 二抗（1∶200），37 ℃ 孵育 30 min。二氨基聯苯胺（DAB）顯色 30 min。蘇木精復染，樹脂封片，鏡下觀察，細胞核呈紫藍色，陽性產物呈棕黃色或黃色顆粒。實驗結果經過 Image pro plus 6.0 分析。
1.5 從動物實驗角度觀察 KCs 中 TLR4 和 TF 表達
1.5.1 Western blot 方法檢測小鼠 KCs 中 TF 和 TLR4 蛋白表達
提取 KCs 蛋白并測定蛋白濃度，按等質量原則進行上樣，依次完成電泳和轉膜；PVDF 膜在 37 ℃ 下 5% 脫脂奶粉封閉 1 h；分別放入含對應一抗的孵育盒中 4 ℃ 過夜。第 2 天回收一抗后，TBST 搖洗 10 min×3；再放入與一抗對應的二抗孵育盒中于 37 ℃ 下孵育 1 h；TBST 搖洗10 min×3；最后曝光；Quantity One 4.0 測定各組條帶的灰度值。
1.5.2 real-time PCR 方法檢測 KCs 中 TF 和 TLR4 mRNA 表達
嚴格按試劑盒方法提取并測定各樣本總 RNA，逆轉錄：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 冷卻，–20 ℃ 保存。SYBR? Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒檢測 RNA 逆轉錄的表達。所需基因引物均由上海生工合成，具體序列如下：TF 上游引物為 5′-CAACCCAAACCCACCAACT-3′，下游引物為 5′-CCAGGTCACATCCTTCACG-3′，擴增片段長度為 124 bp；TLR4 上游引物為 5′-GGCATCATCTTCATTGTCCTT-3′，下游引物為 5′-TGTCCTCCCATTCCAGGTAG-3′，擴增片段長度為 660 bp；β-actin 上游引物為 5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物為 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，擴增片段長度為 183 bp。采用兩步法進行擴增：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，40 次循環。采用 2 –△△Ct法分析目的基因的表達差異，ΔΔCt=（Ct 目的基因–Ct 管家基因）實驗組–（Ct 目的基因–Ct 管家基因） 對照組。
1.6 從細胞角度觀察 TLR4 和 TF 表達
分離提取 WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠 KCs，按照（3～4）×106個/cm2密度接種到 6 孔板，給予大劑量（300 μg/L）的 LPS 刺激，然后分別于 0、15、30、60 及 120 min 時收集細胞和上清液備檢。
1.6.1 檢測 KCs 胞質中 TLR4 和 TF 蛋白和 mRNA 表達量
檢測方法同 1.5。
1.6.2 ELISA 法檢測小鼠 KCs 上清液中 TF 水平
根據 TF-ELISA 試劑盒操作說明對 KCs 上清液中 TF 水平進行測定，每組至少重復 3 次。
1.6.3 流式細胞儀檢測小鼠 KCs 上清液中 TF-MP 水平
按照上述方法處理細胞后收集對應時間點的上清液。分別取每組上清液 100 μL 加入 1.5 mL EP 管中，向其加入 392 μL 無菌 PBS，再依次加入4 μL 的 Annexin Ⅴ/FITC 及 4 μL CD142 PE，使其混勻后冰盒上避光孵育 30 min。孵育完畢，混勻 EP 管內液體后流式細胞儀檢測并計數。流式細胞儀分析所得數據，當 P2 門集滿 10 000 個標準 6 pm 計數顆粒后停止計數測量。將發生在 P1 門并且 FITC 顯示陽性的事件稱為 MP，MP 同時又包括 PE 事件稱為 TF-MP。
1.7 統計學方法
使用 SPSS 19.0 軟件對數據進行分析，計量數據以均數±標準差（
±s）表示，滿足方差齊性，組間比較用單因素方差分析，兩兩間比較用 LSD t 檢驗；若方差不齊，組間比較用秩和檢驗。2 組小鼠生存率用 log-rank 檢驗進行比較。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 HE 染色觀察胰腺損傷情況
對胰腺組織進行 HE 染色發現，6 h 和 12 h 時 WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠胰腺組織損傷情況變化不明顯，但到 24 h 時，WT 小鼠的胰腺可見大量凝固性壞死，組織結構較混亂，并可見大量炎性細胞浸潤，腺泡破裂、輪廓模糊，腺泡細胞核固縮、壞死，符合重癥急性胰腺炎的病理改變；TLR4-/-小鼠胰腺雖然也可見炎性細胞浸潤，但較 WT 小鼠病理損傷明顯減輕。見圖 1。
圖1
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠急性胰腺炎建模后 24 h 時的胰腺損傷情況（HE ×200）
a：WT 小鼠；b：TLR4-/-小鼠
2.2 WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠急性胰腺炎建模后肝臟和胰腺組織中 TF 蛋白表達結果
免疫組織化學方法檢測 WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠急性胰腺炎建模后肝臟和胰腺組織中 TF 蛋白表達情況見圖 2。建模后 6 h 和 12 h 時，WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠胰腺組織中 TF 表達量變化不明顯；到 24 h 時，WT 小鼠肝血竇中棕色沉著顆粒密度（0.34±0.01）明顯高于 TLR4-/-小鼠（0.28±0.01），二者比較差異有統計學意義（P<0.05）；WT 小鼠胰腺組織中棕色沉著顆粒密度（0.29±0.03）也明顯高于 TLR4-/-小鼠（0.23±0.01），二者比較差異有統計學意義（P<0.05）。
圖2
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠急性胰腺炎建模后 24 h 時肝臟和胰腺組織中 TF 蛋白表達情況（免疫組織化學 ×200）
a：WT 小鼠肝臟組織；b：TLR4-/-小鼠肝臟組織；c：WT 小鼠胰腺組織；d：TLR4-/-小鼠胰腺組織
2.3 急性胰腺炎建模后 WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠的生存情況
建模后發現，WT 小鼠于 12 h 開始出現死亡，24 h 達到高峰，平均存活率為 24%；TLR4-/-小鼠 48 h達死亡高峰，平均存活率為 48%，明顯優于 WT 小鼠（P=0.003 4），WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠的生存曲線見圖 3。結果提示，TLR4 敲除能減輕胰腺炎癥損傷程度，提高小鼠生存率。
圖3
急性胰腺炎模型建立后 WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠生存曲線比較
2.4 從動物實驗角度觀察 KCs 中 TF 和 TLR4 表達結果
2.4.1 KCs 中 TF 和 TLR4 蛋白表達
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠不同時間點時 KCs 中 TLR4 和 TF 蛋白表達的結果見圖 4。由圖 4 可見，WT 小鼠 KCs 中 TLR4 和 TF 蛋白表達均逐漸增強，在實驗觀察時間范圍內于 24 h 時達到峰值，明顯高于 6 h 和12 h 時的表達量（P<0.05）；TLR4-/-小鼠的 KCs 中 TLR4 蛋白表達量較低，而 TF 蛋白的表達量則逐漸增高，在實驗觀察時間范圍內也于 24 h 時達到峰值，也略高于 6 h 和 12 h 時的表達量。與 WT 小鼠相同時間點比較，TLR4-/-小鼠 KCs 中 TLR4 和 TF 蛋白表量達均明顯降低（P<0.05）。
圖4
Western blot 方法檢測 WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠不同時間點時 KCs 中 TLR4 和 TF 蛋白表達的結果
a：定性結果。b：TLR4 蛋白表達的半定量結果；c：TF 蛋白表達的半定量結果。與 TLR4-/-小鼠比較，*
2.4.2 KCs 中 TF 和 TLR4 mRNA 表達結果
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠不同時間點時 KCs 中 TLR4 和 TF mRNA 表達的半定量結果見圖 5。WT 小鼠不同時間點時 KCs 中 TLR4 和 TF mRNA 表達量隨時間變化逐漸增加，在觀察范圍內于 24 h 時達到峰值，明顯高于 6 h 和12 h 時的表達量（P<0.05）；TLR4-/-小鼠 KCs 中 TLR4 mRNA 表達量極少，其 TF mRNA 表達逐漸增強，在觀察范圍內也于 24 h 時達到峰值，略高于 6 h 和 12 h 時的表達量。與 WT 小鼠相同時間點比較，TLR4-/-小鼠 KCs 中 TLR4 和 TF mRNA 表達均明顯降低（P<0.05）。
圖5
real-time PCR 方法檢測 WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠不同時間點時 KCs 中 TLR4 和 TF mRNA 表達結果
a：TLR4 mRNA 表達；b：TF mRNA 表達。與 TLR4-/-小鼠比較，*
2.5 細胞實驗角度檢測 KCs 中 TF 和 TLR4 的表達和 TF-MP 的分泌結果
2.5.1 KCs 胞質中 TF 和 TLR4 蛋白表達
LPS 刺激 KCs 后，WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠不同時間點時 KCs 中 TLR4 和 TF 蛋白表達結果見圖 6。WT 小鼠 KCs 中 TLR4 和 TF 蛋白均隨時間變化表達逐漸增強，TLR4 蛋白表達量與前一時間點比較變化不明顯，但 TF 蛋白表達于 30 min 時升高明顯，明顯高于0 min 和 15 min 時的表達量（P<0.05），隨后一直呈持續高表達。與 WT 小鼠比較，TLR4-/-小鼠各時間點時的 TLR4 蛋白表達均明顯降低（P<0.05），TF 蛋白表達在 30 min、60 min 和 120 min 時明顯降低（P<0.05）。
圖6
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠細胞水平不同時間點時 KCs 中 TLR4 和 TF 蛋白表達結果
a：定性結果。b：TLR4 蛋白表達的半定量結果；c：TF 蛋白表達的半定量結果。與 TLR4-/-小鼠比較，*
2.5.2 KCs 中 TLR4 和 TF mRNA 表達
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠不同時間點時 KCs 中 TLR4 和 TF mRNA 表達的半定量結果見圖 7。從圖 7 中可以看到，WT 小鼠 KCs 中 TLR4 mRNA 表達量從 15 min 開始就明顯增加，并于 60 min 時達到最高水平，顯著高于 0 min 時的水平（P<0.05）；而 TLR4-/-小鼠各時相點時 KCs 中 TLR4 mRNA 表達量均較少（P>0.05）。WT 小鼠 KCs 中 TF mRNA 表達量逐漸增加，至 60 min 時達到峰值且顯著高于 0 min（P<0.001）、15 min（P<0.001）及 30 min（P<0.001），爾后開始下降且明顯高于 120 min（P=0.003）；而 TLR4-/-小鼠 KCs 中 TF mRNA 表達量相對穩定，隨時間變化其表達量無明顯變化（P>0.05）。與 WT 小鼠比較，TLR4-/-小鼠從 30 min 開始各時間點 TF mRNA 表達量均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。
圖7
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠細胞水平不同時間點時 KCs 中 TLR4 和 TF mRNA 表達結果
a：TLR4 mRNA 表達；b：TF mRNA表達。與 TLR4-/-小鼠比較，*
2.5.3 小鼠 KCs 上清液中 TF 水平
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠各時間點 KCs 上清液中的 TF 水平見圖 8。從圖 8 中可以看到，WT 小鼠 KCs 上清液中的 TF 水平逐漸升高，到 60 min 時開始顯著升高，在觀察范圍內于 120 min 時達到最高水平，且明顯高于 0 min、15 min 和 30 min 時的水平（均 P<0.05）；TLR4-/-小鼠 KCs 上清液中的 TF 水平也逐漸升高，也于 120 min 達到最高水平，但各時相間比較差異無統計學意義（P>0.05）。自 30 min 開始，WT 小鼠 KCs 上清液中的 TF 水平明顯高于 TLR4-/-小鼠（P<0.05）。
圖8
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠 KCs 上清液中不同時間點 TF 水平
與 TLR4-/-小鼠比較，*
2.5.4 小鼠 KCs 上清液中 TF-MP 水平
WT 小鼠和 TLR4-/-小鼠各時間點 KCs 上清液中 TF-MP 水平見圖 9。從圖 9 中可以看到，WT 小鼠 KCs 上清液中 TF-MP 水平逐漸升高，到 60 min 時開始顯著升高，在觀察范圍內于 120 min 達到最高水平，且明顯高于 0 min、15 min 和 30 min 時的水平（均 P<0.05）；TLR4-/-小鼠 KCs 上清液中 TF-MP 水平也逐漸升高，也于 120 min 時達峰值，但僅與0 min 時比較差異有統計學意義（P<0.05）。自 30 min 開始，WT 小鼠 KCs 上清液中 TF-MP 水平明顯高于 TLR4-/-小鼠（P<0.05）。
圖9
WT 和 TLR4-/-小鼠不同時相點 KCs 上清液中 TF-MP 水平
與 TLR4-/-小鼠比較，*
3 討論
急性胰腺炎是常見的急腹癥，并且有 15%～30% 的患者發展為重癥急性胰腺炎，其中胰腺微環境障礙就是重要的致病機制之一[6]。
TF 作為脂蛋白復合物，通過與因子 Ⅶ/Ⅶa 結合而啟動血液凝固級聯反應，參與各個器官的凝血機制。為探討 TF 是否對急性胰腺炎的發生、發展有所影響，我們利用野生型 C57/BL6 小鼠建立急性胰腺炎模型后，測定胰腺組織中 TF 表達情況，發現其在胰腺組織中表達量明顯升高，這與急性胰腺炎患者血清中 TF 的表達情況一致[7]，提示了 TF 可能參與了胰腺炎的調控。
在重癥急性胰腺炎中，監測 TF 的水平可作為早期的預后指標判斷肺衰竭的進展和監測肺功能不全的嚴重程度[8-10]，并且 TF 作為重癥急性胰腺炎嚴重程度指標優于 C 反應蛋白[11]。同時，TF 還被選作為其他疾病的潛在治療靶標[12-14]。
TF 是凝血途徑的重要啟動因子，不僅存在于各種組織和血管外膜表面，也存在于血液循環[15]，而參與胰腺炎的 TF 是由胰腺本身合成、分泌的還是由其他器官來源的不得而知。在炎癥因子作用下，血小板可攜帶 TF 參與凝血機制，但血小板本身卻不能夠合成 TF，TF 是如何轉運到血小板上的呢？有研究[3]發現，單核細能夠把 TF 傳遞到血小板上，血小板也能夠把 TF 傳遞到單核細胞上，血小板經過活化后能釋放包含 TF 的 MP 進入血漿， MP 能夠再次被單核細胞攝取，形成血小板和單核細胞之間的 TF-MP 循環，而循環中的單核細胞正是巨噬細胞。KCs 是位于肝臟的一種特別的巨噬細胞，除具有巨噬細胞的一般特征外，作為炎癥細胞時既有代表性又有特殊性。我們利用小鼠建立急性胰腺炎模型后，分離、培養 KCs 發現其中 TF 表達量明顯升高，但其又是如何作用于胰腺微環境的有待進一步研究。
有研究[16]發現，TF 主要以在微粒上表達的形式存在于循環中，這種微粒就是 TF-MP。TF-MP 在糖尿病和動脈粥樣硬化及包含急性胰腺炎在內的炎癥反應中顯著升高，被認為是一種重要的促凝循環微粒[17-19]。LPS 刺激 KCs 后發現上清液中 TF-MP 明顯增加，并且與 KCs 中 TF 表達量相一致。因此，我們推測，KCs 可能是通過 TF-MP 將 TF 轉運到胰腺，從而對胰腺微環境產生影響，加重胰腺炎的進展。
KCs 參與包含急性胰腺炎在內的炎癥及感染炎癥調控，主要依賴 TLR4 的激活[20-21]，所以 TLR4 可能是 KCs 的炎癥反應和 TF 表達啟動凝血途徑的共同通路[22]。本研究結果發現，TLR4 敲除后，小鼠 KCs 中 TF 表達量明顯下降，肝臟和胰腺組織的損傷有所減輕，生存率明顯升高；同時，與 WT 小鼠相比，LPS 刺激 KCs 后 TLR4-/-小鼠 KCs 中 TF 表達量減少，TF-MP 胞外分泌量下降。LPS 可能結合 TLR4而激活 TLR4 通路，促進 KCs 表達 TF，通過 TF-MP 而釋放 TF，從而促進炎癥反應和產生微循環障礙，加重胰腺損害，這與循環中 TF 引起肺損傷的機制相似[23]。這與其他關于抑制 TLR4 減輕急性胰腺炎的研究[24-25]結果相一致。
既往研究[26-27]認為，急性胰腺炎時，循環中凝血機制被激活，導致全身多器官功能障礙、血栓形成等并發癥。在本研究中發現，肝臟 KCs 在處理感染等刺激因素時，可釋放大量 TF 并可轉運作用于胰腺，影響胰腺的局部微環境，導致胰腺炎的發生和發展。當敲除 KCs 中的 TLR4 時，KCs 中 TF 的表達量下降，KCs 上清液中 TF-MP 含量減少，同時胰腺組織中 TF 表達量減少，胰腺炎癥損傷有所減輕。因此，KCs 可能通過 TLR4 信號通路調控 TF 及 TF-MP 表達而誘導急性胰腺炎的發生。本研究發現，KCs 分泌的 TF 對胰腺炎有調控作用，但對胰腺細胞的具體調控機制尚不明確，若能闡明 KCs 與胰腺細胞的相互作用機制，將為急性胰腺炎的治療提供新的思路。
