引用本文： 孫華文, 楊厚淶, 王秋爽. CEA-EPO 質粒的構建及其誘導造血干細胞定向生成的紅細胞疫苗治療結腸癌的研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(7): 792-799. doi: 10.7507/1007-9424.201711085 復制
目前，在臨床上應用的結直腸癌腫瘤標志物中，血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是最重要的一種。CEA 主要表達于結腸等消化道腫瘤組織中，能預測結直腸癌的預后及復發。文獻[1]表明，CEA 能誘發結腸癌機體的特異性免疫反應。因此，CEA 啟動子可用作腫瘤靶向治療的工具，啟動下游殺傷基因并特異性表達于腫瘤細胞，從而避免損傷正常細胞。造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）具有自我更新和分化為血液及免疫系統中各種成熟細胞的能力，因而是基因治療理想的細胞疫苗；紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是造血干細胞分化中的主要刺激因子，能促進造血干細胞向原始紅細胞分化，在紅細胞疫苗誘導分化研究中具有重要的作用[2]。本研究建立了轉 CEA 及 EPO 基因的造血干細胞，它既可以誘導造血干細胞定向分化成紅細胞疫苗，又可以合成攜帶腫瘤抗原的紅細胞疫苗，有望成為一種多功能的紅細胞疫苗，在抗結腸癌治療中發揮重要的作用。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要材料、試劑及設備
1.1.1 實驗動物
BALB/C 小鼠 90 只，6～8 周齡，體質量（20±1）g，雌雄不限，購自武漢大學實驗動物中心。動物實驗已經獲得武漢大學人民醫院動物倫理委員會的倫理許可。
1.1.2 主要材料
結腸癌細胞株 CT26、HeLa 細胞和測序鑒定正確的小鼠 RAN 基因由武漢大學人民醫院胃腸外科實驗室保存。感受態細胞 DH5α 購自武漢博士德公司。基因共表達載體 pIRES1neo、重組質粒 pcDNA-CEA 及重組質粒 pMD18T-EPO 購自美國 GIBCO 公司。pGL3-Basic 載體和 pGI3-promoter 載體，以及pcDAN3.1 和 pAdEasy-1 質粒均為 Promega 公司產品。
1.1.3 主要試劑
BSA 購自武漢四季青生物工程材料研究所；熒光標記小鼠抗體 CD117-PE 磁珠、CEA-PE 抗體的免疫磁珠試劑盒及抗生物素均購自武漢中山試劑公司；T4DNA 連接酶及各種限制性內切酶購自美國 Promega 公司，總 RNA 提取試劑盒購自德國 Qiagen 公司；逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒購自武漢 Sigma 公司；PCR 回收試劑盒購自武漢 Sigma 公司、pGEM-Teasy 載體連接試劑盒系美國 Promega 公司產品。綠色熒光蛋白（GFP）、BCA 蛋白定量試劑盒、DMEM 培養基、胎牛血清（FBS）溶液、胰蛋白酶及Ⅰ型膠原酶均購自美國 GIBCO 公司。
1.1.4 主要設備
流式細胞儀（FACSCalibur）購自 BD 公司；PCR 儀（津島 340）、全自動生化分析儀（Olympus5012）、倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡均購自日本 Olympus 公司；MiniMACS 分離器及 MS 分離柱均購自武漢中山試劑公司；免疫磁珠分選系統（MACS）購自武漢博士德公司；雙熒光檢測系統（SFD3199）購自美國 Promega 公司。
1.2 細胞培養條件
CT26 細胞、HeLa 細胞及感受態細胞 DH5α 的培養條件：將上述細胞接種于 DMEM 培養液中，并加入 10% FBS 和 1% 青霉素/鏈霉素，在 37 ℃、5% CO2 環境下培養。原代細胞接種后 5 d 首次換液，之后每 4 天換液 1 次。細胞接種后第 13 天，經光學顯微鏡觀察可見細胞克隆已經形成后，使用胰蛋白酶消化法傳代培養。
1.3 小鼠骨髓胚胎干細胞的收集和培養
采用頸椎脫臼法處死 10 只 BALB/C 小鼠，取小鼠股骨和脛骨，放在盛有 DMEM 的培養基中，去除骨上的肌肉組織及骨膜，用注射器插入股骨膝蓋端及脛骨骨端，注入緩沖液反復沖洗骨腔并收集沖洗液。造血干細胞的培養條件：干細胞相關的培養液在 5% CO2 的氣體環境中培養使用，它在細胞培養中的主要作用在于維持培養基的 pH 值為 7.2～7.4。
1.4 造血干細胞的磁珠純化和收集
用含抗體 CD117 的磁珠分離造血干細胞：用緩沖液按 40 μL/107個細胞重懸小鼠骨髓細胞，加入生物素化抗體混合物（10 μL/107個細胞），混勻，4～8℃ 孵育 10 min。加入緩沖液（30 μL/107個細胞）和 20 μL 抗生物素微珠，混勻，4～8 ℃ 孵育15 min。加入 5 mL 緩沖液洗滌細胞，1 500 r/min 離心 10 min（r=11 cm），離心溫度為 4～8℃，完全去除上清液。加入 CD117 微珠（20 μL/107個細胞），混勻。將所得的細胞懸液加入 MS 分選柱中，收集先行流出的未標記細胞組分，并用 1.5 mL 緩沖液沖洗 MS 柱，收集的細胞即為 CD117 陰性細胞。將分選柱移出磁場，用 1 mL 緩沖液快速將分選柱上滯留的細胞洗脫下來，這些細胞是磁性標記的 CD117 陽性細胞。將分選前的標本、對照管（緩沖液）、分選后的陰性管標本及分選后的陽性管標本上流式細胞儀檢測細胞純度，純化前后每類標本檢測4 次（取均值），每組 10 份標本。
1.5 CEA 啟動子的引物設計和 PCR 擴增
根據 GenBank 中 CEA 基因序列以及綠色熒光蛋白真核細胞表達載體（pEGFP）中的皰疹病毒（CMV）啟動子序列設計引物（由武漢 Sigma 公司設計合成），并分別在各上下游引物的 5′端引入 BglⅡ 和 HindⅢ 酶切位點。CEA 啟動子的引物序列：上游 5′-GAATTCCCCGGGACCCTGCTGGG-3′，下游 5′-GCTTGAGTTCCAGGAACGTTTTGGGATCC-3′，產物長度為 386 bp；CMV 啟動子的引物序列：上游 5′-GCGAGATCTAATCAATTACGGGGTCAT-3′，下游：5′-GCGAAGCTTGGATCTGACGGTT- CACTA-3′，引物兩端分別添加酶切位點和保護堿基。CEA 的 PCR 擴增采用 50 μL 體系，以 1 μg DNA 為模板，分別加入 Taq 酶 1.5 U，上下游引物各 50 pmol，脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）10 nmol。具體操作步驟、反應體系和反應條件見試劑盒說明書。CEA 啟動子片段的擴增采用熱啟動法[1]。PCR 產物行 10% 瓊脂糖凝膠電泳，以膠回收試劑盒回收得到 CEA 啟動子片斷，用于重組質粒的構建。
1.6 增強型綠色熒光蛋白（EGFP）標記的 CEA-EPO 重組腺病毒載體和其他載體的構建、純化和滴度測定
用 KpnⅠ 和 XhoⅠ 雙酶切 DNA 片段，插入穿梭質粒中的相同位點，將 EPO-cDNA 插入 pcDNA3.1 質粒的多克隆位點，用 CEA 基因啟動子替代 pcDNA3.1 質粒的 CMV 啟動子，構建成 CEA-EPO 重組質粒。再構建重組腺病毒 pAd-GFP/ CEA-EPO，克隆篩選出陽性重組穿梭質粒 pAdTrack/CEA-EPO。取質粒 pAdEasy-1，小量提取質粒，以 1% 瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定，最終以 PacⅠ 酶切分析（用 CEA-EPO 基因啟動子中的 SmaⅠ 單一酶切位點進行初步酶切鑒定）和 PCR 擴增 CEA-EPO 片段鑒定重組腺病毒質粒。取 800 μL 重組質粒送武漢中山生物技術有限公司測序，并在熒光顯微鏡下觀察或根據細胞病變效應判斷病毒的產生。確認構建正確后大量擴增病毒，并經 CsCl 超速離心純化。純化病毒顆粒用 PBS 溶液稀釋后在–80 ℃ 條件下凍存備用，病毒滴度根據空斑形成實驗測定。由此包裝、生產出攜帶 CEA、EPO 和 GFP 基因的重組腺病毒。各部分操作均按試劑盒說明書進行。所構建的 4 類重組腺病毒的病毒滴度結果：CEA 為 4.5×1012 puf，EPO 為 3.4×1012 puf、CEA-EPO 為 4.8×1012 puf，GFP 基因為 4.1×1012 puf。
1.7 造血干細胞體外轉染 CEA 及 EPO 基因
通過比較不同轉染復數（multiplicity of infection，MOI）轉染后的病毒轉染效率，確定最佳 MOI。其中，CEA 重組腺病毒的最佳 MOI 為 75，EPO 重組腺病毒的最佳 MOI 為 110，空載體的最佳 MOI 為 100，CEP-EPO 的最佳 MOI 為 120。之后再根據處理方法的不同，將造血干細胞分為 4 組，分別為空載體組（轉染 GFP）、CEA 組（轉染 CEA 重組腺病毒載體）、EPO 組（轉染 EPO 重組腺病毒載體）及 CEA-EPO 組（轉染 CEA-EPO 重組腺病毒載體），每組對應 10 個復孔。取第 3 代造血干細胞，以 5×104個/cm2的密度接種于 10 孔板中，待細胞達 90% 貼壁時，根據分組進行相應處理（以最佳 MOI 轉染），分別加入 3 mL 重組腺病毒載體。轉染操作根據試劑盒說明書進行。于 37 ℃、5% CO2 培養箱中培養 24 h 后更換新鮮培養液。培養 30 min 后檢測 4 組細胞中 CEA mRNA、EPO mRNA 及其蛋白的表達。
1.8 檢測 CEA 及 EPO 基因的表達
4 組轉染細胞的 CEA mRNA 和 EPO mRNA 的表達水平采用半定量 RT-PCR 法測定：分別取 4 組的造血干細胞，提取細胞總 RNA 后，用 RT-PCR 方法檢測 CEA mRNA 及 EPO mRNA 的表達水平。RT-PCR 操作及定量按試劑盒說明書進行。
1.9 病毒轉染效率檢測
上述 4 組細胞培養 7 d 后于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。培養 10 d 后用 0.25% 胰蛋白酶消化，吹打形成單個細胞，PBS 液清洗 5 min 后棄上清，再用 PBS 液重新清洗 2 次，于熒光顯微鏡下觀察。成功轉染細胞呈綠色。取 4 組細胞于 200 倍鏡下隨機取 3 個視野，計數熒光表達細胞數，并計算轉染效率。轉染效率（%）=熒光表達細胞數/同視野下細胞總數×100%。
1.10 嵌合體模型的建立
嵌合體模型的建立方法：通過放射照射除去混存紅細胞，獲得的骨髓嵌合體小鼠可以有效地富集表達 CEA-EPO 的紅細胞。40 只 BALB/C 小鼠嵌合體模型的構建：小鼠于術前 5 d 開始飲含紅霉素（250 mg/L）和慶大霉素（320 mg/L）的抗生素溶液，再接受 8 Gy（照射率為 0.5 Gy/min）全身照射（TBI），TBI 后 4 h 內經尾靜脈（按分組）輸入 BALB/C 小鼠骨髓細胞（2×108個/只），注入骨髓細胞后 48 h 后經腹腔注射環磷酰胺（50 mg/kg）。分別于骨髓移植后 15、20 和 30 d 抽取外周血，用流式細胞儀測定嵌合率，以證實小鼠源性骨髓干細胞已在體內植活（本實驗 40 只小鼠均構建成功），排除了自身紅細胞免疫功能的影響。
1.11 從嵌合體模型獲得 CEA 及 EPO 基因共轉染紅細胞疫苗
將 BALB/C 小鼠嵌合體模型分為 4 組：空載體組注射空載 GFP 干細胞，CEA 組注射 CEA 干細胞，EPO 組注射 EPO 干細胞，CEA-EPO 組注射 CEA-EPO 干細胞，每組 10 只小鼠。在其尾靜脈注射干細胞（干細胞類型同分組一致）2 mL 飼養 2 周后，處死小鼠，從小鼠外周靜脈和脾臟收集外周血，再用表達 CEA 及 EPO 抗體的免疫磁珠分離4 組類型的紅細胞疫苗，即可大量獲得共轉染 CEA-EPO 基因的紅細胞疫苗和其他類型疫苗。
1.12 應用細胞紅系相關標志抗體 GPA 和 CD71 標記，并經流式細胞儀證實紅細胞疫苗培養成功
收集獲得共轉染 CEA-EPO 基因的紅細胞疫苗和其他類型疫苗，用胰酶消化制成單細胞懸液，取 3×106 個細胞，用 yogaPBS 液洗滌 1 遍，置于 1.5 mL 的 EP 管中，分別加入小鼠抗人 GPA-PE 和 CD71-FITC 抗體，上流式細胞儀檢測所有細胞中各表面標志物陽性細胞的比例。
1.13 轉染紅細胞疫苗的體外實驗
體外實驗包括基因共轉染 CEA-EPO 紅細胞疫苗對小鼠單核細胞增殖的影響實驗及增殖細胞對結腸癌細胞的殺傷作用實驗。將 BALB/C 小鼠分為 4 組（每組 10 只）皮下接種 BALB/C 小鼠結腸癌細胞系 CT26 后 2 周，自小鼠尾靜脈采血 2 mL，采用密度梯度法分離單個核細胞，單核細胞與 CT26 腫瘤細胞按 1∶10、1∶20、20∶1 及 40∶1 的比例（每類比例設 12 個復孔）于 20 孔板上混合培養（每孔 4×104個單核細胞），設植物血凝素（PHA）作為對照，48 h 后以 MTT 法檢測單核細胞殺傷率。靶細胞殺傷率=（靶細胞 A 值+單核細胞 A 值–殺傷實驗A 值–本底A 值）/（靶細胞 A 值–本底 A 值）×100%，其中A 值為吸光度值。
1.14 研究基因共轉染紅細胞疫苗對腫瘤成瘤性的影響和成瘤實驗
收集處于對數生長期的結腸癌細胞株 CT26，以每只小鼠 5×105個細胞接種于 40 只 BALB/C 小鼠右側腋窩皮下，制作荷瘤動物模型。將制備成功的 40 只荷瘤動物模型分成 4 組（按上述分組方法），每組 10 只。分別從尾靜脈注射疫苗或空白載體，2 周后，觀察腫瘤的生長情況及小鼠的生存時間（正常飼養，記錄小鼠腫瘤體積、死亡原因以及時間），時長 30 d 以上。每周 2 次用游標卡尺測量腫瘤直徑，腫瘤體積以公式 1/2ab2計算，其中 a 為腫瘤長徑，b 為腫瘤短徑，長度單位為 cm。
圖1
示空載體組、CEA 組及 EPO 組中 CEA mRNA（a）和 EPO mRNA（b）的電泳結果
a：M 代表 marker，泳道 1 和 2 代表 EPO 組，泳道 3 代表 CEA 組，泳道 4 代表空載體組；b：M 代表 marker，泳道 1 和 2 代表 CEA 組，泳道 3 代表 EPO 組，泳道 4 代表空載體組
1.15 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件進行分析。計量資料采用成組 t 檢驗或方差分析（兩兩比較采用 SNK 法），計數資料采用成組 χ2 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 造血干細胞的磁珠純化和收集結果
分選前的標本、對照管、分選后的陰性管標本及分選后的陽性管標本上流式細胞儀檢測細胞純度，其結果顯示：分選前的標本和對照管標本純化前后的 CD117 陽性細胞純度比較差異均無統計學意義（P>0.05），分選后的陰性管標本純化前后的 CD117 陽性細胞純度均為 0，而分選后的陽性管標本純化后的 CD117 陽性細胞純度較純化前升高，差異有統計學意義（P<0.01），見表 1。結果提示免疫磁珠純化 CD117 陽性細胞成功。
表1
免疫磁珠純化前后 CD117 陽性細胞的純度值（%，
，n=10）
2.2 CEA mRNA 和 EPO mRNA 的表達結果
EPO 基因片段大小為 598 bp，CEA 啟動子為419 bp。RT-PCR 結果顯示（圖 1），在 598 bp 和419 bp 處擴增獲得特異性目的片段，表明轉染 CEA 及 EPO 基因成功。
圖2
示 CEA 組、EPO 組及 CEA-EPO 組細胞的轉染效果（倒置相差顯微鏡 ×200）
a：CEA 組可見綠色熒光表達；b：EPO 組可見紅色熒光表達；c：CEA-EPO 組同時可見紅色和綠色熒光
2.3 病毒轉染效率
轉染后培養 7 d，于倒置相差顯微鏡下觀察干細胞，結果顯示：CEA 組可見綠色熒光表達，EPO 組可見紅色熒光表達，CEA-EPO 組同時可見紅色和綠色熒光（圖 2），提示重組腺病毒成功轉染細胞。轉染后 4 d 在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光，對表達 GFP 的細胞計數，觀察轉染效率。每孔細胞隨機選擇 3 個 200 倍視野，按有無綠色熒光陽性細胞計數，計算綠色熒光陽性細胞百分率，每個 MOI 值的轉染效率為 3 個視野的均值。
圖3
4 組細胞中 GPA 和 CD71 陽性細胞表達率的流式細胞儀檢測結果
2.4 嵌合體模型的建立
4 組小鼠骨髓移植后 15、20 和 30 d 的嵌合率結果見表 2。由表 2 可見，骨髓移植后 15 d 時，4 組的嵌合率最高，高于同組內 20 d 和 30 d 時的嵌合率（P<0.05），且同組內30 d 的嵌合率高于 20 d（P<0.05）；各時點空載體組、CEA 組、EPO 組和 CEA-EPO 組之間的嵌合率比較差異均沒有統計學意義（P>0.05）。
表2
骨髓移植后嵌合體模型各時點的嵌合率（%，
，n=10）
2.5 CEA-EPO 基因轉染紅細胞疫苗的獲得
流式細胞儀檢測結果顯示：CEA-EPO 組細胞可以有效地向紅細胞定向轉化，見表 3 和圖 3。
表3
4 組小鼠紅細胞疫苗的 GPA 和 CD71 陽性率（%，
，n=10）
圖4
示制備的荷瘤動物模型，黑箭指示腫瘤
2.6 基因共轉染紅細胞疫苗的體外實驗
CEA-EPO 基因共轉染紅細胞疫苗激活的單核細胞對 CT26 細胞的殺傷效果見表 4。由表 4 可見，1∶10、1∶20 及 20∶1 比例下空載體組、CEA 組、EPO 組和 CEA-EPO 組的殺傷率比較差異均無統計學意義（P>0.05）；在比例為 40∶1 時時，CEA-EPO 組的殺傷率最高（P<0.05），但其余 3 組比較差異無統計學意義（P>0.05），提示疫苗刺激增殖后的單核細胞對結腸癌細胞的殺傷具有明顯特異性。
表4
疫苗激活的單核細胞對 CT26 細胞的殺傷作用（%，
，n=12）
2.7 CEA-EPO 轉染紅細胞疫苗的體內實驗
本研究的成瘤動物模型見圖 4。CEA-EPO 轉染紅細胞疫苗的體內實驗結果表明：處理前 2 周4 組小鼠的腫瘤體積比較差異無統計學意義（P>0.05），但處理后 2 周 CEA-EPO 組的腫瘤體積及死亡率小于或低于另 3 組（P<0.05），且生存時間長于另 3 組（P<0.05）；空載體組、CEA 組及 EPO 組處理后 2 周的腫瘤體積、生存時間和死亡率比較差異均無統計學意義（P>0.05），見表 5。小鼠死亡均系腫瘤轉移引起的消化、循環和呼吸功能衰竭所致。
表5
轉染紅細胞疫苗對腫瘤成瘤性的影響（
，n=10）
3 討論
采用非基因修飾方法制備的攜帶腫瘤抗原的紅細胞作為免疫疫苗治療腫瘤的研究在國外已有報道，攜帶抗原的紅細胞可以誘導機體產生免疫反應的現象早已在醫學界引起關注[3-5]。紅細胞源于骨髓多能造血干細胞，紅細胞輸注是目前治療貧血的常用手段。已進入臨床試驗階段的腫瘤疫苗主要有樹突狀細胞疫苗、DNA 腫瘤抗原疫苗、以腫瘤抗原蛋白或肽為基礎的疫苗、自體或異體的腫瘤細胞疫苗和病毒攜帶腫瘤抗原疫苗，但目前還沒有哪一種疫苗對治療結腸癌有明顯的療效[6-8]，結腸癌的免疫治療依然有待于我們去研究，而紅細胞疫苗在治療結腸癌方面有重要的前景。
研究[9]表明，與供體紅細胞結合的抗原可以通過交叉激活進入受體抗原遞呈細胞的主要組織相容性抗原（MHC-Ⅰ）通路，從而導致受體 CD8+T 細胞對供體抗原特異性地激活和增殖。此外，抗原與細胞結合可以使其通過 MHC-Ⅰ 交叉激活 CD8+T 細胞的效率增加，證明了采用攜帶抗原的紅細胞作為腫瘤疫苗的可行性[10-11]。
EPO 是一種小分子糖蛋白感應激素，參與調節許多細胞的生長發育過程，能促進血管再生、神經發育等。EPO 是促進紅系祖細胞增殖、分化和紅細胞成熟的主要刺激因子，它能促進造血干細胞向原始紅細胞分化，加速幼紅細胞的分裂和增殖，促進血紅蛋白的合成。而紅細胞疫苗能抑制淋巴細胞增生，促進靜止和效應性 T 細胞、NK 細胞和成熟樹突狀細胞的抗腫瘤免疫作用。本實驗結果表明：攜帶腫瘤抗原的紅細胞可以通過 EPO 基因修飾胚胎干細胞、誘導多能干細胞或造血干細胞的增殖和分化[12-14]。
CEA 是最早被發現和鑒定的腫瘤相關抗原之一，1965 年 Gold 和 Freedman 首先于人結腸癌組織中發現 CEA，其是胚胎性致癌抗原，主要存在于消化道腫瘤中，正常成人血清中的 CEA 含量極低。血清 CEA 在結直腸癌的診斷、預后判斷及復發的評估中發揮重要作用[15-17]。CEA 在正常人體內扮演著非特異性防御因子的角色，對結直腸癌的療效判斷、病情發展、監測和預后估計是一類較好的腫瘤標志物。由于 CEA 的免疫原性很弱，一般不能引起機體產生有效的免疫反應，因此機體的免疫系統無法識別腫瘤細胞表面的 CEA，產生免疫耐受，使腫瘤細胞逃避了免疫系統的殺傷。因此，增強 CEA 的免疫原性，誘導機體產生特異性的免疫反應是腫瘤治療的一個新靶點[18]。
結腸癌中 CEA 的表達量遠高于端粒酶，且在相應的正常組織細胞中沒有表達，說明該基因啟動子的應用有可能提高腫瘤細胞內目的基因的表達水平，從而起到特異和高效的治療作用。本實驗成功擴增了 1 kb 大小的 CEA 啟動子片斷，構建了 CEA 啟動子真核表達載體，所構建的 CEA 啟動子有較強的啟動活性，具體做法是：將 EPO-cDNA 插入 pcDNA3.1 質粒的多克隆位點，用 CEA 基因啟動子替代 pcDNA3.1 質粒的 CMV 啟動子，構建成 CEA-EPO 重組質粒；此外，將 CEA 啟動子連接到 EPO-cDNA 上游，構建表達載體。本實驗將 CEA-EPO 基因導入造血干細胞后，利用 RT-PCR 檢測 CEA mRNA 和 EPO mRNA 的表達，結果說明 CEA-EPO 重組腺病毒載體的轉染成功。
此外，本研究發現：攜帶 CEA-EPO 基因的造血干細胞可以定向分化成紅細胞疫苗，是臨床治療腫瘤的理想疫苗。
骨髓細胞中造血干細胞含量少是分離純化的困難之一，造血干細胞約占骨髓有核細胞的 0.5%[19]，而在外周血中的含量更低[20-26]。本實驗結果表明：免疫磁珠分離法、造血干細胞表面特異的抗原標記法及磁珠分離法技術簡單、易行，對細胞活力的影響小，且獲得造血干細胞的純度高。
本實驗收集了造血干細胞，并且定向轉化成轉染了 CEA-EPO 基因的紅細胞疫苗，其流式細胞儀分析結果表明：分選后的陽性管標本純化后 CD117 陽性細胞的純度較純化前升高；RT-PCR 結果顯示，CEA-EPO 組有 EPO mRAN 和 CEA mRAN 表達，表明造血干細胞體外轉染 CEA-EPO 基因成功；應用細胞紅系相關標志抗體 GPA 和 CD71 標記后，結果表明，CEA-EPO 組的紅系相關標志 GPA 和 CD71 的表達比例明顯高于其余 3 組；流式細胞儀結果證實紅細胞疫苗培養成功。進一步研究相關疫苗激活的單核細胞對結腸癌細胞系 CT26 細胞的殺傷作用，結果表明：在比例為 40∶1 時，CEA-EPO 組的殺傷力高于空載體組、CEA 組和 EPO 組（P<0.05）；體內試驗的成瘤性實驗結果表明：CEA-EPO 組處理 2 周后的腫瘤體積高于其他 3 組，且 CEA-EPO 組的生存時間也長于其余 3 組，而空載體組、CEA 組及 EPO 組間比較差別無統計學意義，筆者分析，這是由于干細胞未在 EPO 基因的作用下生成的紅細胞疫苗，其免疫功能還不完善所致。
本實驗采用免疫磁珠陽性選擇法分選造血干細胞，從小鼠股骨和脛骨中收集造血干細胞，之后先進行系別細胞去除的陰性分選，磁性標記后去除系別細胞，根據 CD117 的表達對這些細胞做進一步的磁珠陽性分選，從復雜的細胞混合物中分離出很高純度的細胞。
本研究對攜帶 CEA-EPO 的紅細胞的抗腫瘤作用，在小鼠結腸癌模型中進行了研究，這對發展更加有效的新型腫瘤疫苗具有重要的意義。筆者認為，采取基因修飾的方法獲得的攜帶抗原的紅細胞有以下優點：攜帶抗原的紅細胞可通過基因修飾胚胎干細胞、誘導多能干細胞或造血干細胞在體外大量產生；與使用其他方法獲得的攜帶抗原的紅細胞相比，基因修飾表達腫瘤抗原的紅細胞可以同時表達促進交叉激活的共刺激免疫分子，進一步增強免疫反應，使腫瘤疫苗達到更好的效果。本實驗建立的轉 CEA 及 EPO 基因造血干細胞的紅細胞疫苗，有望在結腸癌的治療中發揮重要的作用。
目前，在臨床上應用的結直腸癌腫瘤標志物中，血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是最重要的一種。CEA 主要表達于結腸等消化道腫瘤組織中，能預測結直腸癌的預后及復發。文獻[1]表明，CEA 能誘發結腸癌機體的特異性免疫反應。因此，CEA 啟動子可用作腫瘤靶向治療的工具，啟動下游殺傷基因并特異性表達于腫瘤細胞，從而避免損傷正常細胞。造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）具有自我更新和分化為血液及免疫系統中各種成熟細胞的能力，因而是基因治療理想的細胞疫苗；紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是造血干細胞分化中的主要刺激因子，能促進造血干細胞向原始紅細胞分化，在紅細胞疫苗誘導分化研究中具有重要的作用[2]。本研究建立了轉 CEA 及 EPO 基因的造血干細胞，它既可以誘導造血干細胞定向分化成紅細胞疫苗，又可以合成攜帶腫瘤抗原的紅細胞疫苗，有望成為一種多功能的紅細胞疫苗，在抗結腸癌治療中發揮重要的作用。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要材料、試劑及設備
1.1.1 實驗動物
BALB/C 小鼠 90 只，6～8 周齡，體質量（20±1）g，雌雄不限，購自武漢大學實驗動物中心。動物實驗已經獲得武漢大學人民醫院動物倫理委員會的倫理許可。
1.1.2 主要材料
結腸癌細胞株 CT26、HeLa 細胞和測序鑒定正確的小鼠 RAN 基因由武漢大學人民醫院胃腸外科實驗室保存。感受態細胞 DH5α 購自武漢博士德公司。基因共表達載體 pIRES1neo、重組質粒 pcDNA-CEA 及重組質粒 pMD18T-EPO 購自美國 GIBCO 公司。pGL3-Basic 載體和 pGI3-promoter 載體，以及pcDAN3.1 和 pAdEasy-1 質粒均為 Promega 公司產品。
1.1.3 主要試劑
BSA 購自武漢四季青生物工程材料研究所；熒光標記小鼠抗體 CD117-PE 磁珠、CEA-PE 抗體的免疫磁珠試劑盒及抗生物素均購自武漢中山試劑公司；T4DNA 連接酶及各種限制性內切酶購自美國 Promega 公司，總 RNA 提取試劑盒購自德國 Qiagen 公司；逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒購自武漢 Sigma 公司；PCR 回收試劑盒購自武漢 Sigma 公司、pGEM-Teasy 載體連接試劑盒系美國 Promega 公司產品。綠色熒光蛋白（GFP）、BCA 蛋白定量試劑盒、DMEM 培養基、胎牛血清（FBS）溶液、胰蛋白酶及Ⅰ型膠原酶均購自美國 GIBCO 公司。
1.1.4 主要設備
流式細胞儀（FACSCalibur）購自 BD 公司；PCR 儀（津島 340）、全自動生化分析儀（Olympus5012）、倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡均購自日本 Olympus 公司；MiniMACS 分離器及 MS 分離柱均購自武漢中山試劑公司；免疫磁珠分選系統（MACS）購自武漢博士德公司；雙熒光檢測系統（SFD3199）購自美國 Promega 公司。
1.2 細胞培養條件
CT26 細胞、HeLa 細胞及感受態細胞 DH5α 的培養條件：將上述細胞接種于 DMEM 培養液中，并加入 10% FBS 和 1% 青霉素/鏈霉素，在 37 ℃、5% CO2 環境下培養。原代細胞接種后 5 d 首次換液，之后每 4 天換液 1 次。細胞接種后第 13 天，經光學顯微鏡觀察可見細胞克隆已經形成后，使用胰蛋白酶消化法傳代培養。
1.3 小鼠骨髓胚胎干細胞的收集和培養
采用頸椎脫臼法處死 10 只 BALB/C 小鼠，取小鼠股骨和脛骨，放在盛有 DMEM 的培養基中，去除骨上的肌肉組織及骨膜，用注射器插入股骨膝蓋端及脛骨骨端，注入緩沖液反復沖洗骨腔并收集沖洗液。造血干細胞的培養條件：干細胞相關的培養液在 5% CO2 的氣體環境中培養使用，它在細胞培養中的主要作用在于維持培養基的 pH 值為 7.2～7.4。
1.4 造血干細胞的磁珠純化和收集
用含抗體 CD117 的磁珠分離造血干細胞：用緩沖液按 40 μL/107個細胞重懸小鼠骨髓細胞，加入生物素化抗體混合物（10 μL/107個細胞），混勻，4～8℃ 孵育 10 min。加入緩沖液（30 μL/107個細胞）和 20 μL 抗生物素微珠，混勻，4～8 ℃ 孵育15 min。加入 5 mL 緩沖液洗滌細胞，1 500 r/min 離心 10 min（r=11 cm），離心溫度為 4～8℃，完全去除上清液。加入 CD117 微珠（20 μL/107個細胞），混勻。將所得的細胞懸液加入 MS 分選柱中，收集先行流出的未標記細胞組分，并用 1.5 mL 緩沖液沖洗 MS 柱，收集的細胞即為 CD117 陰性細胞。將分選柱移出磁場，用 1 mL 緩沖液快速將分選柱上滯留的細胞洗脫下來，這些細胞是磁性標記的 CD117 陽性細胞。將分選前的標本、對照管（緩沖液）、分選后的陰性管標本及分選后的陽性管標本上流式細胞儀檢測細胞純度，純化前后每類標本檢測4 次（取均值），每組 10 份標本。
1.5 CEA 啟動子的引物設計和 PCR 擴增
根據 GenBank 中 CEA 基因序列以及綠色熒光蛋白真核細胞表達載體（pEGFP）中的皰疹病毒（CMV）啟動子序列設計引物（由武漢 Sigma 公司設計合成），并分別在各上下游引物的 5′端引入 BglⅡ 和 HindⅢ 酶切位點。CEA 啟動子的引物序列：上游 5′-GAATTCCCCGGGACCCTGCTGGG-3′，下游 5′-GCTTGAGTTCCAGGAACGTTTTGGGATCC-3′，產物長度為 386 bp；CMV 啟動子的引物序列：上游 5′-GCGAGATCTAATCAATTACGGGGTCAT-3′，下游：5′-GCGAAGCTTGGATCTGACGGTT- CACTA-3′，引物兩端分別添加酶切位點和保護堿基。CEA 的 PCR 擴增采用 50 μL 體系，以 1 μg DNA 為模板，分別加入 Taq 酶 1.5 U，上下游引物各 50 pmol，脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）10 nmol。具體操作步驟、反應體系和反應條件見試劑盒說明書。CEA 啟動子片段的擴增采用熱啟動法[1]。PCR 產物行 10% 瓊脂糖凝膠電泳，以膠回收試劑盒回收得到 CEA 啟動子片斷，用于重組質粒的構建。
1.6 增強型綠色熒光蛋白（EGFP）標記的 CEA-EPO 重組腺病毒載體和其他載體的構建、純化和滴度測定
用 KpnⅠ 和 XhoⅠ 雙酶切 DNA 片段，插入穿梭質粒中的相同位點，將 EPO-cDNA 插入 pcDNA3.1 質粒的多克隆位點，用 CEA 基因啟動子替代 pcDNA3.1 質粒的 CMV 啟動子，構建成 CEA-EPO 重組質粒。再構建重組腺病毒 pAd-GFP/ CEA-EPO，克隆篩選出陽性重組穿梭質粒 pAdTrack/CEA-EPO。取質粒 pAdEasy-1，小量提取質粒，以 1% 瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定，最終以 PacⅠ 酶切分析（用 CEA-EPO 基因啟動子中的 SmaⅠ 單一酶切位點進行初步酶切鑒定）和 PCR 擴增 CEA-EPO 片段鑒定重組腺病毒質粒。取 800 μL 重組質粒送武漢中山生物技術有限公司測序，并在熒光顯微鏡下觀察或根據細胞病變效應判斷病毒的產生。確認構建正確后大量擴增病毒，并經 CsCl 超速離心純化。純化病毒顆粒用 PBS 溶液稀釋后在–80 ℃ 條件下凍存備用，病毒滴度根據空斑形成實驗測定。由此包裝、生產出攜帶 CEA、EPO 和 GFP 基因的重組腺病毒。各部分操作均按試劑盒說明書進行。所構建的 4 類重組腺病毒的病毒滴度結果：CEA 為 4.5×1012 puf，EPO 為 3.4×1012 puf、CEA-EPO 為 4.8×1012 puf，GFP 基因為 4.1×1012 puf。
1.7 造血干細胞體外轉染 CEA 及 EPO 基因
通過比較不同轉染復數（multiplicity of infection，MOI）轉染后的病毒轉染效率，確定最佳 MOI。其中，CEA 重組腺病毒的最佳 MOI 為 75，EPO 重組腺病毒的最佳 MOI 為 110，空載體的最佳 MOI 為 100，CEP-EPO 的最佳 MOI 為 120。之后再根據處理方法的不同，將造血干細胞分為 4 組，分別為空載體組（轉染 GFP）、CEA 組（轉染 CEA 重組腺病毒載體）、EPO 組（轉染 EPO 重組腺病毒載體）及 CEA-EPO 組（轉染 CEA-EPO 重組腺病毒載體），每組對應 10 個復孔。取第 3 代造血干細胞，以 5×104個/cm2的密度接種于 10 孔板中，待細胞達 90% 貼壁時，根據分組進行相應處理（以最佳 MOI 轉染），分別加入 3 mL 重組腺病毒載體。轉染操作根據試劑盒說明書進行。于 37 ℃、5% CO2 培養箱中培養 24 h 后更換新鮮培養液。培養 30 min 后檢測 4 組細胞中 CEA mRNA、EPO mRNA 及其蛋白的表達。
1.8 檢測 CEA 及 EPO 基因的表達
4 組轉染細胞的 CEA mRNA 和 EPO mRNA 的表達水平采用半定量 RT-PCR 法測定：分別取 4 組的造血干細胞，提取細胞總 RNA 后，用 RT-PCR 方法檢測 CEA mRNA 及 EPO mRNA 的表達水平。RT-PCR 操作及定量按試劑盒說明書進行。
1.9 病毒轉染效率檢測
上述 4 組細胞培養 7 d 后于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。培養 10 d 后用 0.25% 胰蛋白酶消化，吹打形成單個細胞，PBS 液清洗 5 min 后棄上清，再用 PBS 液重新清洗 2 次，于熒光顯微鏡下觀察。成功轉染細胞呈綠色。取 4 組細胞于 200 倍鏡下隨機取 3 個視野，計數熒光表達細胞數，并計算轉染效率。轉染效率（%）=熒光表達細胞數/同視野下細胞總數×100%。
1.10 嵌合體模型的建立
嵌合體模型的建立方法：通過放射照射除去混存紅細胞，獲得的骨髓嵌合體小鼠可以有效地富集表達 CEA-EPO 的紅細胞。40 只 BALB/C 小鼠嵌合體模型的構建：小鼠于術前 5 d 開始飲含紅霉素（250 mg/L）和慶大霉素（320 mg/L）的抗生素溶液，再接受 8 Gy（照射率為 0.5 Gy/min）全身照射（TBI），TBI 后 4 h 內經尾靜脈（按分組）輸入 BALB/C 小鼠骨髓細胞（2×108個/只），注入骨髓細胞后 48 h 后經腹腔注射環磷酰胺（50 mg/kg）。分別于骨髓移植后 15、20 和 30 d 抽取外周血，用流式細胞儀測定嵌合率，以證實小鼠源性骨髓干細胞已在體內植活（本實驗 40 只小鼠均構建成功），排除了自身紅細胞免疫功能的影響。
1.11 從嵌合體模型獲得 CEA 及 EPO 基因共轉染紅細胞疫苗
將 BALB/C 小鼠嵌合體模型分為 4 組：空載體組注射空載 GFP 干細胞，CEA 組注射 CEA 干細胞，EPO 組注射 EPO 干細胞，CEA-EPO 組注射 CEA-EPO 干細胞，每組 10 只小鼠。在其尾靜脈注射干細胞（干細胞類型同分組一致）2 mL 飼養 2 周后，處死小鼠，從小鼠外周靜脈和脾臟收集外周血，再用表達 CEA 及 EPO 抗體的免疫磁珠分離4 組類型的紅細胞疫苗，即可大量獲得共轉染 CEA-EPO 基因的紅細胞疫苗和其他類型疫苗。
1.12 應用細胞紅系相關標志抗體 GPA 和 CD71 標記，并經流式細胞儀證實紅細胞疫苗培養成功
收集獲得共轉染 CEA-EPO 基因的紅細胞疫苗和其他類型疫苗，用胰酶消化制成單細胞懸液，取 3×106 個細胞，用 yogaPBS 液洗滌 1 遍，置于 1.5 mL 的 EP 管中，分別加入小鼠抗人 GPA-PE 和 CD71-FITC 抗體，上流式細胞儀檢測所有細胞中各表面標志物陽性細胞的比例。
1.13 轉染紅細胞疫苗的體外實驗
體外實驗包括基因共轉染 CEA-EPO 紅細胞疫苗對小鼠單核細胞增殖的影響實驗及增殖細胞對結腸癌細胞的殺傷作用實驗。將 BALB/C 小鼠分為 4 組（每組 10 只）皮下接種 BALB/C 小鼠結腸癌細胞系 CT26 后 2 周，自小鼠尾靜脈采血 2 mL，采用密度梯度法分離單個核細胞，單核細胞與 CT26 腫瘤細胞按 1∶10、1∶20、20∶1 及 40∶1 的比例（每類比例設 12 個復孔）于 20 孔板上混合培養（每孔 4×104個單核細胞），設植物血凝素（PHA）作為對照，48 h 后以 MTT 法檢測單核細胞殺傷率。靶細胞殺傷率=（靶細胞 A 值+單核細胞 A 值–殺傷實驗A 值–本底A 值）/（靶細胞 A 值–本底 A 值）×100%，其中A 值為吸光度值。
1.14 研究基因共轉染紅細胞疫苗對腫瘤成瘤性的影響和成瘤實驗
收集處于對數生長期的結腸癌細胞株 CT26，以每只小鼠 5×105個細胞接種于 40 只 BALB/C 小鼠右側腋窩皮下，制作荷瘤動物模型。將制備成功的 40 只荷瘤動物模型分成 4 組（按上述分組方法），每組 10 只。分別從尾靜脈注射疫苗或空白載體，2 周后，觀察腫瘤的生長情況及小鼠的生存時間（正常飼養，記錄小鼠腫瘤體積、死亡原因以及時間），時長 30 d 以上。每周 2 次用游標卡尺測量腫瘤直徑，腫瘤體積以公式 1/2ab2計算，其中 a 為腫瘤長徑，b 為腫瘤短徑，長度單位為 cm。
圖1
示空載體組、CEA 組及 EPO 組中 CEA mRNA（a）和 EPO mRNA（b）的電泳結果
a：M 代表 marker，泳道 1 和 2 代表 EPO 組，泳道 3 代表 CEA 組，泳道 4 代表空載體組；b：M 代表 marker，泳道 1 和 2 代表 CEA 組，泳道 3 代表 EPO 組，泳道 4 代表空載體組
1.15 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件進行分析。計量資料采用成組 t 檢驗或方差分析（兩兩比較采用 SNK 法），計數資料采用成組 χ2 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 造血干細胞的磁珠純化和收集結果
分選前的標本、對照管、分選后的陰性管標本及分選后的陽性管標本上流式細胞儀檢測細胞純度，其結果顯示：分選前的標本和對照管標本純化前后的 CD117 陽性細胞純度比較差異均無統計學意義（P>0.05），分選后的陰性管標本純化前后的 CD117 陽性細胞純度均為 0，而分選后的陽性管標本純化后的 CD117 陽性細胞純度較純化前升高，差異有統計學意義（P<0.01），見表 1。結果提示免疫磁珠純化 CD117 陽性細胞成功。
表1
免疫磁珠純化前后 CD117 陽性細胞的純度值（%，
，n=10）
2.2 CEA mRNA 和 EPO mRNA 的表達結果
EPO 基因片段大小為 598 bp，CEA 啟動子為419 bp。RT-PCR 結果顯示（圖 1），在 598 bp 和419 bp 處擴增獲得特異性目的片段，表明轉染 CEA 及 EPO 基因成功。
圖2
示 CEA 組、EPO 組及 CEA-EPO 組細胞的轉染效果（倒置相差顯微鏡 ×200）
a：CEA 組可見綠色熒光表達；b：EPO 組可見紅色熒光表達；c：CEA-EPO 組同時可見紅色和綠色熒光
2.3 病毒轉染效率
轉染后培養 7 d，于倒置相差顯微鏡下觀察干細胞，結果顯示：CEA 組可見綠色熒光表達，EPO 組可見紅色熒光表達，CEA-EPO 組同時可見紅色和綠色熒光（圖 2），提示重組腺病毒成功轉染細胞。轉染后 4 d 在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光，對表達 GFP 的細胞計數，觀察轉染效率。每孔細胞隨機選擇 3 個 200 倍視野，按有無綠色熒光陽性細胞計數，計算綠色熒光陽性細胞百分率，每個 MOI 值的轉染效率為 3 個視野的均值。
圖3
4 組細胞中 GPA 和 CD71 陽性細胞表達率的流式細胞儀檢測結果
2.4 嵌合體模型的建立
4 組小鼠骨髓移植后 15、20 和 30 d 的嵌合率結果見表 2。由表 2 可見，骨髓移植后 15 d 時，4 組的嵌合率最高，高于同組內 20 d 和 30 d 時的嵌合率（P<0.05），且同組內30 d 的嵌合率高于 20 d（P<0.05）；各時點空載體組、CEA 組、EPO 組和 CEA-EPO 組之間的嵌合率比較差異均沒有統計學意義（P>0.05）。
表2
骨髓移植后嵌合體模型各時點的嵌合率（%，
，n=10）
2.5 CEA-EPO 基因轉染紅細胞疫苗的獲得
流式細胞儀檢測結果顯示：CEA-EPO 組細胞可以有效地向紅細胞定向轉化，見表 3 和圖 3。
表3
4 組小鼠紅細胞疫苗的 GPA 和 CD71 陽性率（%，
，n=10）
圖4
示制備的荷瘤動物模型，黑箭指示腫瘤
2.6 基因共轉染紅細胞疫苗的體外實驗
CEA-EPO 基因共轉染紅細胞疫苗激活的單核細胞對 CT26 細胞的殺傷效果見表 4。由表 4 可見，1∶10、1∶20 及 20∶1 比例下空載體組、CEA 組、EPO 組和 CEA-EPO 組的殺傷率比較差異均無統計學意義（P>0.05）；在比例為 40∶1 時時，CEA-EPO 組的殺傷率最高（P<0.05），但其余 3 組比較差異無統計學意義（P>0.05），提示疫苗刺激增殖后的單核細胞對結腸癌細胞的殺傷具有明顯特異性。
表4
疫苗激活的單核細胞對 CT26 細胞的殺傷作用（%，
，n=12）
2.7 CEA-EPO 轉染紅細胞疫苗的體內實驗
本研究的成瘤動物模型見圖 4。CEA-EPO 轉染紅細胞疫苗的體內實驗結果表明：處理前 2 周4 組小鼠的腫瘤體積比較差異無統計學意義（P>0.05），但處理后 2 周 CEA-EPO 組的腫瘤體積及死亡率小于或低于另 3 組（P<0.05），且生存時間長于另 3 組（P<0.05）；空載體組、CEA 組及 EPO 組處理后 2 周的腫瘤體積、生存時間和死亡率比較差異均無統計學意義（P>0.05），見表 5。小鼠死亡均系腫瘤轉移引起的消化、循環和呼吸功能衰竭所致。
表5
轉染紅細胞疫苗對腫瘤成瘤性的影響（
，n=10）
3 討論
采用非基因修飾方法制備的攜帶腫瘤抗原的紅細胞作為免疫疫苗治療腫瘤的研究在國外已有報道，攜帶抗原的紅細胞可以誘導機體產生免疫反應的現象早已在醫學界引起關注[3-5]。紅細胞源于骨髓多能造血干細胞，紅細胞輸注是目前治療貧血的常用手段。已進入臨床試驗階段的腫瘤疫苗主要有樹突狀細胞疫苗、DNA 腫瘤抗原疫苗、以腫瘤抗原蛋白或肽為基礎的疫苗、自體或異體的腫瘤細胞疫苗和病毒攜帶腫瘤抗原疫苗，但目前還沒有哪一種疫苗對治療結腸癌有明顯的療效[6-8]，結腸癌的免疫治療依然有待于我們去研究，而紅細胞疫苗在治療結腸癌方面有重要的前景。
研究[9]表明，與供體紅細胞結合的抗原可以通過交叉激活進入受體抗原遞呈細胞的主要組織相容性抗原（MHC-Ⅰ）通路，從而導致受體 CD8+T 細胞對供體抗原特異性地激活和增殖。此外，抗原與細胞結合可以使其通過 MHC-Ⅰ 交叉激活 CD8+T 細胞的效率增加，證明了采用攜帶抗原的紅細胞作為腫瘤疫苗的可行性[10-11]。
EPO 是一種小分子糖蛋白感應激素，參與調節許多細胞的生長發育過程，能促進血管再生、神經發育等。EPO 是促進紅系祖細胞增殖、分化和紅細胞成熟的主要刺激因子，它能促進造血干細胞向原始紅細胞分化，加速幼紅細胞的分裂和增殖，促進血紅蛋白的合成。而紅細胞疫苗能抑制淋巴細胞增生，促進靜止和效應性 T 細胞、NK 細胞和成熟樹突狀細胞的抗腫瘤免疫作用。本實驗結果表明：攜帶腫瘤抗原的紅細胞可以通過 EPO 基因修飾胚胎干細胞、誘導多能干細胞或造血干細胞的增殖和分化[12-14]。
CEA 是最早被發現和鑒定的腫瘤相關抗原之一，1965 年 Gold 和 Freedman 首先于人結腸癌組織中發現 CEA，其是胚胎性致癌抗原，主要存在于消化道腫瘤中，正常成人血清中的 CEA 含量極低。血清 CEA 在結直腸癌的診斷、預后判斷及復發的評估中發揮重要作用[15-17]。CEA 在正常人體內扮演著非特異性防御因子的角色，對結直腸癌的療效判斷、病情發展、監測和預后估計是一類較好的腫瘤標志物。由于 CEA 的免疫原性很弱，一般不能引起機體產生有效的免疫反應，因此機體的免疫系統無法識別腫瘤細胞表面的 CEA，產生免疫耐受，使腫瘤細胞逃避了免疫系統的殺傷。因此，增強 CEA 的免疫原性，誘導機體產生特異性的免疫反應是腫瘤治療的一個新靶點[18]。
結腸癌中 CEA 的表達量遠高于端粒酶，且在相應的正常組織細胞中沒有表達，說明該基因啟動子的應用有可能提高腫瘤細胞內目的基因的表達水平，從而起到特異和高效的治療作用。本實驗成功擴增了 1 kb 大小的 CEA 啟動子片斷，構建了 CEA 啟動子真核表達載體，所構建的 CEA 啟動子有較強的啟動活性，具體做法是：將 EPO-cDNA 插入 pcDNA3.1 質粒的多克隆位點，用 CEA 基因啟動子替代 pcDNA3.1 質粒的 CMV 啟動子，構建成 CEA-EPO 重組質粒；此外，將 CEA 啟動子連接到 EPO-cDNA 上游，構建表達載體。本實驗將 CEA-EPO 基因導入造血干細胞后，利用 RT-PCR 檢測 CEA mRNA 和 EPO mRNA 的表達，結果說明 CEA-EPO 重組腺病毒載體的轉染成功。
此外，本研究發現：攜帶 CEA-EPO 基因的造血干細胞可以定向分化成紅細胞疫苗，是臨床治療腫瘤的理想疫苗。
骨髓細胞中造血干細胞含量少是分離純化的困難之一，造血干細胞約占骨髓有核細胞的 0.5%[19]，而在外周血中的含量更低[20-26]。本實驗結果表明：免疫磁珠分離法、造血干細胞表面特異的抗原標記法及磁珠分離法技術簡單、易行，對細胞活力的影響小，且獲得造血干細胞的純度高。
本實驗收集了造血干細胞，并且定向轉化成轉染了 CEA-EPO 基因的紅細胞疫苗，其流式細胞儀分析結果表明：分選后的陽性管標本純化后 CD117 陽性細胞的純度較純化前升高；RT-PCR 結果顯示，CEA-EPO 組有 EPO mRAN 和 CEA mRAN 表達，表明造血干細胞體外轉染 CEA-EPO 基因成功；應用細胞紅系相關標志抗體 GPA 和 CD71 標記后，結果表明，CEA-EPO 組的紅系相關標志 GPA 和 CD71 的表達比例明顯高于其余 3 組；流式細胞儀結果證實紅細胞疫苗培養成功。進一步研究相關疫苗激活的單核細胞對結腸癌細胞系 CT26 細胞的殺傷作用，結果表明：在比例為 40∶1 時，CEA-EPO 組的殺傷力高于空載體組、CEA 組和 EPO 組（P<0.05）；體內試驗的成瘤性實驗結果表明：CEA-EPO 組處理 2 周后的腫瘤體積高于其他 3 組，且 CEA-EPO 組的生存時間也長于其余 3 組，而空載體組、CEA 組及 EPO 組間比較差別無統計學意義，筆者分析，這是由于干細胞未在 EPO 基因的作用下生成的紅細胞疫苗，其免疫功能還不完善所致。
本實驗采用免疫磁珠陽性選擇法分選造血干細胞，從小鼠股骨和脛骨中收集造血干細胞，之后先進行系別細胞去除的陰性分選，磁性標記后去除系別細胞，根據 CD117 的表達對這些細胞做進一步的磁珠陽性分選，從復雜的細胞混合物中分離出很高純度的細胞。
本研究對攜帶 CEA-EPO 的紅細胞的抗腫瘤作用，在小鼠結腸癌模型中進行了研究，這對發展更加有效的新型腫瘤疫苗具有重要的意義。筆者認為，采取基因修飾的方法獲得的攜帶抗原的紅細胞有以下優點：攜帶抗原的紅細胞可通過基因修飾胚胎干細胞、誘導多能干細胞或造血干細胞在體外大量產生；與使用其他方法獲得的攜帶抗原的紅細胞相比，基因修飾表達腫瘤抗原的紅細胞可以同時表達促進交叉激活的共刺激免疫分子，進一步增強免疫反應，使腫瘤疫苗達到更好的效果。本實驗建立的轉 CEA 及 EPO 基因造血干細胞的紅細胞疫苗，有望在結腸癌的治療中發揮重要的作用。
